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论文姚美红
摘要
鲢鱼Hypophthalnichthysmolitrix是我国重要经济鱼类,鲢鱼是世界上为数不多的能够直接利用水域初级生产力的鱼类之一,因此,它既是天然水域鱼类资源增殖的重要对象,也是池塘养鱼的主要对象。
由于,在长期的养殖过程中难免存在种质资源的退化和品种混杂等问题,使其鱼类在分类低位的研究受到限制,传统的分类学方法有时并不足以解决分类和系统进化中的一些疑点。
线粒体基因组(MitochondrialDNA,mtDNA)与核DNA相比,具有无组织特异性、严格的母系遗传、基因组拷贝数多,进化速率快等独特的遗传特征,是研究鱼类进化生物学和群体遗传学研究的重要分子标记。
本研究利用PCR及DNA测序技术获得鲢鱼mtDNA控制区全序列,长度为1016bp,。
所分析序列T、C、A和G的含量分别为29.0%、25.4%、29.9%和15.8%,转换/颠换值为1.2,其中A+T含量(58.9%)高于C+G含量(41.2%)。
并与从NCBI网站中查询得到的8种鲤科鱼,包括的鲤、青鱼、鲫鱼、鳙鱼、草鱼、红鳍鲌、团头鲂、鲮鱼mtDNA中的D-Loop区的序列,利用MEGA软件比较以上8种鲤科鱼的D-Loop区序列,结果显示,保守位点数为1007个,变异位点数为9个,简约信息位点数为7个,计算得到的几种鲤科鱼的遗传距离是从0.095-0.424,数值变动较大,明显是经过了的基因变异、漂变和遗传进化。
然后通过软件MEGA4.0分析作图得到相应的鲤科鱼的NJ、ME和MP三个进化图谱即进化树,得出鲢鱼在鲤科鱼中的遗传进化及其分类地位,结果显示鲢鱼与青鱼的关系最近,由于鲢鱼在形态学上的分类均隶属鱼鲤形目、鲤科、鲢属,青鱼隶属于鲤形目,鲤科,青鱼属。
两种分类方法得到的结论不同。
本研究为水产养殖鱼类的遗传育种、起源进化研究和遗传资源保护提供了一定的研究数据。
关键词:
线粒体DNA;D-Loop;鲢鱼;分类地位
Abstract
SilvercarpHypophthalnichthysmolitrixisanimportanteconomicfish.Itsnaturaldistributionisverybroad,northofHeilongjiang,southtothePearlRiverandeventheRedRiver.Thesilvercarpisoneofthefewabletodirectlyusetheprimaryproductivityofthewatersoffish,therefore,bothimportantobjectoftheproliferationoffishresourcesinnaturalwaters,themainobjectofthefishpond.Existsinthegermplasmresourcesdegradationandvarietiesmixedinthelong-termbreedingprocess,sothatthefishintheclassificationoflowrestricted,traditionaltaxonomicmethodsaresometimesnotenoughtosolvesomeoftheclassificationandphylogeneticdoubt.Mitochondrialgenome(MitochondrialDNAmtDNA)andnuclearDNA,withtissue-specific,strictmaternalinheritance,andgenomiccopynumber,evolutionaryrateandtheuniquegeneticcharacteristicsofthefishevolutionarybiologyandpopulationgeneticsthestudyofmolecularmarkers.Inthisstudy,PCRandDNAsequencingtechnologytoobtainpartofthegeneofHeilongjiangwaterssilvercarpwildpopulationsofmtDNAcontrolregion,alengthof1016bpconservativelociof1007,variablesitesforthenineparsimony-informativelociforseven.AnalyzedthesequenceT,C,AandGcontentof29.0%,25.4%,29