肝糖原的提取鉴定与定量第七实验室.docx
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肝糖原的提取鉴定与定量第七实验室
肝糖原的提取、鉴定与定量-第七实验室
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称
Folin-酚试剂法测定蛋白质含量
实验日期
实验地点
合作者
指导老师
评分
教师签名
批改日期
格式要求:
正文请统一用:
小四号,宋体,1.5倍行距;数字、英文用TimesNewRoman;标题用:
四号,黑体,加粗。
需强调的地方请用蓝颜色标出。
不得出现多行、多页空白现象。
一、实验目的
1、学习并掌握肝糖原提取和鉴定原理和方法;
2、学习并掌握蒽酮比色测定糖原含量的原理、注意事项和操作方法;
3、学习并掌握刻度吸管和微量加样枪的使用方式;
4、正确掌握使用离心机的方法步骤;
5、熟练运用溶液混匀的各种方法;
6、正确掌握溶液转移的操作;
7、正确掌握使用分光光度计的方法步骤
二、实验原理
实验1肝糖原的提取与鉴定
糖原是生物的主要储能物质之一,主要储存与肝细胞中,采用研磨匀浆等方法可以使肝细胞破碎。
肝细胞破碎,细胞内容物流出。
低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性,破坏肝组织中的酶并且使蛋白质沉淀,糖原则能够稳定地保存在上清液中,从而达到分离糖原与蛋白质等其他成分的目的。
糖原不溶于乙醇但可溶于热水,故可以先用95%乙醇将滤液中糖原沉淀,再溶于热水中。
糖原水溶液呈乳样光泽,遇碘呈红棕色。
这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中,依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。
此外,糖原还可以被酸水解成葡萄糖,利用呈色反应和葡萄糖的还原性,可以判定肝组织中糖原的存在。
糖原水解溶液与班氏试剂混匀沸水浴加热2min后会出现砖红色沉淀。
CuSO4+2NaOH=Na2SO4+Cu(OH)2↓
2Cu(OH)2+C6H12O6=2CuOH+氧化型葡萄糖+H2O
2CuOH=H20+Cu2O↓(红色)
Cu(OH)2====H2O+CuO↓(黑色)
实验2肝糖原定量测定
糖原在浓碱溶液中非常稳定,故可将肝组织先置于浓碱中加热,以破坏其他成分,保留肝糖原。
糖原可以被浓酸水解成葡萄糖,而浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成5-羟甲基呋喃甲醛,该化合物与蒽酮脱水缩合可以生成蓝色的化合物。
该物质在620nm处有最大吸收。
糖含量在10-100μg,溶液颜色的深浅与可溶性糖的含量成正比。
利用该反应原理处理标准葡萄糖溶液,通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。
三、材料与方法:
以流程图示意
1、实验材料
(1)肝糖原的提取与鉴定
样品:
1.50g的鸡肝
试剂:
5%三氯醋酸溶液、95%乙醇、蒸馏水、浓HCl溶液、50%NaOH溶液、碘试剂和班氏试剂
仪器和器材:
离心机、天平、试管、试管架、研钵、玻璃棒、室温-100℃恒温水浴箱、剪刀、镊子、刻度吸管、加样枪和白瓷反应板
(2)肝糖原的定量测定
样品:
0.15g的鸡肝
试剂:
30%KOH溶液、蒸馏水、标准葡萄糖溶液和0.2%蒽酮溶液显色剂
仪器和器材:
室温-100℃恒温水浴箱、比色皿、100ml容量瓶、分光光度计、试管、剪刀、镊子、刻度吸管和微量加样枪
3、实验步骤与方法
(1)肝糖原的提取与鉴定:
沸水浴2min,观察变化
图一:
