05 生物化学实验聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质.docx
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05生物化学实验聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质
聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质之勘阻及广创作
【目的】
1.掌握圆盘电泳分离血清蛋白的操纵技术。
2.熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。
【原理】
带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动,称为电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。
在电泳时,蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小,形状和所带的电荷量有关。
聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶,是由丙烯酰胺(Acr)单体和少量交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺(Bis)在催化剂过硫酸铵(Ap)和加速剂四甲基乙二胺(TEMED)的作用下发生聚合反应而制得的(其化学结构式见第2篇第1章)。
聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构,其网眼的孔径大小可用改变凝胶液中单体的浓度或单体与交联剂的比例来加以控制。
根据血清蛋白分子量的大小,学生实验一般选用7%聚丙烯酰胺凝胶分离血清蛋白质。
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效应的三重作用分离物质(见第2篇第1章),使样品分离效果好,分辨率较高。
一般醋酸纤维薄膜电泳只能把血清蛋白质分离出5~7条带,而聚丙烯酰胺凝胶电泳却能分离出十几条到几十条来(图3-4),是目前较好的支持介质,应用十分广泛。
图3-4血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱
根据凝胶支持物的形状分歧,分为垂直板电泳和盘状电泳两种,二者原理相同。
本实验采取的盘状电泳是在直立的玻璃管中,以孔径大小分歧的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物,采取电泳基质的不连续体系,使样品在不连续的两相间积聚浓缩(浓缩效应)成厚度为10-2cm的起始区带,然后再利用分子筛效应和电荷效应的双重作用在分离胶中进行电泳分离。
【器材】
1.电泳仪
直流稳压电源,电压400~500V,电流50mA。
2.垂直管型圆盘电泳装置
目前这类装置的种类很多,可根据分歧的实验要求选择其中的一种。
这类装置均由两个基本的部分组成,一部分为载胶玻璃管,须选用内径均匀(5~6mm),外径7~8mm,长80~100mm的玻璃管作为资料,也可以使用更细的玻璃管。
另一部分为电泳液槽,可分为上下两槽。
电泳时,上下两槽通过凝胶柱沟通电流(图3-5)。
图3-5聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图
(A为正面,B为剖面)
3.大号试管和中号试管
4.微量移液器
5.5ml注射器和9号注射针头
6.洗耳球、滤纸条、封口膜等
【试剂】
1.丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺
一般性的分析工作,用分析纯的Acr和Bis即可,精细的分析工作,尤其是分子量的测定和定量分析,需商品Acr和Bis进行重结晶,进一步纯化。
2.N,N,N',N'—四甲基乙二胺(TEMED)
商品TEMED即可,低温,避光保管。
3.10%过硫酸铵溶液(AP,W/V)
10g过硫酸铵定容到10ml,最好使用新鲜配制的溶液。
4.染色液
取三氯乙酸200g加水500ml,然后加入10g考马斯亮蓝R250用玻璃棒搅拌,待完全溶解后,再加入蒸馏水加至1000ml。
5.脱色液的配制
取三氯乙酸100g加蒸馏水溶解后加至1000ml。
6.储备液的配制
电极缓冲液、凝胶缓冲液及凝胶储备液配制见下表:
浓缩胶
缓冲液
Tris5.98g
1mol/LHCl48ml
加蒸馏水至100ml
PH6.7
凝胶储液
Acr30.0g
Bis0.8g
加蒸馏水至100ml
