广藿香PTS及FPS基因启动子结合蛋白初步筛选.docx
- 文档编号:23612475
- 上传时间:2023-05-19
- 格式:DOCX
- 页数:22
- 大小:499.12KB
广藿香PTS及FPS基因启动子结合蛋白初步筛选.docx
《广藿香PTS及FPS基因启动子结合蛋白初步筛选.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《广藿香PTS及FPS基因启动子结合蛋白初步筛选.docx(22页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
广藿香PTS及FPS基因启动子结合蛋白初步筛选
广藿香PTS及FPS基因启动子结合蛋白初步筛选
【摘要】目的:
初步筛选广藿香醇生物合成PatPTS及PatFPPS启动子结合蛋白及酶互作蛋白方法:
对基因PatPTS及FPPS进行qRT-PCR分析转录差异,利用DNAPulldown实验技术,得到DNA结合转录调控蛋白质,寻找与启动子结合的蛋白,并通过酵母单杂技术对结合蛋白进一步验证结果:
筛选出广藿香9592basichelix-loop-helixtranscriptionfactor(9592bHLH)和zincfingerBEDdomain-containingproteinRICESLEEPER2-like(BED-R)可能与PTS启动子有结合活性结论:
对于广藿香醇生物合成PTS及FPS基因启动子结合蛋白的初步筛选,获得了两种可能与PTS启动子有结合活性的蛋白,有利于揭示响应外源激素MeJA诱导的广藿香醇代谢与表达调控机理,进一步认识广藿香药效成分萜类化合物的合成及调控机制
【关键词】广藿香;萜类生物合成;PatPTS;PatFPPS;DNAPulldown
PreliminaryScreeningofPromoterBindingProteinsofPTSandFPSGenesinPogostemoncablin
Graduate:
HuYing
Supervisor:
ChenLikai
【Abstract】ObjectiveToscreenthepatchyproteinandenzymeinteractionproteinofpatchocarpolbiosynthesisPatPTSandPatFPPSpromoter.MethodsThetranscriptionaldifferencesbetweenthegenesPatPTSandFPPSwereanalyzedbyqRT-PCR.DNApulldownassaywasusedtoobtainDNA-bindingtranscriptionalregulatoryproteins,andtheproteinsboundtothepromoterweresearched.Thebindingproteinswerefurtherverifiedbyyeastsinglehybridtechnology.ResultsScreeningoutofthemuskscent9592basichelix-loop-helixtranscriptionfactor(9592bHLH)andzincfingerBEDdomain-containingproteinRICESLEEPER2-like(BED-R)mayhavebindingactivitytothePTSpromoter.ConclusionForthepreliminaryscreeningofthepromoterproteinofPTSandFPSgeneinpatchoulialcoholbiosynthesis,twoproteinswhichmaybindtothePTSpromoterwereobtained,whichwashelpfultorevealthemetabolismandexpressionofpatchoulialcoholinducedbyexogenoushormoneMeJA.Regulatingmechanism,furtherunderstandingthesynthesisandregulationmechanismofquinonecompoundsinpatchouli.
【Keywords】Potostemoncablin;Terpenoidbiosynthesis;PatPTS;PatFPPS;DNAPulldown
前言
广藿香Pogostemoncablin(Blanco)Benth.为唇形科刺蕊草属植物,是广东的道地药材,具有芳香化浊,开胃止呕,发表解暑的功效[1]。