肝糖原的提取与鉴定实验流程
(2)肝糖原定量测定
图二:
肝糖原定量测定试验流程
取3支试管,按下表操作。
试剂(ml)
空白管
标准管
样品管
蒸馏水
1.0
—
—
标准葡萄糖溶液
—
1.0
—
糖原提取液
—
—
1.0
0.2%蒽酮溶液
2.5
2.5
2.5
表一:
糖原测定试管操作
混匀,沸水浴10分钟,冷却至室温。
在分光光度计620nm波长处,用空白管溶液调零,测定各管溶液的吸光度(A)。
四、结果与讨论:
结果:
实验数据、现象、图谱;
讨论:
以结果为基础的逻辑推论,并得出结论。
1、实验现象
实验一:
肝糖原的提取与鉴定
①所获糖原溶液如下图:
图三:
所获糖原溶液
所获糖原溶液呈乳样光泽。
②将糖原溶液滴到碘试剂中可以勉强看到溶液出现浑浊,砖红色沉淀不明显,说明样品鸡肝中糖原含量少。
图四:
糖原溶液与碘试剂反应
③糖原水解液与班氏试剂混合后溶液变深蓝。
沸水浴加热2min后,产生浑浊,砖红色沉淀不明显,说明样品鸡肝中糖原含量少。
图五:
糖原水解液与班氏试剂混合沸水浴后
实验二:
肝糖原的定量测定
空白管、标准管和样品管混匀呈现如下颜色反应
图六:
加入蒽酮溶液并且水浴过后的空白管、标准管、样品管(由左至右)对比
2、吸光度数据记录:
620nm波长吸收度值记录
测定次数
各管吸光度值A620
空白管
标准管
样品管
1
0
0.672
0.099
2
0
0.671
0.101
3
0
0.672
0.102
各管平均值
0
0.672
0.101
表二:
620nm波长吸收度值记录表
3、结果计算:
根据公式:
肝糖原(g/100g肝组织)=
计算结果得样品肝糖原(g/100g肝组织)=0.56g/100g肝组织
故本次实验结论为:
该鸡肝样品含有肝糖原,且肝糖原含量为0.56g/100g肝组织。
4、结果分析
经查阅资料得:
饱食鸡肝的肝糖原含量为:
2~3g/100g肝组织,而本次实验测得肝糖原=0.56g/100g肝组织,即本次实验测得的肝糖原含量偏低。
5、讨论总结
(1)与碘试剂反应时:
加入糖原的孔穴并没有出现预期的明显红棕色。
究其原因,在取糖原沉淀时,沉淀很少,糖原含量也很少。
而又因为碘试剂本身是黄色的,本来现象就不是很明显,这样一来,几乎看不到反应会产生的红棕色了,说明糖原含量极少。
(2)糖原中葡萄糖的鉴定:
实验结果也没有如预期中的蓝色溶液沸水浴后变为砖红色。
原因还是糖原含量极少,又加过少量酸与碱,浓度更小,现象更不明显,所以观察不到明显的砖红色。
(3)在肝糖原定量测定中,三只试管水浴15min后,标准管颜色最为明显,为绿色,加入的是标准葡萄糖溶液,样品管与空白管颜色依次递减。
(4)由资料可知饱食鸡肝糖原含量宜在2~3g/100g肝组织,而本次实验测得肝糖原为0.56g/100g肝组织,偏低。
究其原因,实验中操作没有失误,与其他小组和其他实验室对比,发现各小组结果均偏低,可以推测,实验现象不明显原因是鸡肝材料糖原含量偏低。
6、结论:
本次试验为《肝糖原的提取、鉴定与定量》,通过这次实验掌握了组织样品的制备方法,了解了其注意事项;了解了肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项,掌握了其操作方法。
巩固了正确操作使用刻度吸管和移液枪。
掌握了溶液转移的操操作,复习巩固了正确操作分光光度计。
实验中没有错误与过失,结果正常。
呈色反应、颜色观察与定量测定都正确成功。
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- 关 键 词:
- 肝糖 提取 鉴定 定量 第七 实验室
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