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左玉玲论文电子版新
分类号:
S852密级:
UDC:
青岛农业大学
硕士学位论文
马铃薯卷叶病毒重组CP的获得及其
多克隆抗体的制备
ObtainningofRecombinantCPofPotatoLeafrollVirusandPreparationofitsPolyclonalAntibody
研究生姓名:
左玉玲
导师姓名:
郭宝太教授
专业:
生物化学与分子生物学
研究方向:
植物分子生物学与基因工程
中国·青岛
2009年6月
ObtainningofRecombinantCPofPotatoLeafrollVirusandPreparationofitsPolyclonalAntibody
Thesissubmittedto
QingdaoAgriculturalUniversity
InfulfillmentoftheRequirement
FortheDegreeof
MasterofScience
ZuoYuling(CollegeofLifeSciences)
Supervisor:
GuoBaotai
Qingdao,China
June,2009
目录
摘要1
Abstract3
前言1
1 马铃薯病毒及类病毒1
1.1马铃薯X病毒1
1.2 马铃薯Y病毒和马铃薯A病毒2
1.3马铃薯S病毒2
1.4马铃薯卷叶病毒2
1.5 马铃薯纺锤块茎类病毒病3
2 马铃薯抗病毒途径及抗病毒育种4
2.1 马铃薯抗病毒途径4
2.2 马铃薯抗病毒病育种4
3马铃薯卷叶病毒基因工程的研究进展5
3.1复制酶基因介导的抗病性5
3.2CP基因介导的抗病性6
3.3核酶介导的抗病性6
3.4反义RNA介导的抗病性6
4马铃薯病毒检测技术7
4.1生物学方法7
4.2电镜鉴定法7
4.3分子生物学方法8
4.4 免疫学检测方法9
5病毒抗血清的制备12
5.1以病毒粒体为抗原制备抗血清12
5.2以重组CP为抗原制备抗血清12
研究的目的和意义13
材料与方法15
1材料15
2方法15
2.1lacZ基因转化酵母及其表达的诱导15
2.1.1 酿酒酵母感受态的制备15
2.1.2 lacZ基因表达载体对酵母的转化15
2.1.3 lacZ基因表达的诱导与检测16
2.1.4 lacZ基因表达条件的比较16
2.2引物的设计与合成16
2.3PLRV-CP基因酵母表达载体的构建16
2.3.1 PCR扩增17
2.3.2 PCR产物的回收17
2.3.3 目的基因片段与酵母起始表达载体的T-A连接17
2.3.4 大肠杆菌TOP10F′的转化17
2.3.5 阳性克隆的筛选与鉴定18
2.3.6酿酒酵母感受态的制备与转化18
2.3.7 pYES-LPCP对酵母的转化18
2.3.8 pYES-LPCP酵母菌落PCR检测19
2.4PLRV-CP缺失基因酵母表达载体的构建及基因表达的诱导与检测19
2.4.1 PLRV-CP缺失基因酵母表达载体的构建19
2.4.2 PLRV-CP缺失基因重组体的筛选20
2.4.3DNA序列测定20
2.4.4 酵母表达载体的蛋白诱导20
2.4.5 酵母表达载体蛋白提取20
2.4.6SDS-PAGE鉴定20
2.5PLRV缺失突变CP基因的原核表达及重组CP的制备21
2.5.1 基因表达的诱导21
2.5.2 包涵体的提取21
2.5.3重组蛋白的纯化22
2.5.4 蛋白的透析、浓缩与定量22
2.6 重组CP抗血清的制备23
2.6.1重组CP抗血清的制备23
2.6.2抗血清效价的测定23
2.7 抗体的分离与纯化23
2.7.1IgG的分离23
2.7.2IgG的纯化(ProteinG亲和层析柱)24
2.7.3抗体的间接ELISA检测24
2.8 抗体的酶标24
2.8.1IgG的碱性磷酸酶标记24
2.8.2ELISA直接法测酶标抗体活性。
25
2.9 PLRV的DAS-ELISA检测25
结果与分析26
1lacZ基因对酵母的转化及其表达的诱导与检测26
2PLRV-CP基因酵母表达载体的构建及其表达诱导27
3PLRV缺失突变CP基因酵母表达载体的构建及其表达的诱导31
4 PLRV缺失突变CP基因的原核表达及重组CP的制备33
5抗血清的制备及IgG的分离、纯化与标记35
6PLRV的DAS-ELISA检测36
讨论38
结论42
参考文献43
缩略语表48
附录49
致谢52
Contents
Abstract1
Englishabstract3
Preface1
1 Potatovirusdiseaseandviroid1
1.1PotatovirusX1
1.2PotatovirusYandPotatovirusA2
1.3PotatovirusS2
1.4Potatoleafrollvirus2
1.5 Potatospindletuberviroid3
2 AntivirusapproachandAntivirusbreedinginpotato4
2.1 Antivirusapproachinpotato4
2.2 Antivirusbreedinginpotato4