广藿香所富含的挥发油中含有丰富的挥发性萜类,主要由单萜、倍半萜及其衍生物组成,含量较大的有广藿香醇、广藿香酮、反式-丁香烯等成分[2-3],其中占广藿香油含量60%以上的广藿香醇、广藿香酮[4-5]被研究证明为广藿香发挥药效的主要有效成分[6]。
广藿香醇含量最高,属三环倍半萜化合物,具有抗菌抗炎等作用,因此研究广藿香倍半萜类化合物生物合成的分子机制,有利于调控广藿香油特别是广藿香醇成分的快速合成和大量累积,对广藿香药用资源的应用、保护和发展具有重要的意义。
本课题创新利用DNAPull-down-MS技术筛选获得与萜类生物合成MVA途径的下游关键酶——萜类合酶PatPTS和PatFPPS启动子基因相结合的蛋白,藉此了解其转录方式和受什么转录因子的调控,以更好的调控广藿香醇的生物合成,为萜类代谢通路的明晰添砖加瓦。
概述
1萜类生物合成
1.1萜类生物合成途径
萜类化合物是一类具有抗癌、抗过敏等多种生物活性的天然产物,是由甲戊二羟酸衍生而来的化合物,其种类繁多,以异戊二烯为结构单元,按照其单元数量的不同可分为单萜、倍半萜、二萜等。
大量研究表明,萜类有两条生物合成途径,其一为位于细胞质中的甲戊二羟酸途径(mevalonatepathway,MVA),另一则是位于质体中的脱氧木酮糖-5-磷酸途径(1-deoxy-D-xylulose-5-phpsphate-pathway,DXP)或甲基赤藓醇-4-磷酸途径(methylerythritol-4-phosphatepathway,MEP)。
MVP途径是以乙酰辅酶A为原料,经甲戊二羟酸形成异戊烯基焦磷酸酯(IPP)及其双键异构体二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP),进一步缩合形成倍半萜、三萜和甾体,而DXP途径则是以丙酮酸和磷酸甘油醛为原料,在转酮酶的催化作用下聚合DXP,经异构化和还原等反应,形成MEP中间体,再经磷酸化、环化等步骤生成IPP,从而衍生单萜、二萜等萜类化合物[7]。
图1倍半萜类生物合成途径
1.2PTS及FPS
广藿香醇合成酶(Patchoulolsynthase,PTS)是广藿香醇形成过程中的一个限速酶,可催化倍半萜前体法尼基焦磷酸(Farnesyldiphosphate,FDP)转化形成包括广藿香醇在内的多达14种不同的倍半萜化合物,是调控广藿香醇生物合成的关键所在[8]。
PTS具有强大的生物催化潜力,Frister等[9]发现重组的PTS蛋白酶除了能转化常规的E,E-FDP形成以广藿香醇为主的倍半萜产物,还能转化2Z,6EFDP、2E,6Z-FDP等FDP的同分异构体形成不同的倍半萜产物。
刘信丹[10]对广藿香合成酶的研究成功克隆出其基因的全长cDNA序列,构建并表达PTS基因的原核表达载体。
另有研究发现广藿香醇合酶基因受到miR156靶向SPL转录因子的调控,过表达AtrSPL10则使PatPTS表达多倍提高,倍半萜含量约提高20%,揭示AtmiR156通过靶向SPLs调控PatPTS基因的转录水平进而控制广藿香中倍半萜成分的合成[11],随着SPL水平的提高,PTS基因的表达也相应提高,进而提高广藿香醇的含量,但是其具体的转录调节机制,分子调控网络未解析透彻。
法尼基焦磷酸酶(FPPS)是MVA途径的下游关键酶[12-13]。
FPPS在植物中以同源二聚体的形式存在,催化2个异戊烯基焦磷酸(isopentenylpyrophosphate,IPP)分子和1个二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallylpyrophosphate,DMAPP)分子生成法呢基二磷酸(farnesyldiphosphate,FPP)[14-15],FPP是甾醇、皂苷、多萜醇、泛醌等倍半萜和三萜类化合物的合成前体,广泛参与植物的初生代谢和次生代谢。
有研究表明,过量表达青蒿的FPPS基因可以使转基因青蒿株系中的青蒿素量有一定的提高,在人参发根中过量表达FPPS可以提高人参总皂苷的量[16-17]。
说明可通过调控植物FPPS基因的过量表达去提高植物有效活性成分的产量,以此提高植物的品质[18]。
FPPS及TPS是合成广藿香醇的下游关键酶基因。
FPPS催化生成FPP,FPP又作为底物,被PTS催化生成萜类化合物——广藿香醇,是细胞质体内广藿香醇合成代谢中的重要调控位点。
研究PTS及FPPS对明确广藿香醇的生物合成具有重要意义。
2茉莉酸甲酯对植物萜类化合物的调控