.9%and15.8%,transition/transversionof1.2,theA+Tcontent(58.9%)higherthantheC+Gcontent(41.2%).TheLOOPpartoftheD-andquerycommoncarpfromtheNCBIwebsite,includingcarp,blackcarp,cruciancarp,bigheadcarp,grasscarp,redfinsCulter,bream,dacemtDNAgenescomparedwiththeotherfishofthesamefamilyasthetransition/transversionof1.1.Thegeneticdistanceofseveralcyprinidfishcalculatedfrom0.095-0.424,numericalchangesinlarge,obviouslyafterthegenemutation,driftandgeneticevolution.ThenthroughsoftwareMEGA4.0analysismappingcyprinidfish,NP,MEandMPthreeevolutionarymapofthephylogenetictreeobtainedgeneticevolutionanditstaxonomicstatusofwildpopulationsoftheHeilongjiangRiversilvercarpinthecarp,TheresultsshowedthattherelationshipofwildpopulationsofherringintheHeilongjiangsilvercarp,silvercarpinthemorphologicalclassificationattachedtothefish,carp-shapedhead,carp,silvercarpandthecaseofherringbelongingtoCypriniformes,Cyprinidae,herringis.Twoclassificationmethodsarefundamentallydifferentconclusions.Thisstudyprovidesnewevidencefortheclassificationoftherelationshipofthefish,aswellasthegeneticbreedingofaquaculturefish,theoriginofevolutionarystudiesandconservationofgeneticresourcestoprovideacertainamountofresearchdata.
Keywords:
mitochondrialDNA;D-LOOPgene;silvercarp;classificationoflow
前言
鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)又叫白鲢、水鲢、跳鲢、鲢子,属于鲤形目,鲤科,是著名的四大家鱼之一。
鲢鱼属于中上层鱼,典型的滤食性鱼类,春夏秋三季,绝大数时间在水域的中上层游动觅食,冬季则潜至深水越冬。
鲢广泛分布于亚洲东部,在我国各大水系,均有分布;其生长速度快、产量高。
同时,鲢的食物为浮游植物,因而成为饲养鱼类的上等鱼品,历来被列入我国淡水养殖的“四大家鱼”之一。
线粒体作为半自主性细胞器,其生长和增殖受核基因和线粒体基因组两套遗传体系的协同控制。
早在1949年Ephrussi在啤酒酵母中发现线粒体中含有DNA,1963年M.nuss和S.nass用电镜证实了线粒体中含有DNA,Barsta等1996年首先由鸡肝中利用氯化钙密度梯度离心分离得到线粒体的DNA,以后由不同的高等动物组织细胞中分离处理线粒体DNA并对其结构、性质及功能进行了深入的研究。
线粒体DNA(mitochondrialDNA,mtDNA),作为一种结构相对简单的基因组一起了人们广泛的研究兴趣[1]。
动物线粒体基因组的长度大多在15-20kb左右,环状双链,根据碱性氯化铯密度梯度离心中双链密度不同分为重链(H链)和轻链(L链),由2个rRNA基(16SrRNA、12SrRNA)、22个tRNA基因、控制区(D-Loop环区)和轻链复制起始区和13个疏水蛋白质基因。
13个蛋白质因是细胞色素b(Cytb)基因,2个ATP酶的亚基,3个细胞色素c(Cytc)氧化酶的亚基(COI,COII,COIII),7个NADP还原酶的亚单位(ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6),除一个蛋白质基因(ND6)和8个tRNA基因由L链编码外,其余的大部分基因都由H链编码[2]。