分离胶
缓冲液
Tris36.3g
1mol/LHCl48ml
加蒸馏水至100ml
PH8.9
凝胶储液
Acr30.0g
Bis0.8g
加蒸馏水至100ml
10×电极缓冲液
Tris6g
Gly28.8g
加蒸馏水至1000ml
PH8.3
储液配制好后放冰箱4℃冷藏备用,用时10倍稀释,学生用时大约3天需更换一次。
7.凝胶液的配制
分离胶和浓缩胶的配制见下表:
7%分离胶配制(ml)
3%浓缩胶配制(ml)
双蒸水
13.5
双蒸水
5.7
凝胶储液
7
凝胶储液
1
PH8.9缓冲液
7.5
PH6.7缓冲液
1.3
1%TEMED
2
1%TEMED
2
总体积
30
总体积
10
8.20%蔗糖
100ml取蔗糖20g,加少许蒸馏水溶解,最后加至100ml。
9.加样缓冲液的配制(PH6.7)
取1mol盐酸4.8ml,Tris0.6g,20%蔗糖溶液40ml,加水至80ml充分混匀后,再加入0.02g溴酚蓝,4℃保管备用。
【操纵】
1.凝胶系统的聚合和制备
一般先制备分离胶,然后再在分离胶上面制作浓缩胶。
(1)电泳玻璃管的准备
取一根洁净的电泳玻璃管,垂直放在青霉素瓶盖的凹穴中或用封口膜密封,备用。
(2)分离胶(小孔胶)的制备
取分离胶3ml放入试管,加入100μl10%Ap溶液混匀后使用。
用微量移液器抽取胶液小心迅速加入到玻璃管内,当加到液面距离电泳玻璃管上口2cm时停止(约1.6ml)。
注意在加的过程中不要混进空气,用过的注射器和针头要及时用水清洗,防止堵塞。
再在其上面小心覆盖0.5cm高的蒸馏水层(约0.2ml)以隔绝空气,并防止柱概况的弯月面。
加水过程中不要用力过猛,防止将液面胶液冲起。
刚加入水层时在水层和胶面的交接处可见一明显的折光面,此折光面会逐渐消失,等再次出现时标记分离胶聚合已经开始,应使玻璃管垂直静置约15~20分钟后,完成凝胶的聚合过程。
然后用滤纸小心吸去概况的水层,切勿破坏胶面的完整性。
(3)浓缩胶(大孔胶)的制备
取浓缩胶1ml放入试管,加入50μl10%Ap溶液混匀后使用。
用微量移液器吸取少量浓缩胶缓冲液漂洗一下分离胶的胶面,用滤纸吸取残留的缓冲液,滤纸尽量不要接触胶概况。
再加入约1cm高的浓缩胶(约0.25ml),概况也覆盖一层蒸馏水。
刚加入水层时在水层和胶面的交接处可见一明显的折光面,此折光面会逐渐消失,等再次出现时标记浓缩胶聚合已经开始,聚合20~30min后除去上面的水层,同样不要破坏胶面的完整性。
吸去水层后用电泳缓冲液漂洗胶面,再用电泳缓冲液注满至管口,在室温下放置10~20min后即可使用了。
2.样品的制备和点样
(1)样品的准备:
取兔血清0.5ml,加入3ml加样缓冲液混合。
可在4℃冰箱保管2周。
(2)点样:
将制好的胶管装入电泳槽中调节高度并塞紧,防止电泳中发生漏液。
然后分别在电泳槽的上下槽体内注入电泳缓冲液,下槽的液面应没过玻璃管的下管口(注意不要有气泡存在)和电极丝;上槽的液面应没过玻璃管口0.5~1cm。
用微量注射器吸取50μl样品;尺度蛋白样品1份(蛋白质含量1mg/ml,溶于加样缓冲液中)小心的加入玻璃管内,注意不要让样品溢出管口。
4.电泳
(1)电流电压条件
圆盘电泳:
直流稳流电流强度通常为4mA/管。
(2)电泳时间
一般约需3小时。
样品中溴酚蓝电泳至距分离胶前缘约1cm处时即可停止电泳。
5.剥胶
电泳结束后,取下玻璃管,用带长针头的注射器(内盛蒸馏水)从浓缩胶一端紧贴玻璃管壁缓慢拔出针头,一面注入蒸馏水一面缓慢旋转玻璃管。
靠水流的压力和润滑作用使凝胶和玻璃管的内壁分开,待水流从另一端流出时,再慢慢将针头退出(注意操纵中不要把胶条搅碎)。
然后用洗耳球轻轻在胶管的一端加压,将胶条从玻璃管中缓慢滑出。
6.染色和脱色
剥胶完毕后,将胶条放入染色液中过夜(16小时以上)。
将胶条以自来水冲洗两次,然后在脱色液中脱色约5分钟,共两次。
7.结果分析
脱色完全后,从脱色槽中取出凝胶(小心折断或撕裂),观察区带的数量及迁移率。
如果需定量,可进行区带扫描,计算出各区带中蛋白质的含量。
【注意事项】
1.制胶时必须以封口膜将管下口封严密,加AP后立即灌胶。
2.灌凝胶时不克不及有气泡,以免影响电泳时电流的通过。
3.电泳时,电泳仪与电泳槽间正、负极不克不及接错,以免样品反方向泳动,电泳时应选用合适的电流、电压,过高或者过低都会影响电泳效果。
4.电泳时,为包管电泳结果满意,最好使用新稀释的缓冲液。
5.丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺均为神经毒剂,对皮肤有刺激作用,操纵时宜带手套,纯化应在通风柜中进行。
【思考题】
1.聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物,有何优缺点?
