新版word版蜡样芽孢杆菌的测定作业指导书.docx
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新版word版蜡样芽孢杆菌的测定作业指导书
作业指导书
文件编号:
XZJY071-00-2017
版本号/修订状态:
一/第0次修改
蜡样芽孢杆菌的测定
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实施日期:
2017.01.01
1、编制目的
为规范本单位蜡样芽孢杆菌的检验方法,编制本指导书。
二、适用范围
本指导书规定了食品蜡样芽孢杆菌的检验方法。
本标准第一法适用于蜡样芽孢杆菌含量较高的食品中蜡样芽孢杆菌的计数,第二法适用于蜡样芽孢杆菌含量较低的食品样品中蜡样芽孢杆菌的计数。
三、编制依据
GB4789.14—2014《食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽孢杆菌检验》。
四、设备和材料
4.1冰箱:
2℃一5℃;
4.2恒温培养箱:
30℃±1℃,36℃士1℃;
4.3均质器;
4.4显微镜:
lO倍一100倍(油镜);
4.5电了天平:
感量0.1g;
4.6无菌锥形瓶:
100mL、500mL;
4.7无菌吸管:
1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度);
4.8无菌平皿:
直径90mm;
4.9无菌试管:
18mm×180mm;
4.10L涂布棒。
五、培养基和试剂
5.1磷酸盐缓冲液(PBS)。
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5.2甘露醇卵黄多黏菌素(MYP)琼脂。
5.3胰酪胨大豆多黏菌素肉汤。
5.4营养琼脂。
5.5过氧化氢溶液。
5.6动力培养基。
5.7硝酸盐肉汤。
5.8酪蛋白琼脂。
5.9硫酸锰营养琼脂培养基。
5.100.5%碱性复红。
5.11糖发酵管。
5.12V-P培养基。
5.13胰酪胨大豆养血(TSSB)培养基。
5.14溶菌酶营养肉汤。
5.15西蒙氏柠檬酸盐培养基。
5.16明胶培养基
6、检验程序
6.1蜡样芽孢杆菌平板计数法检验程序见图1。
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图1蜡样芽孢杆菌平板计数法检验程序
6.2操作步骤
6.2.1样品处理
冷冻样品应在冷冻样品应在45℃以下不超过15min或在2℃~5℃不超过18h解冻,若不能及时检验,应放于-10℃~-20℃保存;非冷冻而易腐
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的样品应尽可能及时检验,若不能及时检验,应置于2℃~5℃冰箱保存,24h内检验。
6.2.2样品制备
称取样品25g,放入盛有225mLPBS或生理盐水的无菌均质杯内,用旋转刀片式均质器以8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mLPBS或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min。
若样品为液态,吸取25mL样品至盛有225mLPBS或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中,振荡混匀,作为1:
10的样品匀液。
6.2.3样品的稀释
吸取6.2.2中1:
10的样品匀液1mL加到装有9mLPBS或生理盐水的稀释管中,充分混匀制成1:
100的样品匀液。
跟据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。
每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。
6.2.4样品接种
根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),以0.3mL、0.3mL、0.4mL接种量分别移入三块MYP琼脂平板,然后用无菌L棒涂布整个平板,注意不要触及平板边缘。
使用前,如MYP琼脂平板表面有水珠,可放在25℃~50℃的培养箱里干燥,
直到平板表面的水珠消失。
6.2.5分离、培养
6.2.5.1分离
在通常情况下,涂布后,将平板静置10min。
如样液不易吸收,可将平板放在培养箱30℃±1℃培养1h,等样品匀液吸收后翻转平皿,倒置于培养箱,30℃±1℃培养24h±2h。