各基因间排列紧密,非编码序列比例小,基因排列的顺序基本一致,只有鸟类(如鸡)稍有改变,基因内不含内含子,碱基的使用节约、高效[3]。
MtDNA中的12SrRNA、16SrRNA等rRNA基因、D-loop、Cytb和ND4等基因常被选做为分子标记[4-5]。
其中控制区(controlregion)又称D-环区(D-loop,displacementloopregion),一般位于tRNA-Pro和tRNA-Phe基因之间,是整个mtDNA基因组序列和长度变异最大的区域,其进化速率是mtDNA其他区段的2-5倍[6],但其中也包含一些保守片段。
控制区的终止结合序列区包含与DNA复制终止相关的序列TAS,位于控制区的5’端,拷贝数在l-8个之间,是mtDNA长度变异的主要原因。
拷贝数不仅种间有差异,种内个体间也存在差异,只是小于种间。
一般每个重复序列中都含有一个保守的TAS,TAS可能是与H-链复制终止有关的信号。
刘焕章等人[7]在对比多种鱼类的序列后确定鱼类中的ETAS为TACATAT--------ATGTATTATCACCAT-ATAT-TATATTAACCAT(“-”表示发生变异的碱基,即转换、颠换或缺失)并在研究鳑鲏鱼类的mtDNA控制区的结构时发现彩副橘(Paracheilognathusimberbis)的终止结合序列区为232bp,没有明显的重复、长片段的缺失和插入,发现一个TAS,其中含有核心序列ACAT;高体鰟鲏(Rhodeusocellatus)终止结合序列区为340bp,其中有两处不完全重复,都含有多个TAS的反向互补序列ATGT;大鳍鱊(Acheilognathusmacropteerus)的终止结合序列区为442bp,其中有一段59bp的不完全重复,重复序列也含有TAS的反向互补序列AT-GT。
郭新红等人[8]识别了不同倍性鲤科鱼中的ETAS为TACATAT--------ATGTATTATCACCAT-----TATATTAACCA-,并发现红鲫、鲤鱼、异源四倍体鲫鲤和三倍体湘云鲫中分别含有4个TACAT核心序列,日本白鲫中含有3个TACAT核心序列,三倍体湘云鲤含有1个TACAT核心序列,而斑马鱼(Brachydaniorerio)中含有6个TACAT核心序列。
传统的鱼类分类学综合了外形、骨骼、食性以及生活史等各个方面对鱼进行分类,但有些种内的分化特征无法利用传统方法进行进一步的分类。
基于分子遗传学的D-Loop分子标记便能够有效地检测到传统形态学所无法辨别的种群分化,甚至能发现亚种的存在。
本研究的对象是鲢鱼为研究对象,利用PCR技术获得线粒体D-Loop区的全序列,由生物公司测序。
获得序列后,用MEGA4.0软件计算碱基含量百分率、变异位点数、简约信息位点数、转换/颠换比等,并计算群体内以及群体间遗传距离(D);将所得D-Loop区序列,利用MEGA4.0软件中基于Kimura双参数模型的NJ法(Neighbor-Joiningmethod)、ME(MinimumEvolutionmethod)法和MP(MaximumParsimony),以为鳕鱼为外群同常见的其它鲤科鱼,包括鲤鱼(Cyprinuscarpio)、青鱼(Mylopharyngodonpiceus)鲫鱼(Carassiusauratusauratus)、鳙鱼(Aristichthysnobilis)、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)、红鳍鲌(Cultererythropterus)、团头鲂(Megalobramaamblycephalaus)以及鲮鱼(Cirrhinusmolitorella)的D-Loop区相比较,重建了鲤科鱼的系统发生树,采用Bootstrap(重复数=1000)检验分子系统树各分支的置信度,比较分析鲢鱼在鲤科鱼中的分类地位及变异系数,为鲢鱼种质资源的保护、合理利用和遗传育种提供可靠的数据和理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1主要试剂和仪器设备
1.1.1.1主要试剂及配制方法
Goldview荧光染料、DL-2000DNAMarker、DreamTaqTMGreenPCRMasterMix、酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、硼酸、Tris-base、EDTA-Na2、十二烷基肌氨酸钠、蛋白酶K、去离子H2O、琼脂糖等。
