第五章培养条件对铜绿假单胞菌定殖香蕉组培苗的影响.docx

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第五章培养条件对铜绿假单胞菌定殖香蕉组培苗的影响

12345分类号：

单位代码：

10389

密级：

（没有不用写）学　　号：

（S/B）

福建农林大学硕士论文

香蕉内生菌群落结构多态性及其枯萎病生防菌筛选

学科门类：

一级学科名称：

二级学科名称：

研究方向：

植物病理学

研究生：

焦会民

指导教师：

王宗华博士、研究员

刘波博士、研究员

完成时间：

二OO八年四月

目录

中文摘要1

英文摘要2

第一章综述3

1枯萎病的生物防治研究进展3

2生防细菌的来源4

2.1.植物内生细菌4

2.2防病机制5

2.3竞争作用5

2.4拮抗作用7

3植物内生菌研究进展及其存在的问题9

4生防细菌的定殖研究10

4.1内生细菌的定殖10

5宿主一内生菌一内生菌之间的关系12

5.1宿主与内生茵关系12

5.2内生菌之间相互关系13

第二章香蕉内生菌群落结构多态性研究14

1.材料与方法14

1.1试验材料14

1.2内生细菌的分离14

1.3内生细菌脂肪酸鉴定15

2.结果与分析16

2.1不同品种内生菌数量及种类差异16

3小结与讨论20

第三章香蕉枯萎病内生拮抗细菌的筛选及鉴定21

1材料与方法21

1.1供试材料21

1.2培养基21

2结果与分析23

2.1对枯萎病具有拮抗作用的内生细菌的筛选以及不同拮抗细菌的比较23

2.2对枯萎病具有拮抗活性的内生细菌的筛选25

2.3铜绿假单孢菌的测定26

第四章不同培养条件对香蕉内生生防菌生长的影响31

1材料与方法31

1.1供试菌株31

1.2铜绿假单孢菌生长曲线的测定31

1.3不同培养时间下对铜绿假单胞菌生长状况的影响31

1.4培养基不同初始ph值对一株铜绿假单胞菌株生长的影响31

1.5不同温度对铜绿假单胞菌定殖香蕉组培苗影响32

2.结果与分析32

2.1铜绿假单孢菌生长曲线的测定32

2.2不同培养时间下对铜绿假单胞菌生长状况的影响33

2.3培养基不同初始ph值对346号铜绿假单胞菌株生长的影响34

2.4不同培养温度下对铜绿假单胞菌生长状况的影响34

2.5不同培养时间下菌株ph值的测定35

第五章培养条件对铜绿假单胞菌定殖香蕉组培苗的影响37

1材料与方法37

1.1供试菌株37

1.2.香蕉组培苗内生菌的分离及鉴定37

1.3不同温度对铜绿假单胞菌定殖香蕉组培苗影响38

1.4不同接种浓度对铜绿假单胞菌定殖的影响38

1.5不同接种浓度对铜绿假单胞菌定殖的影响38

2结果与分析39

2.1香蕉组培苗内生菌的分离及鉴定39

2.2尖孢镰刀菌回接香蕉盆栽苗致病性检测40

2.3不同温度对铜绿假单胞菌定殖香蕉组培苗影响40

2.4不同接种浓度对铜绿假单胞菌定殖的影响（菌液直接加入）41

2.5不同接种浓度条件对铜绿假单胞菌定殖香蕉组培苗影响（浸根法）41

第六章总结与展望42

参考文献43

致谢47

中文摘要

枯萎病是一种毁灭性的土传病害，该病的生物防治已经受到世界各国的极大关注，为获得优良性状的生防菌直接为生产服务，本论文从菌种鉴定筛选鉴定，抑菌机理，发酵条件，定植状况，等方面对香蕉枯萎病的生防细菌进行了较系统的研究。

以香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌为靶标菌，对福建省漳浦县的两株香蕉植株和一株米蕉植株进行进行了分离和拮抗细菌的筛选。

同时对部分菌株进行了鉴定。

另外，对本试验室的四株对枯萎病有拮抗作用的铜绿假单孢菌进行了筛选，选取一种进行了生理生化实验，并对这株菌进行了微生物试验，以及对其侵入组培苗的条件进行了初步探索。

