自噬诱导的MACF1表达促进胶质母细胞瘤EMT的分子机制研究纵向协同项目申请书.docx

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自噬诱导的MACF1表达促进胶质母细胞瘤EMT的分子机制研究纵向协同项目申请书

顺序号

项目类别

纵向协同

省自然科学基金

纵向协同

项目

博士科研启动

申请书

项目名称：

自噬诱导的MACF1表达促进胶质母细胞瘤EMT的分子机制研究

申请人姓名：

依托单位：

医科大学

邮政编码：

通讯地址：

申请人电话：

单位联系人：

单位电话：

申请日期：

2016年11月11日

一、简表

研

究

项

目情况

名称

自噬诱导的MACF1表达促进胶质母细胞瘤EMT的分子机制研究

类别

纵向协同

研究类型

基础研究

申报学科

名称1

肿瘤综合治疗

代码1

名称2

代码2

申请金额

13万元

研究期限

2017.01至2019.12

所用

实验室

实验室全称

实验室类别

其他

申

请

者

情况

姓名

性别

身份号码

民族

汉族

职称

学位

博士

最终学位授予国

中国

所在单位

全称

医科大学

学院（所）

项

目

组

情况

主

要

成

员（不含

申

请者）

姓名

证件号码

职称

所在单位全称

项目中的分工

医科大学

临床肿瘤标本取材

医科大学

生物信息学分析

医科大学

临床数据收集分析

医科大学

原代细胞培养

医科大学

细胞功能实验

医科大学

蛋白质组学实验

医科大学

分子机制实验

医科大学

组织标本实验

医科大学

动物实验

人员与单位统计

总人数

高级

中级

初级

博士后

博士生

硕士生

参加单位数

10

1

1

5

0

2

1

1

研

究

内

容

和

意

义

摘要

（400字以内）

我们前期研究发现上调自噬流水平或上调MACF1表达均可促进胶质母细胞瘤（GBM）细胞EMT；而且，营养缺乏及替莫唑胺（TMZ）等细胞外环境压力可同时上调肿瘤细胞自噬流水平及MACF1表达。

MACF1在脑、心等多种组织中表达，可介导微管和微丝协同作用以改变细胞骨架，从而使细胞对细胞外环境做出反应，在多种肿瘤细胞中诱导EMT。

GBM在发生发展及治疗过程中局部肿瘤组织往往出现缺血缺氧、营养缺乏及TMZ刺激等多种肿瘤微环境压力，而在经过包括肿瘤切除、放化疗在内的综合治疗后，肿瘤仍复发并向周围组织侵袭是导致GBM预后不良的重要原因之一。

据此，本项目拟建立自噬关键蛋白（如ATG5等）及MACF1稳定过表达或抑制表达的GBM细胞，在细胞、动物、临床标本水平，证实上调自噬流诱导的MACF1表达促进GBM发生EMT这一机制，并阐明该机制的关键分子通路，为GBM的治疗提供新的思路与候选靶点。