常用试剂的配制参照《分子克隆实验指南》[9]。
(1)0.5mol/LEDTA(pH8.0):
在100mL水中加入46.53g乙二胺四乙酸二钠(Na2·EDTA·2H2O),用氢氧化钠(NaOH)5g调pH8.0,加水定容250mL。
(2)1mol/LTris-HCL(pH8.0):
在300mL水中加入60.57g三羟甲基氨基甲烷(Tris),溶解后加入12mL的盐酸(HCl)调至pH8.0,加水定容至500mL。
(3)10×TE(1mol/LTris-HCl,0.5mol/LEDTA,pH8.0):
在100mL的水中加入20mL1mol/LTris-HCl(pH8.0)和4mL0.5mol/LEDTA(pH8.0),加水定容至200mL。
(4)1×TE:
在100mL的水中加入20mL10×TE,加水定容至200mL,灭菌备用。
(5)0.1×TE:
在100mL的水中加入20mL1×TE,加水定容至200mL,灭菌备用。
1.1.1.2仪器设备
(1)电子天平(良平仪器JY1002型)
(2)数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司HH6型)
(3)PCR自动循环仪(杭州生物技术有限公司Class
IP20型)
(4)高速离心机(科大创新股份有限公司HC-2518型)
(5)电泳仪(北京百晶生物技术有限公司BG-Power3500型)
(6)电泳槽(北京市六一仪器厂DYCP-31DN型)
(7)凝胶成像分析仪(捷达科技有限公司DFV00402型)
(8)-20/4℃冰箱(青岛海尔股份有限公司BCD-212DC型)
(9)微波炉(乐金电子天津电器有限公司WP700MS-2011M型)
(10)立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂LDZX-50KB型)
(11)EppendorfResearch可调量程移液器(德国Eppendorf公司0.5-10μL,10-100μL)
(12)精密电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司BT124S型)
1.1.2基因序列分析工具
(1)Chromas:
Chromas应用程序可以用查看和编辑DNA的峰形图,根据DNA的峰形图去掉不准的片段。
(2)NCBI(美国国立生物技术信息中心):
分子生物学数据库和分析序列数据资源。
(3)ClustalX:
ClustalX用来对核酸与蛋白序列进行多序列比较(multiplesequencealignment)的软件。
(4)MEGA4.0:
MEGA4.0可用于序列比对、进化树的推断、估计分子进化速度、验证进化假说等。
1.1.3材料获得
采取鲜鲢鱼的尾鳍,70%乙醇保存于-20℃冰箱。
样品名称采自黑龙江抚远江段,为野生样本。
1.1.4外群的选择
外群应是在分类学上和内群关系密切且进化级别低于内群的种类[10],外群可以在基因树上给内群定根,一般选择系统发育上和内群互为姐妹群的类群作为外群,本研究选择鳕鱼作为外群分析鲢鱼与其他鲤科鱼类之间的亲缘关系[11]。
1.2方法
1.2.1基因组DNA提取
(1)取尾鳍鳍条0.1g,剪碎,将其放入先前加有200μL裂解液(EDTA(pH8.0):
200mmol/L;十二烷基肌氨酸钠:
1%;ProteinaseK:
200μg/mL)的1.5mL的PE离心管中。
(2)将样品放在50℃的数显恒温水浴锅中温育3-4h,并不时轻轻摇动,至组织完全消化后取出。
(3)在消化的样品加入等体积饱和苯酚、氯仿、异戊醇混合液(体积比25:
24:
1)400μL抽提,缓慢地来回颠倒PE离心管30min,混合两相。
(4)将混合好的PE离心管放入离心机,5000r/min,离心10min。
(5)用大口径移液器取上清液移至另一PE离心管中,再重复抽提2次。
(6)在上清液中加入2倍体积的无水乙醇沉淀,放于-20℃下静置。
(7)将PE离心管放入离心机,12500r/min,离心15min。
(8)再用70%乙醇洗涤,12500r/min,离心5min。
(9)然后晾干,加入100μL的1×TE(pH8.0)溶解,4℃保存备用。
1.2.2浓度梯度检测
DNA提取后,分别按照1×、10×、50×和100×进行稀释,以稀释后的样本作为模板,进行最适浓度检测。
PCR反应体系为25μL,包括DreamTaqTMGreenPCRMasterMix12.5μL、上下游引物(10μmol/L)各1μL、模板DNA1μL,加9.5μLddH2O。