关键词，香蕉枯萎病内生细菌，内生生防菌

英文摘要

Abstact

Fusariumwiltisadestructivesoil-bornediseaseofthecrops.Ithasbeenpaidmoreattentiontobiocontrolofthediseasebymanycountries.Toobtainsatisfactorybiocontrolagentsforthesuccessfulmanagementthepresentstudywasundertakeninantagonisticbacteriascreening,mechanismsofthediseaseinhibition,conditionsforcolonization,againstthepathogen.。

ThepotentialbiocontrolbacteriaagainstFusariumoxysporumf.sp.radicislycopersicicausingbananawiltwerescreenedfromthreebananatreesand（zhanzhangcityFujianProvinces）byplateinhibitionmethod。

Andpartsofthemareidentified.

Otherwise,4Pseudomonasaeruginosthatshowedstrongantagonisticeffectagainstthepathogen,iscollected.,andmakePhysiologicalandBiochemicalexperiment,Andmicroorganismexperiment.seekfortheconditionthatinvadeandincreaseinthebananatrees.

Keywords:

bananaFusariumwil,antagonisticbacteria,antagonisticbacteria

第一章综述

1枯萎病的生物防治研究进展

植物枯萎病是由镰刀菌寄生引起的一种世界性的真菌土传病害，其主要的致病菌是尖孢镰刀菌（FusariumoxysporumSchl.），病原菌从根部为害植物，引起维管束病害，造成植株枯死，在植株的全生育期均可发生。

该病害在3-4年内就会由零星点片发展为普遍流行性病害，以瓜类枯萎病为例，病田一般减产20％-30％、严重田块可达50％-60％，甚至绝产。

目前，在世界范围已报道的被严重为害的经济作物有棉花、甘蔗、香蕉、番茄、黄瓜、节瓜、冬瓜、西瓜、南瓜、西葫芦、甜瓜、丝瓜、白瓜（越瓜）、苦瓜、葫芦瓜、哈密瓜、四季豆、豇豆等。

目前，对于该病的防治主要有抗病育种法、轮作换茬法以及最广泛采用的药剂防治法等。

但抗病品种的抗病能力维持时间较短且目前品种的抗性与丰产、优质还未达成有机的统一；由于土地资源有限，轮作方法也不易实施；一直以来，化学防治是控制土传病害的主要手段，但随着化学农药的大量使用，产生了环境污染、农药抗性及农药残留等令人担忧的问题，而且迄今为止还没有一种化学农药可以有效地控制枯萎病的发生。

因此，利用微生物及其代谢产物等生物农药进行防治，使用对人体和生态环境无害的生防菌剂替代化学农药已成为世界范围内的发展方向。

香蕉是我国南方的五大名果之一，是国内消费和出口创汇的一个重要资源。

但是，随着香蕉生产的发展，香蕉病害的危害也日益严重，尤其是香蕉枯萎病给我国香蕉生产带来极大的威胁，加强香蕉枯萎病的防治迫在眉睫。

香蕉枯萎病是一种毁灭性病害，一种靠土壤和苗木传播的真菌性病害，通过灌溉水流动和染病吸芽繁殖材料传播。

虽然该病已经受到国内外的关注，但是到目前为止，对该病的防治方面仍不容乐观。

目前推广的抗病品种（舒肇苏.2002）（台蕉1号、2号、GCTCV-215—1等），农艺性状不佳（产量低、植株太高），品质较差。

采用土壤清洁措施均无效果，生长期使用杀菌剂药液灌溉法，防治效果也不理想（林兰稳，2003），而且长期使用化学农药容易引起抗药性，影响生态环境，对香蕉的品质，生产，出口等方面也不利。

因此无公害控制病害已成为植保工作者的目标，而香蕉枯萎病生物防治已经成为各国研究的热点，国外研究者分离获得链霉菌（Gethak，Vikineswary.2002），荧光假单胞（ThandaveluR，Paaniswami2003），枯草芽孢杆菌（Chao-YingChen.2005），绿农杆菌（TingASY，MenonS，KadirS，EtAl2003）对香蕉枯萎病具有明显的抑制作用；Perez-Vicente（2003？

