世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版.docx
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世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版
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世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版
世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版[精华]
序言:
国内外关于原代培养有很多文献,不幸的是,没有一篇是详细的,没有一篇解答过why.
为了让大家少走弯路,根据我杀过3000只老鼠的经验,我把我这几年摸索的经验和大家分享,请求多投几票得几个叮当。
相信你follow我的这篇文章一定会做的很好。
我的标题说的很像吹牛,但是我是严肃认真的说的,Iearnit.
note:
这篇文章全是我个人的经验,99。
9%原创,经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法,除了最后那一副图是来自下面第2行那篇文献,所以我才说是99.9%原创。
1.材料选择。
一定要严格按照国际上,NCBI数据库,其他文献的材料一致。
胎鼠就要胎鼠,新生鼠就要新生鼠,不能混淆。
因为新生鼠有一些受体,在培养的工作中失去功能,会不能再生,比如NMDA受体。
和文献不同会导致错误结论,甚至困惑。
很多人写信问我新生鼠的培养问题,我回答用新生鼠的实验很少,八成是你自己搞错了实验对象,请确认国际上的相关研究文献所用老鼠,再来问我下面的问题。
2,培养基选择(neurbasal/neurobasal-a,invitrogenCo.ltd)。
我强烈不建议用血清培养。
原因是:
首先,血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂,最后非常影响神经元产量;
其次,为了抑制胶质生长,往往要加入阿糖孢苷。
严重的毒性会影响许多灵敏实验;
再次,最重要的,血清培养的细胞状态很不均一,从正常到凋亡都有,严重影响试验准确,而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态,要么都好,要么都差,高度一致。
Invitrogen/GIBCO无血清培养基neurobasal(neurbasal-A)被认为是最标准,最好的培养基。
需要的添加剂为B27和谷氨酰胺。
培养出的细胞状态均一,胶质细胞几乎不分裂。
其中,neurobasal是胎鼠培养基,而-A为新生鼠培养基。
不过根据笔者实验,没什么太大区别,都能很轻松培养成功,但是,切忌中途换培养基,要从一而终。
很多实验室是不加抗生素的,也有的实验室加。
由于很多初学者操作不熟练,不注意,很多人会污染,所以我还是建议加双抗。
注意!
由于无血清培养基添加剂不是血清,而是人工合成的B27(也有用N2的,但是推荐B27,只差10美金),血清有复杂的解毒作用而B27没有,双抗对细胞的干扰,无血清培养基要大的多。
所以,如果你在neurobasal里添加抗生素,记得用量只要标准量的一半。
另一个添加成分谷氨酰胺溶液不稳定,所以每次用时候要现配现加。
大概是0.5-2mmol/l大部分人用0.5mmol/l.虽然笔者试过,没加这个也正常生长,但是几乎所有文献都添加,wejustsimplyfollow.
3.解剖过程一定要全程在冰上预冷。
这就意味着,从你处死母鼠后,胎鼠的大脑的温度要最快的降低到0度。
另外,在解剖过程中,胎鼠直到皮层或海马被剪碎的过程,有时候可能需要2小时,如果样品多。
一定要注意多准备冰袋子。
确保你的任何过程都在冰浴的培养液中进行(消化步骤除外)。
这样可以大大提高存活率。
在解剖大脑时候,有人用hank's,在其中解剖。
根据我的经验,即使是0度,神经元还是在进行着很大程度代谢。
所以,hanks的无糖环境很不利。
我个人建议,用DMEM-高糖或DMEM-F12+马血清来浸泡解剖过程中的大脑,来供给大脑的代谢,血清可以抑制神经凋亡。
这其中还有一个问题,就是DMEM培养液会在空气中变碱性。
国外有的实验室用L-15培养液来浸泡解剖过程中的脑,因为L-15不会再空气中变碱性。
没有L-15的(国内几乎没有),可以全程用DMEM-HG或者DMEM-F12+血清浸泡解剖过程中的脑。
注意注意:
一切操作都在冰浴的液体中,所以要多准备冰袋。
(中途冰袋没了的是猪头)
4.关于培养皿的问题。
一般来说,6孔板是最佳选择。
神经元让人苦恼的问题是,神经元发育的情况和密度相关。
大于6孔板(比如6CMDISH)会使得中间很难和周围的细胞密度一样,造成板中间和边缘成熟度不一样,而这会给实验带来很大干扰。
而太小的话(96孔或128孔)细胞会倾向于向中间集中也会照成发育不均匀。
所以笔者经验是6孔板是最佳选择。
神经原代培养一定是要包被,用POLY-LYS或者胶原。
关于POLY-LYS包被,我们是包被30分钟,吸干晾过夜,然后洗两次,或者只洗一次但是要30分钟接着晾干。
由于neurobasal培养法相当成熟,所以没必要用难固定的胶原。
5.处死母鼠并把胎鼠解剖时候,一定要注意母鼠状态,是否有死胎,胎儿胎盘是不是正常,有多少胎,母鼠是多少天的(一般是E16-E18)这些信息也要严格记录。
处死孕鼠后,要立即取出子宫放入冰冷培养液中。
注意孕鼠处死后要短暂的浸泡酒精消毒,防止污染。
一般来说,冰袋笔者选择一面蓝一面白的。
蓝的朝上,可以很清晰看到海马结构。
而去除血管膜的时候,白的那面朝上,这样可以很清楚看到血管膜。
从处死老鼠到大脑被剥离出这段是人就会做,我就不多说了。
不过有一点要注意,不管你是用皮层还是海马,不要取一个分离一个,而是要快速把所有胎鼠大脑都迅速取出放到冰预冷的培养液中。
我建议胎鼠取出来的时候胎鼠就放在冰冷的缓冲液中。
就是说,处死后要迅速把大脑的温度降到0.