3ProgressintheresearchofpotatoresistancetoPotatoleafrollvirus5
3.1Replicasegenemediatedresistanceagainst5
3.2CPgenemediatedresistanceagainst6
3.3Ribozymegenemediatedresistanceagainst6
3.4AntisenseRNAgenemediatedresistanceagainst6
4 Detectiontechniqueofpotatovirus7
4.1 Biologymethod7
4.2 Electronmicroscopymethod7
4.3Molecularbiologymethod8
4.4 Immunologymethod9
5Preparationofvirusantiserum12
5.1 Bodytovirusparticleantiserumforantigenpreparation12
5.2Antiserumpreparationofreorganizationprotein12
Objectiveandsignificance13
Materialandmethod15
1Material15
2method15
2.1transformation,InductionandexpressionoflacZgene15
2.1.1 Saccharomycescerevisiae15
2.1.2 SaccharomycescerevisiaetransformationoflacZgene15
2.1.3 InductionandexpressionoflacZgene16
2.1.4 conditioncomparisonandexpressionoflacZgene16
2.2 Primerdesignandsynthesize16
2.3 ConstructionoftheexpressionvectorofPLRV-CPgene16
2.3.1 PCRreaction17
2.3.2 PCRproductrecovery17
2.3.3 ThelinkingofPCRproductwithclonevector17
2.3.4 RecombinantplasmidtransformedintoE.coli17
2.3.5Screeningandidentificationofpositiveclone18
2.3.6PreparationofcompetentSaccharomycescerevisiae18
2.3.7 SaccharomycescerevisiaetransformationofpYES-LPCPgene18
2.3.8 YeastColonyPCRofpYES-LPCP19
2.4ConstructionoftheexpressionvectorofdeletionmutantsofPLRV-CP,Inductionandexpression19
2.4.1 ConstructionoftheexpressionvectorofdeletionmutantsofPLRV-CP19
2.4.2 ScreeningofdeletionmutantsofPLRV-CP20
2.4.3DNAsequencing20
2.4.4 InductionofproteinofcompetentSaccharomycescerevisiae20
2.4.5 Isolationofprotein20
2.4.6 SDS-PAGEdetermination20
2.5 TheprokaryoticexpressionfordeletionmutantsofPLRV-CPandthepreparationofreorganizationprotein21
2.5.1 Inductionofgeneexpression21
2.5.2 Isolationofinclusionbodies21
2.5.3 Purificationofreorganizationprotein22
2.5.4 Dialysis,concentrationanddetectionofprotein22
2.6 Preparationanddeterminationofantiserum23
2.6.1 Preparationofantiserum23
2.6.2 determinationofantiserum23
2.7 PurificationandSepaeationofantibody23
2.7.1 SepaeationofIgG23
2.7.2 PurificationofIgG24
2.7.3 ID-ELISAdetectionofantibody24
2.8 Enzymelabeledofantibody24
2.8.1 AlkalinephosphataselabeledofIgG24
2.8.2 ActiivitionDetectionofdirectELISA25
2.9 DAS-ELISAdetectionofPLRV25