）等研究报道，抗病品种的种植与生防菌的施用相结合，对香蕉枯萎病的防效达95%以上（PerezⅥCenteL，BatlleA，FonsecaJ，EtA1.2003）；说明生物防治香蕉枯萎病是完全可行的。

我国从事香蕉枯萎病生物防治的研究刚刚起步，2003年，曹理想等从香蕉组织内分离到几株内生菌对该病有不用程度的抑制作用，但抑制效果不理想（曹理想，2003）。

本课题组从果园土壤中分离到几株对香蕉枯萎病菌有及其显著抑制作用的拮抗菌，并对这些拮抗抑制香蕉枯萎病菌的作用进行了测定，为开发香蕉枯萎病的生防制剂打下基础。

2生防细菌的来源

高等植物在充满微生物的环境中生长发育，由于其共同进化产生不同类型的微生物-寄主植物关系。

根据生境不同，微生物可分为附生和内生两类。

附生菌（epiphyte）是指在寄主体表生长的微生物，根据附生部位又可分为根际（rhizosphere）微生物和体围（phyllosphere）微生物两类（王金生，1999）。

植物内生菌是指存在于植物体内对植物没有危害的一类微生物，能够定殖在植物细胞间隙或细胞内，并与寄主植物建立和谐联合关系。

2.1.植物内生细菌

植物内生细菌与寄主之间相互依存、互相制约的关系，是内生细菌应用研究的基础。

一般认为，植物内生细菌作为植物微生态系统中天然组成成分，它们可能促进了寄主植物对环境的适应，加强了系统的生态平衡。

Kostka（1993）将Bt基因构建于玉米内生细菌木质棍状杆菌犬齿亚种（Clavibacterxylisubsp．cyndontis）中进行玉米螟虫生物防治。

由于此实验的成功，许多研究者都认为植物内生细菌是一个很好的外源基因载体。

目前对植物内生细菌的研究主要涉及两方面的内容。

一是内生细菌是否是植物病害潜在的感染源。

二是对内生细菌的生态学、生物多样性以及群落分析的生态学研究：

把栖息于宿主组织内的全部细菌群落包括病理学范围的潜伏的或条件致病的一些病原细菌认为是植物微生态系统的正常群落。

整个植株是一个复杂的微生态系统。

高等植物分为根、茎、叶、花及果实、种子。

这些不同的部位都是植物正常微生物群的不同生境，其间存在着一系列不同的微生物群落。

在健康植物微生态系统中，这些微生物群落通过相互作用建立了一种微生态平衡。

2.2防病机制

人们普遍认为拮抗细菌的防病促生机制是几种或多种机制协同起作用（Alabouvettetal，1993）。

了解生防细菌的生防机制，以便有针对性地加以利用，有目的地改进剂型及使用方法，使其生防潜力得到最大限度的发挥，对于成功、高效地利用生防细菌防治作物病害具有十分重要的意义。

细菌拮抗土壤有害微生物的机理涉及竞争（Mark，1992；Yaya，2000）、拮抗（Stein，2002）、寄生（林茂松，1993）（图1）？

、促进植株生长（徐进，2004）、诱导植物抗性（陈志谊，2001）、致弱（刘波，2004）等方面。

2.3竞争作用

生防菌和病原菌之间的竞争包括营养物质的争夺、物理位点和生物学位点的抢占等。

生防细菌对生态环境具有极强的适应能力，再加上其代谢迅速、繁殖快，在空间的占领及其它方面的竞争中处于有利地位，生防菌优先占领一定的生存空间后，形成一层天然的物理屏障来抵御病原菌的侵染。

生防菌可以通过营养如C，N源竞争，使病原菌丧失充足的营养从而生长受到限制。

另外，生防细菌产生嗜铁素（siderophore）竞争Fe离子，抑制病原菌的生长也是一个重要的生防机制（Bakkeretal，1986；Elad&Baker，1985；Snehetal，1984）。