茉莉酸(JA)及其衍生物统称为茉莉素(JAs),是广泛存在于植物中的一类具有环戊酮结构的化合物,由亚麻酸经脂肪氧合酶途径合成的植物内源激素[19],是植物伤害反应的信号分子,主要包括茉莉酸异亮氨酸(jasmonicacid-isoleucine,JA-Ile)、茉莉酸(jasmonicacid,JA)和茉莉酸甲酯(methyl-jasmonicacid,MeJA)等,对植物生长和发育具有广泛的生理效应;同时可作为内源信号分子参与植物的抗逆反应。
长期以来,对JA信号途径的机制及功能的研究一直是生命科学研究的热点之一。
植物萜类化合物大多为次生代谢物,而植物次生代谢产物的合成受相应转录因子调节,转录因子能响应上游转导信号的激活。
当植物受外界刺激发生应激反应时,MeJA能充当信号转导,且具有挥发性、不易被离子化、易透过细胞[20]等特点。
通过MeJA信号转导,可以激活或抑制相应的转录因子,转录因子作用影响下游基因的转录,从而调控参与植物次生代谢的相关基因的表达,对次生代谢产物的生物合成进行调控[21],MeJA的信号转导通路见图2。
图2MeJA的信号通路转导简图
在植物受到外界刺激时生成的JA-Ile会与细胞内的茉莉酸信号受体COI1和JAZ蛋白相结合形成复合物,被转移到26s蛋白酶体内降解,释放与JAZ蛋白结合的MYC、MYB、NAC、WRKY等转录因子,从而启动下游受茉莉酸诱导基因的表达来调控一系列的细胞生命活动[22]。
茉莉酸甲酯的应用能调控萜类生物合成并且提高其产量,任昂等研究发现茉莉酸甲酯能显著提高灵芝三萜含量并上调灵芝三萜生物合成途径中的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、法尼酯焦磷酸合成酶和羊毛甾醇合成酶等基因的表达[23]。
张文娟使用MeJA按照时间梯度与浓度梯度诱导大戟愈伤组织后的萜类代谢途径3个关键酶基因(HMGR、SQS、FPS)的相对表达量与总三萜含量都叫较对照组有所增加[24]。
近年MeJA已经广泛地用于调控植物萜类化合物的合成,与之响应的转录因子在青蒿素、红豆杉、阳春砂、罗汉果、苦玄参和三七等大多数植物中皆存在。
本研究引入茉莉酸甲酯诱导处理广藿香并设置对照组,以便更好地研究PatPTS及PatFPPS基因启动子结合蛋白。
3转录因子的研究方法
3.1实时荧光PCR技术
实时荧光定量PCR(real-timefluorescentquantitativepolymerasechainreaction,RT-qPCR)是通过对PCR扩增反应中每个循环产物荧光信号的实时检测,从而实现对起始模板的定量及定性分析[25],原理是在PCR体系中加入荧光染料或荧光分子标记的寡核苷酸链,与PCR扩增产物结合时荧光分子在紫外线的激发下发出荧光,通过荧光信号探测器直接检测反应体系中荧光信号的变化,来监测目的基因的拷贝数量,并据此推断目的基因的初始量[26],具有特异性强、灵敏度高、自动化、重复性好、定量准确、全封闭反应等优点,被广泛运用在分子生物学实验中。
例如Mason[27]等利用TaqMAN探针荧光定量PCR技术检测转基因番茄的目的基因的拷贝数。
俞滢以茉莉花Actin基因为内参,采用RT-qPCR技术,对茉莉花开放过程中不同时期JsTPS基因的表达量进行测定与分析[28]。
3.2DNAPulldown技术
DNAPulldown是一种获取DNA结合转录调控蛋白质实验技术。
针对目标区域设计特异性DNAprobe,并经过脱硫生物素标记;细胞核提取物与DNAprobe孵育,作用特异性转录调控蛋白质可以和DNAprobe结合;经链霉亲和素偶联magneticbeads亲和结合,及洗涤去除非特异性结合蛋白分子;最后,洗脱获得具备转录调控功能的蛋白质;所获得的蛋白质,可以开展westernblot或质谱鉴定获得结合强度及蛋白质类型。
生物素与链亲和素结合速度快、灵敏度高、特异性强,所形成的复合物非常稳定,并且具有信号放大作用,一个链亲和素可以连接4个生物素,提高杂交容量,而磁珠分离技术重复性好、结合效率高、操作方便,使得这一系统在鉴定DNA-蛋白质相互作用方面表现出特有的优势。
利用磁珠分离技术,可筛选得到肺组织细胞核中与HMGB1启动子结合的差异蛋白[29]。
通过观察差异条带,分析显示,与正常对照组比较,VI-LI大鼠组有10个蛋白与HMGB1启动子的结合力增强,有6个蛋白的结合力减弱[30]。
利用生物素链亲和素磁珠系统,分离HMGB1启动子-蛋白复合物,得到对照组和SAP组共有14条差异条带,质谱鉴定这些差异条带得到H2A、H2B、H3、H4、S100A9转录相关蛋白,对于下一步研究HMGB1在SAP肝损伤过程中的转录调控机制具有重要意义。
3.3酵母单杂交技术