主题词

微管微丝交联蛋白1，上皮间质转化，自噬

二、经费申请表

（金额单位：

万元）

科目

申请经费

备注（说明）

科研业务费

2.0

生物信息学分析、蛋白质组学分析

实验材料费

6.0

抗体、试剂、药物及实验耗材、实验动物等

仪器设备费

3.5

WB实验所需设备及小鼠颅内定位系统购置

实验室改装费

0

协作费

0

人员费

1.0

博士生及硕士生劳务费

国际合作与交流经费

0.5

项目组成员参与国内外合作交流

管理费

0

专家咨询费

0

合计

13.0

与本项目相关的其他经费来源

其他计划资助经费

0

单位配套经费

0

其他经费资助

0

其他经费来源合计

0

三、前期研究基础

1.论文收录与被引用情况统计表

论文收录情况

全部论文在近5年内在SCI被引用情况

CSCD

CSTPCD

《SCI光盘版》

《SCI网络版》

《EI》

他人引用次数

单篇被引用最高次数

第一作者论文

2

非第一作者论文

1

通讯作者论文

2.申请人承担国家或省自然科学基金研究项目的经历（重点项目必填此项）

立项年份

项目名称

立项部门

项目负责人

项目研究情况简介

3.申报内容曾获国家或省自然科学基金项目资助的经历（重点项目必填此项）

立项年份

项目名称

立项部门

项目负责人

是否结题

项目研究情况简介

四、将提供的研究成果及形式

论文及专著情况

专利情况

国家统计源刊物以上刊物发表论文

（篇）

专著（册）

3

0

专利情况

（项）

发明专利

实用新型专利

外观设计专利

国外专利

申请

授权

申请

授权

申请

授权

申请

授权

其他（重大基础研究培育项目须注明何时将获取何种国家重大基础研究项目后续资助）

五、附件清单

序号

附件类型

附件名称

1

学位证书

博士学位证书

2

已发表论文1（一作）

Expressionofdynein,cytoplasmic2,heavychain1（DHC2）associatedwithglioblastomacellresistancetotemozolomide.

3

已发表论文2（并列一作）

MIR517Cinhibitsautophagyandtheepithelial-to-mesenchymal（-like）transitionphenotypeinhumanglioblastomathroughKPNA2-dependentdisruptionof

TP53nucleartranslocation.

4

2016年国自然青年项目申报书

《自噬诱导的MACF1表达促进胶质母细胞瘤EMT的分子机制研究》

报告正文

（一）立项依据与研究内容：

1．项目的立项依据（附主要参考文献目录）；

胶质瘤是中枢神经系统（centralnervoussystem，CNS）常见的颅内原发恶性肿瘤，占所有原发性中枢神经系统肿瘤的32%，5年病死率在全身肿瘤中仅次于胰腺癌和肺癌居第3位。

我国每年新发胶质瘤患者约10万以上，占据中枢神经系统肿瘤中的第一位，而且半数以上为恶性程度最高（WHOⅣ级）的多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）1，其具有很高的致残和致死率，严重威胁人类健康。

目前针对GBM的主要治疗手段包括最大程度的手术切除及术后进行以替莫唑胺（temozolomide，TMZ）为一线化疗药物的放化疗相结合的标准STUPP辅助治疗方案2,3。

但即使采用了最积极的综合治疗手段，GBM患者的中位无进展生存期（progression-freesurvival，PFS）仅为6.9个月，中位总体生存期（overallsurvival，OS）为14.6个月2。

GBM在经过包括手术及放化疗在内的综合治疗后仍然复发并向周围组织侵袭是导致患者预后不良的重要原因之一。

因此深入研究GBM的发生发展机制及经历各种治疗后的演变机制，将为其术后辅助治疗提示新靶点、提供新思路，有助于改善患者预后，具有重要社会效益。

GBM在发生发展过程中出现的局部肿瘤组织缺血缺氧及肿瘤治疗过程中的TMZ刺激等不良肿瘤微环境均可刺激肿瘤细胞，导致自噬流水平上调。

自噬（autophagy）是指细胞依赖溶酶体途径对胞质蛋白和细胞器等细胞内容物进行降解的一种过程，在进化上具有高度保守性，广泛存在于从酵母、线虫、果蝇到高等脊椎动物的细胞中4。

根据细胞内底物进入溶酶体腔的方式不同，细胞自噬可分为大自噬（macroautophagy）、小自噬（microautophagy）和分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediatedautophagy,CMA）三种方式5。

通常所指的自噬如无特殊说明均是指大自噬，本文同。

自噬的作用主要是清除降解细胞内受损伤的细胞结构、衰老的细胞器、以及不再需要的生物大分子等，同时也为细胞内细胞器的构建提供原料，即参与细胞结构的再循环4。

在自噬过程中，双层膜结构的囊泡将自噬底物包裹后形成自噬体（autophagosome），自噬体随后与溶酶体（lysosome）融合形成自噬溶酶体（autolysosome），自噬底物即被降解并可重新利用6。