6:
最影响原代培养的成败因素之一:
这小段请大家一定注意看。
无论皮层还是海马,上面都是有一层血管膜。
注意:
一定要尽可能的去掉所有的血管和血管膜。
可以用解剖显微镜。
胎鼠很好剥离,而新生鼠则比较难。
这里千万不能粗心大意!
!
血管膜没剥离干净的后果是:
1吹打时候很难吹打下来神经元,被迫多次吹打,造成神经元大量死亡;2血管膜一部分细胞会混入原代培养中,这些细胞往往会分裂,导致你的培养成果根本不能用。
可以说,剥离的不好不干净,实验就是失败的,不可能得到高质量的神经元。
注意的事情二:
如果是要的是皮层的神经元原代培养,而皮层的细胞很多,切忌不要放太多皮层消化吹打!
过多的细胞反而会导致神经元大量死亡。
另外,请仔细注意文献中要的是皮层哪一部位。
没有详细要求的话一般是取顶端
。
从大脑到单个海马的剥离我不细说了。
我现在以海马神经元为例。
在所有海马都成功剥离后,请仔细的去除血管膜,原因上面说过。
最后,请再仔细检查一下是不是都去掉了。
确认后,海马片段被移入一个小烧杯里,加少量培养液,用剪刀剪成0.5-1立方毫米的小块,放置冰上准备消化,
7:
实验成败的关键之二:
消化。
一般来说,我看很多人都用0.125%的胰酶消化。
实话说,胰酶消化非常的难以掌握速度,而且消化效果真的是--很烂!
稍微不注意,就会消化过头,细胞都消化光了。
而胰酶消化的快,还会出现细胞快速破裂释放出DNA,和其他蛋白缠结成絮状包裹在组织块外面,使得块里面的不到应有的消化。
所以我个人不推荐胰酶。
想做一个完美成功的消化,我强烈推荐木瓜酶+DNA酶。
木瓜酶是消化过后,存活率最高的酶(见附图)。
笔者是配成2mg/ml的木瓜酶。
另外要用的是DNA酶。
DNA酶的作用是,消化掉破裂细胞的DNA,避免了释放的DNA和蛋白缠结在组织块表面而阻碍进一步消化。
DNA酶由于各个公司的活性不一样,很难有标准浓度,需要摸条件,不过不是很严格,只要能防止DNA缠结就好。
木瓜酶的特点是不会消化过头,非常温和。
缺点是一定要现配(请直接用无血清的培养液配来保证神经元的营养代谢,而且一定要现用现配。
消化的技巧:
消化时候,很多人有不良习惯,喜欢用个50ml试管装着所有东西。
结果是组织都沉底,下面消化不足,上面消化的没细胞。
笔者的技巧是,用一个6或10CM培养皿来消化。
这样消化液在培养皿里形成浅而广阔的一层,均匀分布着组织块,从而彻底解决了上述问题。
消化酶是2mg/ml木瓜蛋白酶+适量DNA酶。
木瓜蛋白酶很便宜请放心。
消化过程是20-30分钟。
由于木瓜蛋白酶温和,因此不会消化过头,使得你的实验消化的很稳定。
消化时候请在37度温箱里,每5分钟稍微摇动一下。
注意:
1)木瓜酶不要用巯基化合物激活,激活后消化好很多但是成活率坏很多;2)尽量用不含血清的培养液来配置木瓜酶而不是用hanks,使得神经元保持营养;3)木瓜酶一定要现用现配。
再次重申:
除了消化过程中要37度,其余任何时刻都是要浸泡在0度(冰浴)的液体中。
消化过后可以用1ml血清终止反应(我是用马血清,便宜,但是切忌不要用国产血清,污染几率很大)。
把消化用的培养皿放在冰上冷却,然后垫高一面使得液体集中在另外一面便于吹打。
整个体系静止2-3分钟,然后仔细的去掉上层的液体,保留消化过的组织块
8.实验成败最关键最关键的:
吹打。
笔者经验是,没有必要用巴斯德管。
对于胎鼠和10天之内的新生鼠,一般的1ml蓝枪头就可以达到满意的效果。
在一边被垫高的皿里面,加入1-1.5ml新鲜培养基和少量DNA酶,吹打10次。
吹打时候要注意,切忌过快,要缓慢吹打。
吸入时候要很缓慢,吹出的时候可以略快,但是也要缓慢。
轻柔吹打是细胞成活关键!