生态位的排斥是生防细菌拮抗病原菌的另一重要机制（Sulow&Schroth，1982）。

根上的特殊位点如细胞间隙和根伸长处，存有大量根分泌物，有利于细菌定殖。

图1拮抗菌与病原真菌的相互作用（Johanssonetal，2003）

Fig1Mcrobialantagonismagainstpathogenicfungi

接种混有生防细菌的肥料可以阻碍病原菌在这些位点的定殖。

拮抗微生物与病原菌对植物寄主分泌的营养的竞争是一个普遍的现象。

如在棉花种子的分泌物中，含有亚油酸等长链脂肪酸，它们是Pythiumspp.孢子萌发所必须的。

而阴沟肠杆菌Enterobactercloacae和Pseudomonasspp.也利用这些长链脂肪酸作为营养物质。

当转座子插入到E.cloacae的faoB基因而使E.cloacae失去亚油酸利用能力以后，其生防作用也就随之丧失了。

但把野生型faoB基因导入该突变体而使之恢复利用亚油酸的能力后，突变体的生防能力又得到恢复。

这些结果证明，E.cloacae是通过对种子分泌物中的长链脂肪酸的竞争性利用而抑制病原菌（vanDijketal，1997a；1997b）。

微生物在根部的实际密度与根表面积之比非常低，因此有人认为生防菌空间位点的竞争不是其主要的生防机制，比如Weller（1988）认为细菌在根围定殖的过程中主要是竞争营养而不是竞争空间。

2.4拮抗作用

拮抗作用是指生防菌能够产生对病原菌具有拮抗作用的物质，这些物质包括：

①毒素；②溶菌酶或蛋白酶等，如果胶酶、葡聚糖苷酶、蛋白酶、几丁质酶、磷脂酶等；③缺陷型噬菌体；④具有抗菌作用的代谢产物，如氨类、有机酸等初始代谢的副产品和其它次生代谢物；⑤抗生素；⑥细菌素或细菌素类似物等（Davies，1990）。

如几丁质酶、抗生素、细菌素等，这些物质通过干扰敏感病原菌的代谢过程而限制、控制或影响病原菌的生存活动，甚至杀死病原菌。

如放射土壤杆菌所产生的细菌素A84能影响根癌细菌体内的高能运输系统，干扰其吸收作用（Kerr，1980）；软腐欧式杆菌的细菌素能引起敏感细胞中磷脂的降解（王金生，1985）。

通常在培养皿中看到的抑菌圈就是抗菌物质作用的表现。

一般所产生的抗菌物质都是有机物质，它们在低浓度下就能对其他微生物的生长和代谢产生抑制效应，由于从死亡的细胞还可以释放出抗菌物质，所以即使是产生抗菌物质的微生物已经停止生长，但抗菌物质所产生抗菌作用还在继续发挥，抗菌作用是比较稳定的。

几丁质是多数真菌细胞壁以及无脊椎动物体壁的主要结构成分，许多细菌、真菌及受诱导后的植物，在合适的条件下，能产生一些水解酶，将病原菌细胞壁水解。

目前，研究较多的水解酶为几丁质酶和β-1，3葡聚糖酶，人们己对这两种酶的性质及抑菌活性做了广泛研究，这两种酶的酶解活性和抑菌范围各不相同，两种酶混合作用时，可增加抑菌范围（Fridlenderetal，1993；Inbar&Chet，1991；Limetal，1991；Ordentlichetal，1988；但汉鸿，1998）。

细菌素是由细菌的某些菌系所产生的对该种细菌以外的一些菌株或关系较近的细菌有杀伤作用、非复制性的含蛋白的抗菌物质。

细菌素分为两大类，一类是分子量较小，对胰蛋白酶敏感，耐热；另一类是分子量较大，在电镜下有一定的形状，类似噬菌体或噬菌体的碎片，对胰蛋白酶不敏感，也不耐热。

抗生素是微生物所产生的具有生物活性的物质，它在低浓度下就能抑制或影响其它生物的机能，从而对敏感微生物产生抑制或致死作用。

传统的生物防治主要是研究有益微生物的活体应用，从现代植病观点来看，应用微生物有益代谢产物来进行病害防治的方法也应列入生物防治的范畴（黄大昉，2001）。

生防细菌还可产生多肽类活性物质。

如在芽孢杆菌产生的抗菌肽中，多数抗细菌，少数抗真菌。

Wakayama（1984）等从蜡状芽孢杆菌（B．cereus）中纯化出一种抗真菌环状多肽Mycocerin，其抑菌谱广，活力强，能同时对丝状真菌和酵母起作用，且耐热性和稳定性好。

