菌株选育调节.docx
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菌株选育调节
第三章菌株选育调节
优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键,要使发酵工业产品的种类、产量和质量有较大的改善,首先必须选育性能优良的生产菌种。
理想的工业发酵菌种应符合以下要求:
(1)遗传性状稳定;
(2)生长速度快,不易被噬菌体等污染;
(3)目标产物的产量尽可能接近理论转化率;
(4)目标产物最好能分泌到胞外,以降低产物抑制并利于产物分离;
(5)尽可能减少产物类似物的产量,以提高目标产物的产量及利于产物分离;
(6)培养基成分简单、来源广、价格低廉;
(7)对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感;
(8)对溶氧的要求低,便于培养及降低能耗。
菌种选育包括根据菌种自然变异而进行的自然选育,以及根据遗传学基础理论和方法,人为引起的菌种遗传变异或基因重组,如诱变育种、杂交育种、原生质体融合和基因工程等技术。
后一类方法在微生物的菌种选育工作中占踞主导地位,其中通过分子生物学手段,定向构建基因工程菌是微生物育种的重要发展趋势。
当然,菌种选育的前提条件是从自然界获得相应的原始菌种。
3.1 从自然界中获得新菌种
自然界中微生物资源极其丰富,土壤、水、空气、动植物及其腐败残骸都是微生物的主要栖居和生长繁殖场所。
微生物种类大大超过所有动植物之和。
随着微生物学研究工作的不断深入,微生物菌种资源开发和利用的前景十分广阔。
新的微生物菌种需要从自然生态环境中混杂的微生物群中挑选出来,因此必须要有快速而准确的新种分离和筛选方法。
3.1.1 采样
采样应根据筛选的目的、微生物分布情况、菌种的主要特征及其生态关系等因素,确定具体的时间、环境和目标物。
1.采样原则:
材料来源越广泛,越有可能获得新的菌种。
可寻找已适应各种环境压力的微生物类群。
土壤:
细菌和放线菌为主;
果园树根土层:
酵母菌含量较高;
动植物残体及霉腐土层:
较多的霉菌;
豆科植物根系土:
根瘤菌;
河流湖泊的淤泥:
产甲烷菌;
油田和炼油厂周围土层:
分解石油微生物。
各种水体:
具有光合作用能力的微生物及兼性或专性厌氧微生物;
污染源附近的土壤、水体、污泥、污水往往是对各类污染物具降解或转化能力的细菌、放线菌或真菌等微生物理想的采样地点。
2.采土样方法:
用小铲子去除表土,取离地面5~15cm处的土样几克,盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧,并标明时间、地点和环境等情况,以备查考
3.1.2增殖
在采集的样品中,一般待分离的菌种在数量上并不占优势,为提高分离的效率,在培养基中投放和添加特殊的养分或抗菌物质,使所需菌种的数量相对增加,这种方法称为增殖培养或富集培养。
其实质是使天然样品中的劣势菌转变为人工环境中的优势菌,便于将它们从样品中分离。
培养方法可采用分批式富集培养(摇瓶培养)和恒化富集培养(连续培养)。
分批式富集培养分批式富集培养是将富集培养物转接到新的同一种培养基中,重新建立选择性压力,如此重复转种几次后,再取此富集培养物接种到固体培养基上,以获得单菌落。
恒化富集培养是通过改变限制性基质的浓度,来控制不同菌株的比生长速率。
3.1.3菌株的分离
1.施加选择性压力分离法:
分离的效率取决于培养基养分,pH,加入选择性抑制剂。
大多数放线菌培养基pH在6.7~7.5,嗜酸菌pH在4.5~5.0。