Resultsandanalysis26
1 yeasttransformationandexpressioninductionandexaminationoflacZgene26
2 ConstructionoftheexpressionvectorandInductionofPYES-PLRV–cpgene27
3 constructionoftheexpressionvectorandInductionofPYES-PLRV–cpdeletiongene31
4 ConstructionoftheprokaryoticexpressionvectorandInductionofPLRV-CPdeletiongene33
5PreparationofantiserumSepaeation,PurificationandlabeledofIgG35
6DAS-ELISAdetectionofPLRV36
Discussion38
Conclusion42
Reference43
Abbreviate48
Appendix49
Acknowledgement52
马铃薯卷叶病毒重组CP的获得及其
多克隆抗体的制备
摘要
本研究的目的是先进行马铃薯卷叶病毒(PLRV)外壳蛋白(CP)基因酵母与原核表达效果的比较,获得大量重组CP,然后以重组CP为抗原制备特异性抗血清、获得多克隆抗体与酶标记抗体,为进行PLRV的DAS-ELISA检测试剂盒的制备奠定基础。
主要研究结果如下:
1、以lacZ为标记基因、INVSc1为受体菌研究了酿酒酵母表达系统的有效性。
用LIAc法获得了转化子,于30℃经2%半乳糖诱导16h~32h实现了lacZ的高水平表达。
用酸洗玻璃珠法提取酵母蛋白,以X-gal为底物可方便地检测lacZ表达产物的活性,经改进在酶标板反应孔中可对多个样品的β-半乳糖苷酶活性进行快速检测。
2、构建了PLRV-CP基因与PLRV缺失突变CP基因的酿酒酵母表达载体,并进行了基因表达的诱导。
以pYES2.1/V5-His/-TOPO为起始载体,构建了PLRV-CP基因(624bp)的酵母表达载体pYES-LRCP,工程菌株INVSc1(pYES-LRCP)经半乳糖诱导后,SDS-PAGE图谱上没有预期的表达蛋白。
用PLRV缺失突变CP基因(498bp)的PCR产物与pYES2.1/V5-His/-TOPO连接构建了突变基因的酵母表达载体pYES-LRCP-126,DNA测序结果确认了表达载体的正确性。
在30℃,工程菌株INVSc1(pYES-LRCP-126)经2%半乳糖诱导培养16h,SDS-PAGE显示蛋白图谱上有一条23kDa的特异性蛋白条带,其大小与预期的重组CP相符。
该表达蛋白呈水溶状态,但表达量较低。
3、通过原核表达获得了大量PLRV的重组CP。
用本课题组构建的PLRV缺失突变CP基因的原核表达载体pBAD-LRCP-126转化受体大肠杆菌TOP10,工程菌株TOP10(pBAD-LRCP-126)经0.2%阿拉伯糖诱导获得了基因的高效表达,提取菌体总蛋白后经镍离子亲和层析获得了大量高纯度的PLRV重组CP。
4、制备了PLRV重组CP的特异性抗血清。
用纯化的重组CP作抗原免疫家兔获得了抗血清,间接ELISA定显示效价可达1:
12800。
5、获得了重组CP的多克隆抗体(IgG)与酶标记抗体(IgG-AP)。
先用饱和(NH4)2SO4
进行盐析,然后用ProteinG亲和层析柱纯化,获得了高纯度的抗体(IgG)。
用戊二醛一步法对纯化的抗体进行标记,获得了IgG的碱性磷酸酶标记物(IgG-AP)。
6、进行了PLRV的DAS-ELISA检测。
用制备的IgG与酶标抗体(IgG-AP)对感染PLRV的叶片进行检测,反应呈阳性,健康的叶片则呈阴性,结果表明获得了PLRV的特异性多克隆抗体与酶标记抗体。
本研究为通过基因工程途径大量制备PLRV重组CP,获得抗体、酶标抗体及组装DAS-ELISA试剂盒奠定了基础。
关键词:
马铃薯卷叶病毒;CP基因;重组CP;多克隆抗体;酶标抗体;DAS-ELISA
ObtainningofRecombinantCPofPotatoLeafrollVirusandPreparationofitsPolyclonalAntibody
Abstract
Thisresearchisfirstlytocomparetheexpressionefficiencyofcoatprotein(CP)geneofpotatoleafrollvirus(PLRV)inyeastandE.coli,andobtainlargequantityofrecombinantCP,thenprepareantiserumagainsttherecombinantCP,obtainspecificpolyclonalantibody(IgG)andalkalinephosphatase-conjugatedIgGfortheDAS-ELISAdetectionofPLRV.Themainresultsaresummarizedasfollows:
1.ExpressionsystemofSaccharomycescerevisiaewasestablishedusinglacZasmarkergeneandINVSclasreceptorstrain.TransformantsofINVSclwereproducedbyLiClmethodandlacZgenewasinducedtoexpresseffectivelywith2%galactosefor16~32hoursat30℃.Yeastproteinwasextractedbyglassbeansmethodandtheactivityofβ-galactosidasecouldbedetectedinthepresenceofX-gal.TheenzymeactivitiesofmanysamplescouldbedetectedrapidlybythemodificationofdetectioninELISAplate.
2.YeastexpressionvectorsofPLRV-CPgeneandPLRVdeficiencymutationCPgenewereconstructedandtheexpressionoftargetgenewasinduced.UsingpYES2.1/V5-His/-TOPOastheinitialvector,expressionvectorofPLRV-CPgenenamedpYES-LRCPwasconstructed.TheengineeredstrainINVScl(pYES-LRCP)wasinducedwithgalactose,buttherewasnotheexpectedproteinbandintheSDS-PAGEpattern.SpecificPCRproductofPLRVdeficiencymutationCPgenewasligatedintothepYES2.1/V5-His/-TOPO,anditsyeastexpressionvectornamedpYES-LRCP-126wasconstructed.DNAsequencingconfirmedtheaccuracyoftheexpressionvector.TheengineeredstrainINVScl(pYES-LRCP)wasinducedwith2%galactoseat30℃for16hours,andspecific23kDaproteinbandwasfoundintheSDS-PAGEpattern.Thoughtheexpressedproteinwasdissolvedinwater,theexpressionlevelwaslow.
3.LargequantityofrecombinantCPwasobtainedbytheprokaryoticexpressionofthePLRVdeficiencymutationCPgene.TheE.colistrainTOP10wastransformedwiththepreviouslyconstructedprokaryoticexpressionofthePLRVdeficiencymutationCPgene.Afterinductionof0.2%arabinose,highlevelexpressionofthegenewasrealized.RecombinantCPwithhighpuritywasobtainedbypurificationofmetalaffinitychromatography.
4.AntiserumwaspreparedusingtherecombinantCPasantigen.RabbitswereimmunedwiththepurifiedrecombinantCP,andthetiteroftheantiserumwasdetectedbyindirectELISA.Thetiterofoneantiserumwas1:
12800.
5.Polyclonalantibody(IgG)andalkalinephosphatase-conjugatedIgGofrecombinantCPwereobtained.Antibody(IgG)wasprecipitatedfromantiserumbythetreatmentofsaturated(NH4)2SO4,thencrudeIgGwaspurifiedwithproteinGaffinitychromatographycolumn.HighpurityIgGwaslabelledwithalkalinephosphatasebyone-stepmethodofglutaraldehyde,andenzyme-conjugatedIgG(IgG-AP)wasobtained.
6.PotatoleafrollviruswasdetectedbyDAS-ELISA.WhenPLRV-infectedpotatoleafwasdetectedbyDAS-ELISAprocedureusingt
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