裴炎等（1999）报道从蜡状芽孢杆菌S-l菌中分离出抗真菌多肽APS-1环状多肽，浓度为2μg/ml即可抑制黑曲霉和瓜果腐霉。

刘颖等（1999）从枯草芽孢杆菌中分离出抗真菌肽LP-1，为一种广谱抗真菌小肽，对瓜果腐霉病菌（Pythiumaphanidermatum）、玉蜀黍赤霉病菌（Gibberellazeae）、长柄链格孢（Altetmarialongipes）和水稻稻梨孢（Pyriculoriaoryzae）等有很强的抑制作用。

孔建等（1999）报道枯草芽孢杆菌B-903产生一种耐高温抗菌物质，有广泛的抑菌谱，包括土传镰刀菌（Fusariumoxysporum）、气传植物病原菌如苹果轮纹病（Physalosporapiricola）、番茄早疫病（Alternariasolani）和韧皮部病菌。

近年来多肽类抗生素的研究日益受到重视，研究的进一步发展可通过基因定点突变技术对其分子结构进行修饰，以提高其活性。

如Chen等（1988）采用该技术修饰抗菌肽Magalnin2，使其活性提高了100倍，既方便，成本又低。

至今发现Bacillus属的拮抗细菌能产生100多种抗菌物质，其中绝大多数为肽类抗生素，分子量300-3000Da，他们可能含有D-氨基酸和非蛋自氨基酸，一般能抵抗蛋白酶的降解。

这些抗菌物质包括：

①环状肽或环状脂肽，分子量1000Da左右：

IturinA,Surfactin,bacillomycinD,bacilycin.femgycinmycobacillin和mycocerein。

②线状肽：

gramicidin，cerexins，tridecaptin，Zwittermicin。

③氨基糖苷类抗生物：

butirosin，APS，LP-1，5-β-D-xylofuranosylneamine，Kanosamine。

研究证明Bacillus属的拮抗细菌的防病作用与其产生的抗生素有很大的关系。

Stabb等（1994）从土壤中分离到BacilluscereusUW85菌株，该菌株可以抑制由卵菌引起的病害，如Phytophthoramedicaginis引起的苜蓿猝倒病。

研究发现该菌可以产生两种抗生素：

ZwittermicinA和KanosamineoZwittermicinA是一种氨基多元醇，Kanosamine是一种氨基糖苷。

纯化的ZwittermicinA抑制Phytophthoramedicaginis的芽管的伸长而Kanosamine引起孢囊的膨胀。

用转座子Tn917或丝裂霉素C诱变UW85共获得5个抗生素减少的突变体，这5个突变体的生防能力都显著下降，而向突变体处理的苜蓿的根部再加入ZwittermicinA或Kanosamine,苜蓿猝倒病又被明显抑制，说明两种抗生素在UW85抑制苜蓿猝倒病中起重要作用（TurnerandBackman，1991；Osburn，1995）。

3植物内生菌研究进展及其存在的问题

植物内生菌是一个多样性十分丰富的微生物类群，分布于没有外在感染症状的健康植物组织内，并与宿主植物协同进化，其存在和作用长期以来一直为人们所忽视。

随着研究领域的不断拓宽和研究方法的不断深入，植物内生菌的生态和生理作用及其作为潜在的生防资源和外源基因载体，在农业和医药领域中的巨大应用潜力，已逐渐成为国内外研究的热点。

植物内生菌的研究其始于19世纪中叶，debary首先提出植物内生菌一词.在其后的几十年中，先后在几种牧草植物中发现了内生真菌，对植物内生菌并没有进行更深入的研究，直到1977年BACON等人发现高羊茅内生真菌与牛的中毒症状相关后，才引起广泛的关注，在其后的十几年时间，侧重与草本植物内生菌研究，特别是对感染内生菌的牧草对草食动物的影响以及对食叶虫的影响方面研究。