如果菌落不典型,可继续培养24h±
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2h再观察。
在MYP琼脂平板上,典型菌落为微粉红色(表示不发酵甘露醇),周围有白色至淡粉红色沉淀环(表示产卵磷脂酶)。
6.2.5.2纯培养
从每个平板中挑取至少5个典型菌落(小于5个全选),分别划线接种于营养琼脂平板做纯培养,30℃±1℃培养24h±2h,进行确证实验。
在营养琼脂平板上,典型菌落为灰白色,偶有黄绿色,不透明,表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状,边缘常呈扩展状,直径为4mm~10mm。
6.3确定鉴定
6.3.1染色镜检
挑取纯培养的单个菌落,革兰氏染色镜检。
蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性芽胞杆菌,大小为(1μm~1.3μm)×(3μm~5μm),芽胞呈椭圆形位于菌体中央或偏端,不膨大于菌体,菌体两端较平整,多呈短链或长链状排列。
6.3.2生化鉴定
6.3.2.1概述
挑取纯培养的单个菌落,进行过氧化氢酶试验、动力试验、硝酸盐还原
试验、酪蛋白分解试验、溶菌酶耐性试验、V-P试验、葡萄糖利用(厌氧)试验、根状生长试验、溶血试验、蛋白质毒素结晶试验。
蜡样芽胞杆菌
菌生化特征与其他芽胞杆菌的区别见表1。
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生化特征与其他芽胞杆菌的区别见表1。
项目
蜡样芽孢杆菌
苏云金芽孢杆菌
蕈庄芽孢杆菌
炭疽芽孢杆菌
巨大芽孢杆菌
革兰氏染色
+
+
+
+
+
过氧化氢酶
+
+
+
+
+
动力
+/-
+/-
-
-
+/-
硝酸盐还原
+
+/-
+
+
-/+
酪蛋白分解
+
+
+/-
-/+
+/-
溶菌酶耐性
+
+
+
+
-
卵黄反应
+
+
+
+
-
葡萄糖利用(厌氧)
+
+
+
+
-
V-P试验
+
+
+
+
-
甘露醇产酸
-
-
-
-
+
溶血(羊红细胞)
+
+
+
-/+
-
根状生长
-
-
+
-
-
蛋白质毒素晶体
-
+
-
-
-
注:
+表示90%~100%的菌株阳性;-表示90%~100%的菌株阴性;+/-表示大多数菌株阳性;-/+表示大多数菌阴性。
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6.3.2.2动力试验
用接种针挑取培养物穿刺接种于动力培养基中,30℃培养24h。
有动力的蜡样芽胞杆菌应沿穿刺线呈扩散生长,而蕈状芽孢杆菌常呈“绒毛状”生长。
也可用悬滴法检查。
6.3.2.3溶血试验
挑取纯培养的单个可疑菌落接种于TSSB琼脂平板上,30℃±1℃培养24h±2h。
蜡样芽胞杆菌菌落为浅灰色,不透明,似白色毛玻璃状,有草绿色溶血环或完全溶血环。
苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌呈现弱的溶血现象,而多数炭疽芽胞杆菌为不溶血,巨大芽胞杆菌为不溶血。
6.3.2.4根状生长试验
挑取单个可疑菌落按间隔2cm~3cm左右距离划平行直线于经室温干燥1d~2d的营养琼脂平板上,30℃±1℃培养24h~48h,不能超过72h。
用蜡样芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌标准株作为对照进行同步试验。
蕈状芽胞杆菌呈根状生长的特征。
蜡样芽胞杆菌菌株呈粗糙山谷状生长的特征。
6.3.2.5溶菌酶耐性试验
用接种环取纯菌悬液一环,接种于溶菌酶肉汤中,36℃±1℃培养24h。
蜡样芽胞杆菌在本培养基(含0.001%溶菌酶)中能生长。
如出现阴性反应,应继续培养24h。
巨大芽胞杆菌不生长。
6.3.2.6蛋白质毒素结晶试验
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挑取纯培养的单个可疑菌落接种于硫酸锰营养琼脂平板上,30℃±1℃培养24h±2h,并于室温放置3d~4d,挑取培养物少许于载玻片上,滴加蒸馏水混匀并涂成薄膜。
经自然干燥,微火固定后,加甲醇作用30s后倾去,再通过火焰干燥,于载玻片上滴满0.5%碱性复红,放火焰上加热(微见蒸气,勿使染液沸腾)持续1min~2min,移去火焰,再更换染色液再次加温染色30s,倾去染液用洁净自来水彻底清洗、晾干后镜检。
观察有无游离芽胞(浅红色)和染成深红色的菱形蛋白结晶体。