2.哪些因素可以影响凝胶的聚合?
3.为什么在样品中加含有少许溴酚蓝的40%蔗糖溶液?
蔗糖及溴酚蓝各有何用途?
附:
1.分歧浓度聚丙烯酰胺凝胶的配制,见表3-2。
表3-2分歧浓度聚丙烯酰胺凝胶的配制
分离胶浓度
试剂名称
配制30ml分歧浓度分离胶液所需试剂量(ml)
配制10ml3%浓缩胶
7%
10%
12%
15%
20%
分离胶
储备液
缓冲液
7
7.5
10
7.5
12
7.5
15
7.5
20
7.5
浓缩胶
储备液
缓冲液
---
---
---
---
---
---
---
---
---
---
1.0
1.25
1%TEMED
蒸馏水
2
13.3
2
10.3
2
8.3
2
5.3
2
0.3
2
5.65
以上各液加入后,为了去除抑制凝胶聚合的氧,在加入Ap之前应进行抽气处理。
10%过硫酸胺
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.1
2.几种染料的性能及染色原理
(1)氨基黑10B(aminoblack10B)
C22H13O12N6S3Na3,MW=715,λmax=620~630mm。
氨基黑是酸性染料,其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐。
是最经常使用的蛋白质染料。
缺点是灵敏度不太高,对SDS—蛋白质染色效果欠好,对分歧的蛋白质着色度分歧,色调纷歧(有蓝、黑、棕等)。
(2)考马斯亮蓝R250(ComassiebrilliantblueR250):
C45H44O7H3S2Na,MW=824,λmax=560~590mm,原理与氨基黑相似,灵敏度比氨基黑高5倍。
尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。
但蛋白质浓度超出一定范围时,对高浓度蛋白质的染色分歧乎Beer定律。
(3)考马斯亮蓝G250:
比考马斯亮蓝R250多2个甲基,MW=854,λmax=590~610mm。
染色的灵敏度不如R250,但比氨基黑高3倍,优点在于它在三氯乙酸中不溶解成胶体,能选择地染蛋白质而几乎无本底色。
所以经常使用于需重复性染色和稳定性的染色,适于定量分析。
聚丙烯酰胺不连续盘状电泳和垂直板电泳基来源根基理是相同的。
后者适用于需要对比性分析的样品的电泳分析。
这项电泳技术(PAGE)由于能够使样品区带浓缩变窄,所以分辨力高、设备简单、样品量小(1~100μg);时间短,操纵方便,可分离生物大分子的分子大小范围广泛,可结合SDS后进行亚基分析和分子量测定。
这种方法目前几乎代替了超速离心沉降法。
PAGE的用途较广,对生物大分子能进行分离、定性、定量分析,又能用于制备mg水平的资料。
3.蛋白质染色方法(表3-3)
表3-3蛋白质染色方法
方法
固定液
染液
染色时间
脱色
氨基黑10B
甲醇或
7%乙酸
或7%乙酸-1%氨基黑
5min(室温)
2h(室温)或
10min(96℃)
5%乙醇,过夜
7%乙酸,过夜
考马斯亮蓝R250
10%三氯乙酸
20%三氯乙酸-1%R250
过夜
10%三氯乙酸
考马斯亮蓝G250
10%乙酸
20%乙酸-1%G250
10min(室温)
甲醇-水-浓氨水
64∶36∶1
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