植物细胞器的分离.docx
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植物细胞器的分离
植物细胞器的分离
一、叶绿体的分离:
1.实验原理:
采用差速离心法,利用不同颗粒的大小形状不同导致沉降速率不同,把叶绿体的颗粒沉降出来。
2.实验材料及试剂:
成熟的猪笼草、山梨醇、Tris、EDTA与β-巯基乙醇均为Amresco产品、
细胞器分离缓冲液:
300mmol/L山梨醇,50mmol/LTris-HCl(pH为8.0),5mmol/LEDTA(pH8.0),0.1%β-巯基乙醇(临用前加入)。
3.实验器材:
SG350C多功能食品料理机(天航电器),GL21M高速冷冻离心机及配套的2号角转头(湘仪集团)
表1叶绿体分离试剂配置
名称
使用浓度
配制体积
从母液吸取体积
母液浓度
称取g
实际g
母液体积
备注
山梨醇
0.3mol/L
100ml
10ml
3mol/L
54.651
100mL
Tris-HCl0.05mol/L
0.05mol/L
100ml
pH8.0
EDTA
0.005mol/L
100ml
1ml
0.5mol/L
14.6124
100mL
pH8.0
β-巯基乙醇
0.1%
100ml
100ml
0.1%
0.1
100ml
蔗糖
52%
100ml
100ml
52%
52
100ml
蔗糖
30%
100ml
100ml
30%
30
100ml
EDTA
0.025mol/L
100ml
100ml
2.5mol/L
73.062
100mL
pH8.8
EDTA
0.025mol/L
100ml
100ml
2.5mol/L
73.062
100mL
pH8.0
计算过程:
山梨醇:
配制体积:
100mL,浓度:
3mol/L;分子量:
182.17g/mol
需要称取质量g:
=100mL*3mol/L*182.17g/mol=0.1L*3mol/L*182.17g/mol=54.651g
EDTA:
配置体积:
100ml,浓度:
0.5mol/lL,分子量:
292.248g/mol
m=0.5mol/L*100mL*292.248g/mol=14.6124g
LEDTA:
配置体积:
100ml浓度:
25mol/L,分子量:
292.248g/mol
m=2.5mol/L*100mL*292.248g/mol=73.062g
4.制备方法
4.1 叶绿体粗提物的制备
(1).取25g叶片置于100mL充分预冷的细胞器分离缓冲液中,用食品料理机匀浆2min(5000r/min),
(2).然后将匀浆液用4层纱布过滤于500ml烧杯,
(3).滤液于4℃、700g在1000r/min离心10min,
(4).弃去细胞核沉淀上清液再于4℃、2000g在3000r/min离心10min,所得沉淀即为叶绿体粗提物,
(5).将此粗提物悬浮于7.5mL细胞器分离缓冲液中备用。
4.2 密度梯度离心制备完整叶绿体
(1).用50mL离心管制备蔗糖梯度,底部为18mL含52%(质量分数)的蔗糖,50mmol/LTris-HCl(pH为8.8),25mmol/LEDTA(pH为8.8)的混合液,
上面用7mL含30%蔗糖、50mmol/LTris-HCl(pH为8.0)、25mmol/LEDTA(pH为8.0)的混合液覆盖。
(2).将上述所得叶绿体粗提取物小心覆盖于30%的蔗糖上面,平衡后在4℃、20kr/min离心30min。
(3).处于52%蔗糖与30%蔗糖界面上的绿色条带即为完整叶绿体。
(4).用加样枪小心吸出绿色的条带。
5.叶绿体的显微鉴别:
叶肉细胞中的叶绿体,散布于细胞质基质中,呈绿色,扁平的椭球形或球形可以在高倍显微镜(400~600)下观察到它的形态和分布。
二、线粒体的分离
1.实验原理:
利用沉降系数不同的颗粒,在一定介质中沉降速度的差异,采取分级差速离心的方法,将线粒体从细胞悬液中逐级分离出来。
2.实验材料及试剂:
实验材料成熟的拟南芥,琼脂糖为微生物试剂厂产品;牛血清蛋白(BSA)为试剂厂产品;DNase和RNase为生物工程技术服务产品;
溴化乙锭为SerVa公司产品;其余试剂均为国产分析纯.1×TAE电泳缓冲液(称取242gTris溶于适量蒸馏水中,加入57.1mL冰乙酸,100mL0.5mol·L1EDTA,pH=8.0,用蒸馏水定容至1L即为50×TAE转换为1×TAE稀50倍)缓冲液A:
蔗糖0.5mol·L-1,Tris-Cl50mmol·1,EDTA5mmol·L-1,BSA0.1%,PVP0.5%,0.1%β-巯基乙醇,pH=7.5.缓冲液B:
蔗糖0.5mol·L-1,Tris-Cl50mmol·L-1,pH=7.5.缓冲液C:
蔗糖0.6mol·L-1,Tris-Cl10mmol·L-1,EDTA20mmol·L-1,pH=7.2.缓冲液D:
0.1mol·L-1Tri-HCl(pH=8.0),0.05mol·L-1EDTA(pH=8.0),0.1mol·L1NaCl,10%SDS,0.01mol·L-1β-巯基乙醇.