酵母单杂交技术(veastonehybrid)是一种体外分析DNA与蛋白质相互作用的技术,通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析,来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因.或对DNA结合位点进行分析,其理论基础是:
真核生物的转录起始需要转录因子的参与,而通常这些转录激活因子具有2个功能上独立的结构域——DNA结合结构域(DNA-bindingdomainBD)和DNA激活结构域(ActivationdomainAD),前者特异结合于顺式作用元件上,后者实施基因表达调控功能[31-32],因此DNA结合结构域和DNA激活结构域可以分开使用,单独的结合结构域或转录激活结构域都不能启动下游报道基因的表达。
酵母单杂交技术利用此原理构建各种基因与转录激活域融合的融合蛋白,只要转录激活域所融合的蛋白能与特异的DNA序列结合,即说明它能够起到转录因子结合结构域的功能,即此形成有功能的转录因子,从而实施基因表达调控,激活启动子下游报道基因的表达。
用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子[33]。
利用酵母单杂交技术已经识别并鉴定出了许多与目的DNA片段相结合的蛋白质[34]。
2015年,Deokar等[35]利用酵母单杂技术筛选出了与鹰嘴豆非生物胁迫相关的转录因子CarERF116。
研究部分
本研究利用MeJA激素处理广藿香幼苗,通过GC-MS分析代谢成分含量,qRT-PCR分析差异表达,Pull-down-MS技术寻找互作蛋白,并且探讨了目标蛋白质对PatPTS及FPPS的作用机制和调控方式、转录相关调控因子研究,从而揭示响应外源激素诱导的广藿香醇代谢与表达调控机理,进一步认识广藿香药效成分萜类化合物的合成及调控机制。
1实验内容
1.茉莉酸甲酯处理广藿香幼苗,设置对照组
2.用PCR技术大量扩增PatPTS和PatFPPS启动子序列,切胶回收得到生物素探针序列。
3.利用DNAPull-downMS钓取广藿香核蛋白提取物中的结合蛋白。
钓取的结合蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳,用质谱快速染色试剂盒染色,胶内消化回收蛋白并通过LC-MS测定蛋白。
2实验仪器与材料
2.1仪器与材料
植物细胞核及核蛋白分离试剂盒(西安赫特生物科技有限公司);MilliQ15mL3kD蛋白浓缩柱;TaqDNA聚合酶(南京诺唯赞生物科技有限公司);DNAMarker(日本Takara公司);鲑鱼精DNA;琼脂糖;GEL/PCRPurificationMiniKit(Favorgen公司);μMACSStreptavidinKitμ(德国miltenyi biotec公司);Milli-Qwater、10µland200µltips(eppendorf)、乙腈Acetonitrile(FisherA/0626/17)、甲醇methanol(Fisher)、硫代硫酸钠·5H2OSodiumthiosulfatepentahydrate(Sigma德国)、二硫苏糖醇Dithiothreitol(PlusOne)、碘乙酰胺Iodoacetamide(Sigma德国)、胰酶Trypsin(PromegaV5280)、胰酶重溶液Trypsinresolveolution(PromegaV530)
PCR仪,电泳仪,考染仪,大型冷冻离心机,QExactivemassspectrometer(Thermofisher)质谱仪,真空干燥仪、水浴锅、低温冷冻离心机。
2.2样品材料
使用浓度为300μM/L的茉莉酸甲酯对广藿香幼苗进行处理,作为MeJA组,酒精作为CK对照组,对其叶片表面进行喷湿处理,8小时后,用纯水冲洗表面杂质,擦干,由叶柄处剪取叶片,液氮冻存备用。
3实验方法与条件
3.1DNAPulldown实验筛选
核蛋白的提取
取液氮将约10g组织研磨充分,加入1*核分离缓冲液30mL,玻璃匀浆器研磨,300目过滤网过滤,取滤液,5000rpm离心10min,取沉淀;将沉淀用1*核分离缓冲液(含1%蛋白酶抑制剂)重悬洗涤,洗涤转速为1000g离心5min离心,重复洗涤2次,12000g离心5min,取沉淀;临用前抽提工作液加入DTT(5mM),蛋白酶抑制剂(1%),并4 ℃,8000rpm离心20min,12000g离心10min,上清液转移至离心管,用MilliQ15mL3kD蛋白浓缩柱对上清液浓缩和清除盐,取上清至-81 ℃保存备用。
3.2生物素探针的制备
分别设计PatPTS及PatFPPS启动子基因的链生物素探针,并利用课题组前期得到的PatPTS及PatFPPS启动子基因PCR扩增,凝胶电泳分别得到1659bp的PatPTS探针及724bp的PatFPPS探针,利用GEL/PCRPurificationMiniKit回收探针,于-20 ℃保存备用。