要用进口枪头,国产的有时候会过细。
我们采用的是最合理的分步吹打法。
每个10次吹打过后,静止2分钟。
这时候游离的单细胞在上面,而团块会沉到下面去。
上面的那层就是你要的单个悬浮细胞,把它们挪到指定容器里(一样要冷在冰上)。
下面沉淀下去的细胞团块不要丢弃,再加1-1.5ml新鲜培养液,重复刚才的步骤,轻柔吹打,再静止2分钟,转移上层的单细胞到刚才指定容器里,一共这样分步吹打3次。
3次之后如果还有团块在下面,请果断丢弃。
造成这个的原因就是刚才的血管膜没剥好。
这个分步吹打的过程保证了每一个单细胞都避免了过度吹打,而分布吹打又保证了尽可能多的收获单细胞。
重申一下,为了保证最大程度收获活细胞,每次吹打之前,可以加入少量DNA酶。
这招可以更容易收获大量高质量细胞,尤其是实验材料不足时候。
消化和吹打非常忌讳操作的细胞过多,这样反而会使大量细胞死亡。
实验者如果是用的皮层这种原材料充足的话,切忌不要放入过多皮层。
9(可选可不选,但是我建议全选)神经元进一步纯化。
一般来说,收获的细胞悬液已经是很纯的神经细胞了。
但是,由于实验者等个人或者客观原因,血管膜可能不会被完全剥离;杂细胞可能也被吹入了细胞悬液;操作者手法不熟练,造成死细胞过多,影响种板等等原因,还是会影响到培养的神经元的质量。
为了克服这些,笔者查了一些文献,经过反复测试采用了nycoprep低转速密度-梯度离心。
现在这个梯度溶液已经被公司升级为optiprep.稀释时候,NycoPrep?
1.077推荐稀释成60%,就用刚才悬浮细胞的培养液来配置。
注意:
1.077被广泛应用于血液中分离血细胞,如果你拿到的nycoprep(optiprep)不是1.077,那么请换算一下稀释度)值得注意的是,皮层和海马可能需要的稀释度稍微有不同。
一般来说,一个10ml梯度离心管中,2-4ml稀释过的梯度液体就够用,取决于你收获的细胞量多少。
把你收获的细胞悬液小心的加到稀释好的梯度剂的上面一层,经过1500转(不是15000请注意)5-8分钟,神经元被高度压缩到梯度面和上面的培养液分界面那一层。
而最下面的梯度剂下的沉淀则是细胞团块,血细胞,杂细胞,以及部分小胶质细胞。
而最上层最浮头,则是细胞碎片。
这样,你就得到了最大限度去除了杂细胞,和细胞碎片,并去掉了一定的胶质细胞的最干净最纯粹的神经元。
如果实验者技术精湛,也可以不用这步,但是用这步会效果更好。
注意:
母液稀释到60%只是参考,具体实验室不同可能略微有差别,要摸条件而不是死记硬背。
另外皮层和海马浓度也稍微有差别。
有些文献曾经报道,在梯度一定的情况下,一些特定梯度可以分开神经元和少突和其他胶质细胞,但是笔者从来没成功过。
10.种板。
这一步没有那么非常重要,但是如果没认真弄,浓度的不均一也会使得整个实验失败。
记住的是,神经元
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