表2线粒体分离试剂配置
名称
使用浓度
配制体积
从母液吸取体积
母液浓度
称取g
实际g
母液体积
备注
EDTA
0.5mol/L
100ml
100ml
0.5mol/L
14.6124
100mL
Ph=8
缓冲液A
蔗糖
0.5mol·L-1
100ml
100ml
0.5mol/L
17.115
100mL
Tris-Cl
0.05mol·1
100ml
10ml
0.5mol/L
6.057
100mL
EDTA
0.005mol·11L-1
100ml
1ml
0.5mol/L
14.6124
100mL
BSA
0.1%
100ml
100ml
0.1%
0.1
100ml
PVP
0.5%
100ml
100ml
0.5%
0.5
100ml
β-巯基乙醇
0.1%
100ml
100ml
0.1%
0.1
100ml
pH=7.5
缓冲液B
蔗糖
0.5mol·L-1
100ml
100ml
0.5mol/L
17.115
100ml
Tris-Cl
0.05mol·L-1
100ml
10ml
0.5mol/L
6.057
100mL
pH=7.5
缓冲液C
蔗糖
0.6mol·L-1
100ml
100ml
0.6mol/L
20.538
100mL
Tris-Cl
0.01mol·L-1
100ml
10ml
0.1mol/L
1.2114
100mL
EDTA
0.02mol·L-1
100ml
10ml
0.2mol/L
5.845
100mL
pH=7.2
缓冲液D
Tri-HCl
0.1mol·L-1
100ml
100ml
0.1mol/L
1.2114
100mL
pH=8.0
EDTA
0.05mol·L-1
100ml
10ml
0.5mol/L
14.6124
100mL
pH=8.0
NaCl
0.1mol·L-1
100ml
100ml
0.1mol/L
0.5844
100mL
SDS
10%
100ml
100ml
10%
10
100ml
β-巯基乙醇
0.01mol·L-1
100ml
10ml
0.1mol/L
0.7813
100mL
计算过程:
EDTA:
配置体积:
100ml,浓度:
0.5mol/L,分子量:
292.248g/mol
m=0.5mol/L*100mL/*292.248g/mol=14.6124g.
蔗糖:
配置体积:
100ml,浓度:
0.5mol/L,分子量:
342.3g/mol
m=0.5mol/L*100mL*342.3g/mol=17.115g.
LTris-Cl:
配置体积:
100ml,浓度:
0.5mol/L,分子量:
121.14g/mol
m=0.5mol/L*100ml*121.14g/mol=6.057g.
蔗糖:
配置体积:
100ml,浓度:
0.5mol/l,分子量:
342.3g/mol
m=0.5mol/L*100mL*342.3g/mol=17.115g.
蔗糖:
配置体积:
100ml,浓度:
0.6mol/L,分子量:
342.3g/mol
m=0.6mol/L*100mL*342.3g/mol=20.538g.