如发现游离芽胞形成的不丰富,应再将培养物置室温2d~3d后进行检查。
除苏云金芽胞杆菌外,其他芽胞杆菌不产生蛋白结晶体。
6.3.2.7生化分型(选做项目)
根据对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、V-P试验反应、明胶液化试验,将蜡样芽胞杆菌分成不同生化型别,见表2。
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表2蜡样芽孢杆菌生化分型试验
6.4结果计算
6.4.1典型菌落计数和确认
6.4.1.1选择有典型蜡样芽胞杆菌菌落的平板,且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20CFU~200CFU之间的平板,计数典型菌落数。
如果出现a)~f)现象按4.4.2.1中公式
(1)计算,如果出现g)现象则按4.4.2.2中公式
(2)计算
a)只有一个稀释度的平板菌落数在20CFU~200CFU之间且有典型菌落,计数该稀释度平板上的典型菌落;
b)2个连续稀释度的平板菌落数均在20CFU~200CFU之间,但只有一个稀释度的平板有典型菌落,应计数该稀释度平板上的典型菌落;
c)所有稀释度的平板菌落数均小于20CFU且有典型菌落,应计数最低稀释
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度平板上的典型菌落;
d)某一稀释度的平板菌落数大于200CFU且有典型菌落,但下一稀释度平板上没有典型菌落,应计数该稀释度平板上的典型菌落;
e)所有稀释度的平板菌落数大于200CFU且有典型菌落,应计数最高稀释度平板上的典型菌落;
f)所有稀释度的平板菌落数均不在20CFU~200CFU之间且有典型菌落,其中一部分小于20CFU或大于200CFU时,应计数最接近20CFU或200CFU的稀释度平板上的典型菌落。
g)2个连续稀释度的平板菌落数均在15CFU~150CFU之间。
6.4.1.2从每个平板中至少挑取5个典型菌落(小于5个全选),划线接种于营养琼脂平板做纯培养,30℃±1℃培养24±2h。
6.4.2计算公式
6.4.2.1菌落计算公式
(1)
…………………………
(1)
式中:
T———样品中蜡样芽胞杆菌菌落数;
A———某一稀释度蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数;
B———鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数;
C———用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数;
d———稀释因子。
6.4.2.2菌落计算公式
(2)
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…………………………
(2)
式中:
T———样品中蜡样芽胞杆菌菌落数;
A1———第一稀释度(低稀释倍数)蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数;
B1———第一稀释度(低稀释倍数)鉴定结果为蜡样芽胞杆菌典型菌落的
总数;
C1———第一稀释度(低稀释倍数)用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数;
A2———第二稀释度(高稀释倍数)蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数;
B2———第二稀释度(高稀释倍数)鉴定结果为蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数;
C2———第二稀释度(高稀释倍数)用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数;
1.1———计算系数(如果第二稀释度蜡样芽胞杆菌鉴定结果为0,计算系数采用1);
d———稀释因子(第一稀释度)。
6.5结果报告
6.5.1根据MYP平板上蜡样芽孢杆菌的典型菌落数,按公式
(1)、公式
(2)计算,报告每g(ml)样品中蜡样芽孢杆菌菌数,以CFU/g(ml)表示;如T值为0,则以小于1乘以最低稀释倍数报告。
6.5.2必要时计算蜡样芽孢杆菌生化分型结果。
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