在某些条件下，自噬是细胞对不良环境刺激的一种适应性反应，能够维持细胞存活；而在另外一些条件下，过强的自噬则可能导致细胞死亡并诱导疾病发生6。

自噬具有促进和抑制肿瘤发生发展的双重作用7,8。

一方面，自噬是肿瘤细胞应对缺氧、营养缺乏、放化疗刺激等环境压力以维持细胞存活的重要机制，自噬可通过为环境压力条件下的细胞补充ATP及降解凋亡诱导分子等多种方式维持细胞存活9,10，通过干扰自噬相关基因的表达而抑制自噬水平后，同样环境压力下的肿瘤细胞死亡明显增加11；另一方面，近期多项研究结果表明在许多情况下自噬发挥着抑制肿瘤发生发展的作用12,13，Qu等通过改造自噬关键调节蛋白Beclin1基因型而建立的自噬缺陷小鼠模型（Beclin1+/-）被证实易于发生肿瘤14，而过表达Beclin1则抑制肿瘤发生15，此外自噬也可抑制由坏死及慢性炎症诱导的肿瘤发生。

因此，通过上调自噬流水平抑制肿瘤发生或通过下调自噬流水平促进肿瘤细胞凋亡均可作为通过调节自噬来抑制肿瘤发生发展的方法11。

我们在前期实验中发现：

⑴饥饿培养（包括使用无血清及低糖2种全培）可上调GBM细胞系U87、U251细胞系自噬流及自噬水平，与文献报道相符9,10；⑵GBM一线化疗药物TMZ可上调U87的自噬流及自噬水平16（图1）。

图1.TMZ可诱导GBM细胞系U87细胞自噬流水平上调，这一过程受自噬抑制剂负向调控。

A.TMZ作用于U87细胞后，LC3B-Ⅱ（反映自噬流的关键标志蛋白）表达水平随TMZ浓度增加而增加。

B.TMZ诱导的LC3B-Ⅱ表达水平上调受到3MA（早期自噬抑制剂）和CQ（晚期自噬抑制剂）的抑制。

C.免疫荧光显示TMZ诱导U87细胞内自噬流增强（红色荧光标记LC3B-Ⅱ,可示踪自噬囊泡），这一过程受到3MA和CQ抑制。

D.透射电镜显示TMZ诱导U87细胞内自噬流增强，自噬体（反映早期自噬）及自噬溶酶体（反映晚期自噬）的数量均增加。

（P＜0.05，P＜0.01）

上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT），是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。

EMT在胚胎发育、慢性炎症、组织重建、癌症转移和多种纤维化疾病中发挥了重要作用17,18。

其主要的特征有细胞黏附分子（如E-钙黏蛋白）表达的减少、以细胞角蛋白为主的细胞骨架转化为以波形蛋白（vimentin）为主的细胞骨架及形态上具有间充质细胞的特征等19。

通过EMT，上皮细胞失去了细胞极性，失去与基底膜的连接等上皮表型，获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型。

EMT分为3种类型：

组织发育（Ⅰ型）、纤维化20及创伤修复（Ⅱ型）以及肿瘤发生发展（Ⅲ型）21。

EMT是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程。

近期许多研究证实EMT在肿瘤的药物抵抗中发挥重要作用：

卵巢癌上皮细胞获得EMT相关分子标记后对紫杉醇的药物抵抗显著增强；SNAIL作为EMT的关键分子标记之一可通过抑制P53介导的细胞凋亡来增强细胞的放化疗抵抗22。