Tris-Cl:
配置体积:
100ml,浓度:
0.1mol/L,分子量:
121.14g/mol
m=0.1mol/L*100mL*121.14g/mol=1.2114g.
EDTA:
配置体积:
100ml,浓度:
0.2mol/l,分子量:
292.248g/mol
m=0.2mol/L*100mL*292.248g/mol=5.845g.
NaCl:
配置体积:
100ml,浓度:
0.1mol/L,分子量:
58.44g/mol
m=0.1mol/L*100mL*58.44g/mol=0.5844g.
β-巯基乙醇:
配置体积:
100ml,浓度:
0.1mol/L,分子量:
78.13g/mol
m=0.1mol/L*100ml*78.13g/mol=0.7813g.
3.实验仪器:
超速冷冻离心机、制冰机、研钵(Υ=15cm)、无菌纱布、大离心管(50mL)、水浴锅、微量离心管(1.5mL)、微量离心机(1.5mL管)、-20℃冰箱、自动扩增仪、凝胶成像系统、紫外灯.
4.实验方法:
(1).采集叶片30g左右(采集前需暗培养24~28h,以减少叶片组织所含糖类的污染);
(2).用蒸馏水洗涤2~3次,置研钵中(研钵提前预冷),加适量预冷缓冲液A和少量的石英砂在冰上研磨,直至缓冲液为深绿色;
(3).用6层无菌纱布过滤匀浆组织(并用缓冲液A漂洗纱布),然后将磨碎组织放回研钵中重新研磨并过滤,2次滤液合并,补加缓冲液A至3~5mL·g-1试材,并将滤液分装于4个50mL无菌离心管中,1000g离心10min,收集上清液;
(4).将上清液2000g离心10min,再收集上清液于20000g离心10min得到粗线粒体沉淀,在粗线粒体沉淀中加入每管10mL预冷的缓冲液B用软笔轻轻悬浮沉淀,注意应悬浮均匀后,将粗线粒体悬液1000g离心10min;
(5).收集上清液于同一50mL无菌离心管,加入300μL1mol·L-1的MgCl2至终浓度0.01mo·L-1,和5mg·mL-1的DNaseⅠ至终浓度20μg·mL-1,冰浴放置1.5~2h,在冰浴液中加入1.5mL0.5mol·L1的EDTA(pH=8.0)至终浓度20mmol·L-1;
(6).将上述溶液小心铺于缓冲液C上(每管25mLC缓冲液),18000g离心20min;收集沉淀重新悬浮于装20mL预冷缓冲液C的离心管中,18000g离心10min,得到较纯的线粒体沉淀.以上操作均在0~4℃条件下进行.
5.显微鉴别:
线粒体在光学显微镜一般呈短棒状或圆球状,但必须借助健那绿(JanusgreenB)染液,使得线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色,而在周围的细胞质中染料被还原,成为无色状态.因此可以使活细胞中的线粒体呈现蓝绿色,而细胞质接近无色.线粒体能在健那绿染液中维持活性数小时,通过染色,可以在高倍显微镜下观察到生活状态的线粒体的形态和分布.配制质量分数为1%健那绿染液(将0.5g健那绿溶解于50mL生理盐水中,加温到30-40摄氏度,使其充分溶解).
三、细胞核的分离:
1.原生质体制备:
(1).取生长3~4d的拟南芥悬浮系细胞1700rpm离心3min.静置沉淀,
(2).用0.4molL甘露醇短暂洗涤后置于20mL酶解缓冲液(5mmol/LMES,6.8mmol/LCaCl2,11mmol/LKH2PO4,0.3mol/LMannitol,0.3mol/Lsorbitol,0.4%PVP-K30,2%cellulast,0.5%Macerozyme,pH5.7)酶解4.5h.