扩增反应均在Class
IP20型PCR仪(杭州生物科技有限公司)上完成,按以下程序进行:
94℃10min;94℃45s,55℃45s,72℃45s,共35个循环;72℃延伸10min,引物序列及参考文献见表1。
采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的。
首先制备1%的琼脂凝胶:
0.3琼脂糖至于锥形瓶中,加入30mL5×TBE,瓶口用保鲜膜盖住,微波炉加热煮沸至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1%琼脂糖凝胶液,冷却至60℃,然后向内滴入1.5μL的Goldview(约1/20体积的Goldview,浓度为10mg/L),摇匀后倒入制胶板中冷却至室温,然后将制好的琼脂糖凝胶放入电泳槽中备用。
用0.5-10μL的EppendorfResearch可调量程移液器(德国Eppendorf公司)吸取5μL样品加入凝胶孔中,110V电压下电泳20-25min后,用DFV00402(捷达科技)凝胶成像仪照相,根据凝胶成像结果,选择稀释100×为最适浓度,将所有样本进行稀释备用。
表1引物、退火温度及参考文献
引物序列(5’-3’)
退火温度
参考文献
D-loop
SA05’-CATGCCGAGCATTCTTTT-3’
SB05’-GAGACTTGCATGTGTAAG-3’
SA175’-GGTCTTGTAATCCGAAGATC-3’
SB175’-GGGGTTTGACAAGGATAA-3’
55
[12]
1.2.3引物序列与PCR反应
采用通用引物(见表1),用于扩增D-Loop区序列。
PCR反应体系为50μL,包括DreamTaqTMGreenPCRMasterMix25μL、上下游引物(10μmol/L)各2μL、模板DNA2μL、,19μLddH2O。
扩增反应均在Class
IP20型PCR仪(杭州生物科技有限公司)上完成,按以下程序进行:
94℃3min;94℃50s,55℃60s,72℃60s,共35个循环;72℃延伸10min。
采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,DFV00402(捷达科技)凝胶成像仪照相检测后,PCR产物由生物公司纯化后测序(上海生工生物工程技术服务有限公司)。
1.2.4序列分析
测得序列后,将序列与NCBI中GenBank数据库进行BLAST比对,确定序列的准确性。
利用Chromas软件去掉不准确的序列,并使用ClustalX软件进行序列的对位排列[13],截取比对后相同长度的序列。
用MEGA4.0软件[14]分析序列的碱基组成和差异百分比、保守位点数、变异位点数、简约信息位点数和转换/颠换值,根据Kimura双参数模型计算群体内和间的遗传距离(D)。
利用MEGA4.0软件[16]中基于Kimura双参数模型的NJ法(Neighbor-Joining)、ME法(MaximumEvolutionmethod)和MP(MaximumParsimony)重建了鲤科鱼类的系统发生树,采用Bootstrap(重复数=1000)检验分子系统树各分支的置信度。
2结果与分析
2.1DNA的提取结果与分析
采用常规酚氯仿法提取的鲢鱼总基因组DNA,1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的纯度,结果显示所提取的DNA无污染,效果较好,可以直接应用于PCR扩增。
图1基因组DNA电泳检测
2.2PCR结果与分析
运用PCR技术成功获得产物后,利用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测,根据电泳结果(见图2),挑选扩增稳定,且浓度、纯度较好,无杂带干扰的样品送生物公司测序。
图2PCR结果电泳检测
2.3序列的特征
利用NCBI中的BLAST程序进行网上比对,确定所获得序列为鲢鱼mtDNA的D-Loop基因部分片段。
从NCBI网站中搜索得到的鲤、青鱼、鲫鱼、鳙鱼、草鱼、红鳍鲌、团头鲂、鲮鱼的D-oop区的部分序列(GenBank号见表3),与鲢鱼D-Loop区序列相比较,利用MGEA4.0软件对比分析得到的结果(表3)。
鲢鱼的D-loop区基因序列T,C,A,G含量分别为33.6%,14.2%,31.4%,20.7%,全长为1167bp。
在其他8鲤科鱼的
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