关于自噬与EMT的相互作用关系，目前国内外尚无统一认识，有大量文献证实在特定细胞中自噬抑制EMT23,24，亦有不少文献持相反观点25,26。

我们在前期实验中发现：

⑴饥饿培养（包括使用不同血清浓度和葡萄糖浓度的全培）与使用经典自噬诱导剂雷帕霉素（rapamycin）均可诱导GBM细胞系U87细胞出现EMT相关的细胞表型变化（图2）；⑵TMZ诱导GBM细胞系U87及U251细胞出现EMT相关的细胞表型变化（图3）；⑶在U87细胞中通过干扰自噬关键蛋白ATG7的表达抑制自噬后，抑制了EMT相关的细胞表型变化及基因表达水平变化16（图4）。

图2.饥饿培养与雷帕霉素均诱导U87细胞出现EMT相关表型变化。

A.降低培养基血清浓度，制造血清饥饿培养条件48小时，U87出现EMT相关的细胞形态变化并迁移能力增强。

B.降低培养基葡萄糖浓度，制造葡萄糖饥饿培养条件48小时，U87出现EMT相关的细胞形态变化并迁移能力增强。

C.使用经典自噬诱导剂rapamycin刺激细胞48小时，U87迁移能力增强。

图3.TMZ诱导GBM细胞系U87细胞出现EMT相关表型变化。

A.TMZ作用于U87细胞2周，细胞出现多条凸起并逐渐延长。

B.TMZ作用于GBM细胞系U251细胞2周，细胞出现多条凸起并逐渐延长。

C.划痕实验证实TMZ增强U87细胞的迁移能力，这一过程可被自噬抑制剂负向调控。

D.Transwell实验证实TMZ增强U87细胞的迁移能力，这一过程可被自噬抑制剂负向调控。

（P＜0.05，P＜0.01，#P＞0.05）

图4.上调自噬流水平诱导GBM细胞系U87细胞出现EMT相关细胞表型变化及EMT相关基因表达水平变化。

A.通过干扰自噬通路关键调节蛋白ATG7的表达下调U87细胞自噬流水平后，细胞凸起变短并减少。

B.同样方法下调U87细胞自噬流水平后，划痕实验证实细胞迁移能力下降。

C.下调细胞自噬流水平后，Transwell实验证实细胞迁移能力下降。

D.下调细胞自噬流水平后，EMT相关上皮标志蛋白表达上调、间质标志蛋白表达下调，提示上调自噬流水平诱导U87细胞出现EMT相关的基因表达水平变化。

（P＜0.05，P＜0.01，#P＞0.05）

微管微丝交连蛋白（microtubule-actincrosslinkingfactor1，MACF1,也称之为ACF7）是一种分子量为60kd的蛋白，可以介导微管和微丝协同作用以改变细胞骨架，从而使细胞对细胞外环境做出反应27,28，是细胞骨架相关的关键蛋白。

目前已经发现MACF1可以表达于包括脑、骨骼肌、皮肤和心脏在内的多种组织中29。

MACF1在Wnt通路中也发挥着十分重要的作用，在Wnt通路未激活时，MACF1和GSK3β,APC,axin,以及β-catenin共同构成复合体；当Wnt通路激活时，β-catenin的入核以及将axin复合体锚定到胞膜的LTP6上这两个过程均需要MACF1的参与30。

在小鼠脑中干扰MACF1的表达将导致神经发育缺陷和围产期死亡31。

在检测细胞迁移能力的划痕实验中，MACF1也有重要的作用，当细胞缺乏MACF1时，迁移中的细胞的微管变弯卷曲，而不是正常的笔直射线状。

当下调MACF1后，划痕愈合时间将延长40~60%27。

乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力很大程度上取决于细胞凸起的形成和延长以及其数量，凸起的形成和延长需要微管在细胞边缘的稳定聚集，而通过ErbB2将MACF1重新募集到胞膜则是实现上述过程的基础。

目前国内外对MACF1的研究主要集中于细胞骨架的稳定性、细胞凸起形成及定向运动、细胞黏附及细胞间连接等方面，相关文献证实MACF1在以上细胞生命过程中发挥极其重要的作用，并探讨了其相关的分子机制：