名称
使用浓度
配制体积
从母液吸取体积
母液浓度
称取g
实际g
母液体积
备注
甘露醇
0.4mol/L
20ml
20ml
0.4mol/L
7.2868
100mL
MES2-(N-吗啡啉)乙磺酸
0.005mol/L
20ml
0.2ml
0.5mol/L
10.6625
100mL
CaCl2
0.0068mol/L
20ml
0.2ml
0.68mol/L
7.54664
100mL
KH2PO4
0.011mol/L
20ml
2ml
0.11mol/L
1.497
100mL
Mannitol甘露醇
0.3mol/L
20ml
20ml
0.3mol/L
5.4651
100mL
Sorbitol
山梨糖醇
0.3mol/L
20ml
20ml
0.3mol/L
5.4651
100mL
PVP-K30
0.4%
0.4%
0.4
100ml
Cellulast
纤维素酶
2%
2%
2
100ml
Macerozyme
浸解酶
0.5%
0.5%
0.5
100ml
Ph=5.7
计算过程:
甘露醇:
配制体积:
100ml,浓度:
0.4mol/l,分子量:
182.17g/mol
m=0.4mol/L*100ml*182.17g/mol=7.2868g.
MES:
配置体积:
100ml,浓度:
0.5mol/L,分子量:
213.25g/mol
m=0.5mol/L*100ml*213.25g/mol=10.6625g.
CaCl2:
配置体积:
100ml,浓度:
0.68mol/L,分子量:
110.98g/mol
m=0.68mol/L*100mL*110.98g/mol=7.54664g.
KH2PO4:
配置体积:
100ml,浓度:
0.11mol/L,分子量:
136.09g/mol
m=0.11mol/L*100mL*136.09g/mol=1.497g.
Mannitol甘露醇:
配置体积:
100ml,浓度:
0.3mol/L,分子量:
182.17g/mol
m=0.3mol/L*100mL*182.17g/mol=5.4651g.
Sorbitol山梨糖醇:
配制体积:
100ml,浓度:
0.3mol/L,分子量:
182.17g/mol
m=0.3mol/L*100ml*182.17g/mol=5.4651g.
PVP-K30:
m=(50g*0.4%)/(1-0.4%)=0.2008g.
(3).摇床设定70rpm,28℃.三层纱布过滤一次,
(4).滤液经1700rpm离心3min,去上清,
(5).用洗涤缓冲液(5mmol/LMES,0.2mol/Lsorbitol,0.2mol/LManmitol(pH5.7))洗涤2次即可得到分散均匀的原生质体.
名称
使用浓度
配制体积
从母液吸取体积
母液浓度
称取g
实际g
母液体积
备注
MES
0.005mol/L
100ml
1ml
0.5mol/L
10.6625
100mL
sorbitol
0.2mol/L
100ml
100ml
0.2mol/L
3.6434
100mL
Manmitol
0.2mol/L
100ml
100ml
0.2mol/L
3.6434
100mL
pH=5.7
计算过程:
MES:
配置体积:
100ml,浓度:
0.5mol/L,分子量:
213.25
m=0.5mol/L*100mL*213.25g/mol=10.6625g.
sorbitol:
配制体积:
100ml,浓度:
0.2mol/L,分子量:
182.17g/mol
m=0.2mol/L*100mL*182.17g/mol=3.6434g.
Manmitol:
配置体积:
100ml,浓度:
0.2mol/L,分子量:
182.17g/mol
m=0.2mol/L*100mL*182.17g/mol=3.6434g.
2.细胞核与叶绿体的分离提纯
为保证提纯的细胞器中组分免受破坏,以下步骤均要在0~4℃下进行.
2.1 细胞核与叶绿体的粗提
(1).向原生质体中加入含有0.5%TritonX-100的CSK缓冲液(100mmol/LKCl,3mmol/LMgCl2,1mmol/LEGTA(pH8.0),10mmol/LPIPES(pH6.8),300mmol/Lsucrose,1.2mmol/LPMSF,20mmolLDTT),振荡混匀后,静置7min.溶去原生质体膜但保证细胞核和叶绿体的膜系统不被破坏.
(2).取120g离心10min,弃上清液.
(3).用CSK缓冲液重悬沉淀,
(4).20μm孔径的滤膜过滤,
(5).取120g离心10min,得到的沉淀为粗提的细胞核与叶绿体的混合物,
(6).用改良碱性品红苯酚染色,镜检细胞核与叶绿体的初步分离情况.