基因名称
正反引物
链生物素引物
PatPTS
(840bp)
Primer1 Left
Biotin-TCATCATCTTGGACCGTCCTTG
Primer1 Right
Biotin-GCTAGCTCGACTGTGACTGTTT
PatFPPS
(724bp)
Primer1 Left
Biotin-TCATCATCTTGGACCGTCCTTG
Primer1 Right
Biotin-GCTAGCTCGACTGTGACTGTTT
3.3PatPTS及PatFPPSDNApulldown分析
利用Bradford定量方法进行定量,将0、1、2、3、4、5、6µL的牛血清白蛋白(BSA)标准溶液(1mg/ml)和适当体积的样品分别加入到酶标板中,PBS缓冲液补足至15µL后混匀。
向各试管中加入285µL考马斯亮蓝染液,混匀,室温放置5分钟,用酶标仪测量595nm下的吸光度,读出每个样品的吸收率。
绘制标准曲线,计算样品中的蛋白浓度。
取CK组及MeJA组核蛋白提取物各1.25mg/组,按下表及操作分别加入其余组分。
表DNApulldown反应加入试剂及加入量
加入物
加入量
备注
COX-2探针
50pmol
TPS(28μg)/FPP(24μg)
核提取物
1250μg(浓缩至3-10μg/μl)
终浓度1μg/μl
磁珠
100μl
鲑鱼精DNA
5μL
cocktail
10μL
binding buffer(x)
binding Enhancer(x/100)
2倍核提取物体积
(1)将PatPTS及PatFPPS生物素探针与核蛋白提取液在冰上孵育60分钟,再加入100μL链亲和素磁珠,混合均匀。
(2)将分离柱置于分离器上,加入100μLappropriateEquilibrationBuffer清洗。
(3)用100μLddH2O清洗分离柱,重复两次。
(4)加入链亲和素磁珠-生物素探针-结合蛋白复合物到柱子中。
(5)用100μL的washingbuffer清洗杂蛋白,重复四次。
(6)加入150μLappropriateEquilibrationBuffer洗脱目标蛋白与生物素探针结合物
3.4SDS-PAGE凝胶电泳,考染及回收
将DNApulldown的appropriateEquilibrationBuffer洗脱液分别进行10%SDS-PAGE凝胶电泳。
并用考马斯亮蓝染色,置4ddH2O保存。
将胶条切下,进行MALDI-TOF质谱鉴定。
3.5蛋白酶解
1.切胶:
将蛋白条带切出后放入0.6mlEP管中。
2.水洗:
:
每管加入120-150ulMilliQ水,置于震荡器震荡1min,吸出液体。
每管再加入120-150ul
MilliQ水,置于震荡器震荡1min,吸出液体的同时用枪头把胶粒切成1mm3大小。
3.脱色:
加脱色液50ul于EP管中,置于白色滤纸上观察,颜色完全脱去后马上吸出液体,然后加150ul水冲洗停止反应,吹打洗涤胶粒,吸出液体后再加入150ulddH2O洗胶粒两次。
4.脱水:
每管加入150ul100%ACN,震荡30s等胶粒变白后吸出液体。
5.还原:
往干燥胶粒中加入120ul25mMDTT,吸涨后放55℃孵育50min。
6.水洗:
吸出DTT,加入150ul水吹打水洗胶粒3次。
7.脱水:
150µl100%ACN脱水至胶粒变白。
8.酶切:
用覆盖液稀释胰酶至10ng/µl;每管胶粒加入胰酶10µl,冰浴30min后吸掉多余的胰酶,37℃恒温箱酶切12-16h。
9.肽段提取:
将EP管盒整个放入超声仪中超声15-20min,吸出肽段,
3.6质谱检测
1.肽段用样品溶解液(0.1%甲酸、2%乙腈)溶解,充分振荡涡旋,13200rpm,4℃离心
10min,上清转移到上样管中,进行质谱鉴定;
2.液相参数
色谱柱信息:
300umi.d.x5mm,packedwithAcclaimPepMapRSLCC18,5um,100Å,
nanoViper,流动相A:
0.1%甲酸,流动相B:
0.1%甲酸,80%ACN,流速:
300nL/min,每个组分分析时间:
60min
时间
B相
0
5%
5
5%
50
90%
55
90%
58
5%
60
5
3.7质谱参数
分离后的肽段直接进入质谱仪ThermoScientificQExactive进行在线检测,具体参数如下:
一级质谱参数:
Resolution
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 广藿香 PTS FPS 基因 启动子 结合 蛋白 初步 筛选