如MACF1参与Wnt-β-Catenin通路调节细胞运动能力，MACF1参与ErbB-GSK3通路调节细胞的凸起形成及定向运动等32-34。

目前国内外文献关于MACF1与EMT的相互关系有较为一致的观点：

MACF1在多种肿瘤细胞中诱导EMT28,33,34。

我们在前期实验中证实：

⑴饥饿培养可上调U87细胞MACF1的表达水平；⑵TMZ在体外和体内均可上调MACF1的表达水平（图5）；⑶下调U87细胞中的MACF1表达可抑制细胞迁移及侵袭（图6），与上述文献观点相符。

以上前期实验结果提示：

在GBM的发生、发展及TMZ化疗过程中，MACF1可能在促进肿瘤细胞迁移、侵袭等方面发挥重要作用，进而导致GBM复发、侵袭，导致患者预后不佳。

图5.TMZ在体外和体内均能上调MACF1的表达水平。

A.TMZ（200μM）刺激1周后，GBM细胞系U87细胞的MACF1表达水平上调。

B.相对于原发且未进行TMZ化疗的肿瘤，经TMZ化疗后复发的GBM肿瘤组织中MACF1的表达上调。

（P＜0.01）

图6.采用siRNA干扰的方法下调U87细胞MACF1的表达后，细胞的迁移及侵袭能力下降。

A.Westernblot方法证实相对于阴性对照组，siRNA干扰后，U87细胞MACF1表达下调。

B.Transwell方法证实相对于阴性对照组，siRNA-MACF1组U87细胞迁移能力下降。

C.Boyden实验证实相对于阴性对照组，siRNA-MACF1组细胞侵袭能力下降。

（P＜0.01）

目前，我们创新性地将调节细胞骨架的关键蛋白MACF1与自噬、EMT相结合进行研究。

我们在前期实验中证实：

（1）饥饿培养、TMZ均可上调U87细胞的自噬流及自噬水平（图1）；

（2）饥饿培养、TMZ均可诱导U87及U251细胞出现EMT相关细胞表型变化，这一变化可被自噬抑制剂负向调控（图2，3）；（3）上调自噬流水平诱导U87细胞出现EMT相关细胞表型变化及EMT相关基因表达水平变化（图4）；（4）饥饿培养、TMZ均可上调U87细胞的MACF1表达（图5）；（5）MACF1可诱导U87细胞出现EMT相关表型变化（细胞迁移及侵袭能力增强）（图6）。

目前已取得的实验发现可总结简图所下：

分析以上我们前期研究结果，不难发现以下线索：

（1）GBM在发生发展的过程中常常会因为肿瘤生长过快而导致局部肿瘤组织出现一定程度的缺血、缺氧、营养缺乏等现象，而这一现象与肿瘤细胞的体外饥饿培养条件相类似，也可在一定的刺激强度条件下诱导人体内的肿瘤细胞发生自噬；

（2）既然TMZ作为GBM的一线化疗药物在体外实验中可诱导GBM细胞自噬，那么TMZ在人体GBM肿瘤内应该具有相同的作用。

由此可知：

人体内GBM在发生、发展及治疗过程中出现的缺血、缺氧、化疗药物刺激等不利因素均可上调肿瘤细胞自噬流及自噬水平，而我们已证实自噬可促进GBM细胞发生EMT；同时，我们也已证实缺血、缺氧、TMZ均可上调MACF1的表达。

综上所述，我们提出以下假说：

GBM发生、发展过程及治疗过程中的不利刺激可诱导肿瘤细胞自噬流水平上调，自噬流水平上调诱导的MACF1表达上调又可促进GBM发生EMT（自噬→MACF1→EMT），这可能是GBM在经过包括手术及放化疗在内的综合治疗后仍然复发并向周围组织侵袭的重要机制之一。

探明这一机制，将为GBM的综合治疗提示新思路、提供新靶点

参考文献：

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