2.2 细胞核与叶绿体的纯化
(1).把含有2.3molL蔗糖的CSK缓冲液(100mmolLKCl,3mmolLMgCl2,1mmolLEGTA(pH8.0),10mmolLPIPES(pH6.8),2.3molLsucrose,1.2mmolLPMSF,20mmolLDTT)加至于离心管底部,
名称
使用浓度
配制体积
从母液吸取体积
母液浓度
称取g
实际g
母液体积
备注
KCl
0.1molL
100ml
100ml
0.1mol/L
0.746
100mL
MgCl2
0.003molL
100ml
1ml
0.3mol/L
2.8563
100mL
EGTA
0.001molL
100ml
1ml
0.1mol/L
3.8035
100mL
pH=8.0
PIPES
0.01molL
100ml
10ml
0.1mol/L
3.024
100mL
pH=6.8
sucrose蔗糖
2.3molL
100ml
100ml
2.3mol/L
78.729
100mL
苯甲基磺酰氟(剧毒)PMSF
0.0012molL
100ml
1ml
0.12mol/L
2.09028
100mL
DTT二硫糖醇
0.02molL
100ml
10ml
0.2mol/L
3.085
100mL
计算过程:
KCl:
配制体积:
100ml,浓度:
0.1mol/L,分子量:
74.6g/mol
m=0.1mol/L*100mL*74.6g/mol=0.746g.
MgCl2:
配置体积:
100ml,浓度:
0.3mol/L,分子量:
95.21g/mol
m=0.3mol/L*100mL*95.21g/mol=2.8563g.
EGTA:
配置体积:
100ml,浓度:
0.1mol/L,分子量:
380.35g/mol
m=0.1mol/L*100mL*380.35g/mol=3.8035g
PIPES:
配置体积:
100ml,浓度:
0.1mol/L,分子量:
302.40g/mol
m=0.1mol/L*100mL*302.40g/mol=3.024g.
sucrose:
配置体积:
100ml,浓度:
2.3mol/L,分子量:
342.3g/mol
m=2.3mol/L*100mL*342.3g/mol=78.729g.
PMSF:
配置体积:
100ml,浓度:
0.12mol/L,分子量:
174.19g/mol
m=0.12mol/L*100mL*174.19g/mol=2.0903g.
DTT:
配置体积:
100ml,浓度:
0.2mol/L,分子量:
154.25g/mol
m=0.2mol/L*100mL*154.25g/mol=3.085g.
(2).再把60%percollCSK缓冲液(60%percoll,100molLKCl,3mmolLMgCl2,1mmolLEGTA(pH8.0),10mmolLPIPES(pH6.8),300mmolLsucrose,1.2mmolLPMSF,20mmolLDTT)轻轻地平铺于它的上方,
名称
使用浓度
配制体积
从母液吸取体积
母液浓度
称取g
实际g
母液体积
备注
percoll
60%
100ml
100ml
60%
60
100ml
KCl
100mol/L
10ml
10ml
100mol/L
74.6
10mL
MgCl2
0.003mol/L
100ml
1ml
0.3mol/L
2.8563
100mL
EGTA
0.001mol/L
100ml
1ml
0.1mol/L
3.8035
100mL
Ph=8.0
PIPES
0.01mol/L
100ml
10ml
0.1mol/L
3.024
100mL
Ph=6.8
sucrose
0.3mol
100ml
100ml
0.3mol/L
10.269
100mL
PMSF苯甲基磺酰氟(剧毒)
0.0012molL
100ml
1ml
0.12mol/L
2.0903
100mL
DTT
0.02molL
100ml
10ml
0.2mol/L
3.085
100mL
计算过程:
KCl:
配置体积:
10ml,浓度:
100mol/L,分子量:
74.6g/mol
m=100mol/L*10mL*74.6g/mol=74.6g.
MgCl2:
配置体积:
100ml,浓度:
0.3
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- 植物 细胞器 分离