20世纪90年代以后，在植物内生菌方面的研究范围扩大了，不仅仅局限于牧草植物内生菌的研究，也从其他不同植物中分离内生菌，研究其植物生物多样性，生物学作用，侵染途径以及与宿主之间的关系等，特别是1993年Strobel首次报道了从短叶紫衫的树皮中分离出一株内生细菌能产生紫衫醇，对植物内生菌又有了更深的了解，掀起了从植物内生菌中寻找心物质的热潮，一些心的抗肿瘤，抗菌，抗虫物质先后从内生菌中分离出来，在研究植物内生菌的过程中引入了现代分子生物技术，从而使对内生菌的研究进入了分子水平，植物内生菌的来源于外界环境微生物，以不同方式进入植物组织中，通过水平和垂直方式进行传播，其遗传与代谢都由于与宿主在长期共同进化过程中相互作用而有别与外界环境微生物。

几乎所有的植物中都有生活的内生菌，现在仅仅对极少数植物内生菌进行了完全的研究，因此从植物内生菌寻找到新物质的饿几率是很大的，并且植物内生菌本身作为新的微生物资源也具有广泛的研究价值。

4生防细菌的定殖研究

4.1内生细菌的定殖

大多数研究者认为（Hollisetal，1951），植物内生细菌进入植物体内的方式和途径与植物病原细菌相似，也主要是通过自然孔口和伤口等进入植物体内。

这些孔口主要包括气孔、皮孔、水孔、蜜腺、胚根和次生根形成时的组织伤口、破裂毛状体、根在土壤中伸展时造成的持续不断的擦伤口，以及风吹土粒、雨水造成的叶片损伤、或根部分生组织等。

一般认为，细菌没有特殊的穿透结构，它们不能主动穿透完整的表皮细胞。

但有研究发现，植物内生细菌除能通过上述自然孔口和伤口进入植物体外，有的还能通过根毛细胞的入鞘作用、根毛与邻近表皮细胞壁水解酶进入植物组织体内。

另外内生细菌还可以通过维管束系统进入种子，或通过禾谷类花粉管通道、成熟种子的种脐、种皮的裂缝开口、种荚、种皮背部索状细胞进入种子，或通过次生根进入分生组织，或通过叶表吐水孔进入叶内等。

Lamb等（1996）报道，用处于根际的致金色假单胞杆菌（Pseudomonasaureofaciens）Ps3732RNL11菌株浸种，可以从16种单子叶和双子叶植物的地上部组织中分离到该菌，在植株地上部细菌可通过茎表和叶表侵入植物。

研究还发现，根部接种后，茎部经消毒处理，仍可以从地上部植物组织中分离到该细菌。

这表明，细菌可以通过植物维管束组织从根部传导至茎部。

内生细菌可以随植株的生长而繁殖运转。

在植株生长的各个不同阶段，其中的细菌群体的数量有较大变化。

除了由种子传播的内生细菌外，在内生细菌进入植物内部之前必须首先在根部表面定殖。

这些细菌由于趋化性（chemotaxis）、向电性（electrotaxis）或者偶然的碰撞而与宿主相接触。

研究Tn5介导的对任何诱导物都没有反应的，或者胞外蛋白（EPSs）分泌不足或者是过量表达的Alcaligenesfacialis突变株对水稻根部的侵染，发现这一过程可以分为三个阶段：

细菌吸附到根部表面（快速但是是一种细菌与宿主之间弱的相互作用）；锚定在根部表面（强的相互作用）；定殖在根表面的同时，一些细菌进入根内（Youetal，1989）。

与根围细菌相同，内生细菌在植物组织中的定殖也受多种生物和非生物因子影响。

植物相关内生细菌与其它植物内部定殖微生物如其它细菌、真菌、病毒等共同存在。

由于它们的生存需要的空间和营养都由寄主植物提供。

因此，它们之间必然存在着竞争、拮抗、共生和（或