在分离放线菌和细菌时,可加抗真菌抗生素;分离真菌时,加抗细菌抗生素。
从土壤中分离芽孢杆菌时,由于芽孢具有耐高温特性,100℃很难杀死,要在121℃才能彻底死亡。
可先将土样加热到80℃或在50%乙醇溶液中浸泡1h,杀死不产芽孢的菌种后再进行分离。
在富集培养基中,加入适量的胆盐和十二烷基磺酸钠可抑制革兰阳性菌的生长,对革兰阴性菌无作用。
分离厌氧菌时可加入少量硫乙醇酸钠作为还原剂,它能使培养基氧化还原电位下降,造成缺氧环境,有利于厌氧菌的生长繁殖。
筛选霉菌时,可在培养基中加入四环素等抗生素抑制细菌,使霉菌在样品中的比例提高,从中便于分离到所需的菌株。
分离放线菌时,在样品悬浮液中加入10滴10%的酚或加青霉素(抑制G+菌)、链霉素(抑制G-菌)各30~50U/ml,以及丙酸钠10g/ml(抑制霉菌类)抑制霉菌和细菌的生长。
重铬酸钾对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用,也可用于选择分离放线菌。
在分离除链霉菌以外的放线菌时,先将土样在空气中干燥,再加热到100℃保温1h,可减少细菌和链霉菌的数量。
分离耐高浓度酒精和高渗酵母菌时,可分别将样品在高浓度酒精和高浓度蔗糖溶液中处理一段时间,杀死非目的微生物后再进行分离。
马丁氏(martin)培养基就是专门用于分离土壤中真菌的选择性培养基。
其配方是:
葡萄糖1%,蛋白胨0.5%,KH2PO40.1%,MgSO4·7H2O0.05%,琼脂2%,孟加拉红(或称虎红)1/3万,链霉素30mg/ml,金霉素2mg/ml。
此处的孟加拉红、链霉素和金霉素等的作用是抑制细菌生长,从而富集土壤中的真菌。
2.随机分离筛选法
一些微生物的产物对生产菌的筛选没有直接的选择性作用,常用随机分离法进行分离
(1)抗生素生产菌的分离
将摇瓶培养的过滤液或细胞提取液、混合提取液,用联合试验菌筛选:
如黄色霉素抗生素就是用枯草杆菌和绿色产色链霉菌或巴式梭状芽孢杆菌筛选出的。
利用与抗生素作用机制相关的酶筛选:
如棒酸。
(2)药理活性化合物的分离-体外筛选
筛选能抑制生物代谢途径中一关键性酶(靶酶或靶标酶)的活性。
抗高血压:
用血管紧张素转移酶
图1.天冬酰胺合成酶催化反应及其除草剂Cinmethylin的作用机理
(3)抗肿瘤药物生产菌的分离
利用微生物筛选作用于DNA的抗肿瘤药物---具有灵敏度高、简便快速的特点。
生化诱导法筛选:
采用测定溶原性噬菌体阻遏物支配下的启动子控制的转录和表达的酶活性的方法,即将大肠杆菌的lacZ基因连接在噬菌体的Pl启动子下,当DNA损伤时,诱发阻遏蛋白Cl分解,Pl启动子启动lacZ基因转录,测定表达的半乳糖苷酶活性,来检测能损伤DNA的抗肿瘤药物的存在。
SOS生色检测法:
利用DNA损伤时,可活化yecA蛋白,进而分解噬菌体的阻遏蛋白,再引起sifA(sulA)基因启动子启动lacZ基因的表达,从而达到检测能损伤DNA的抗肿瘤药物的目的。
利用DNA修复能力突变株进行抗肿瘤药物的筛选:
在生物体中都存在两个以上的DNA修复基因,如果有一个DNA修复基因损伤或变异,通常任能存活,但对能引起DNA损伤的化合物十分敏感,易生产死亡。
如使用大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的重组缺失DNA修复基因突变株和亲本株作为测试菌来筛选抗肿瘤药物。
(4)抗病毒药物产生菌的分离
检测病毒复制中特有的DNA复制酶和核酸合成酶的抑制剂,是选择性高的筛选方法。
(5)生长因子产生菌的分离
生长因子如氨基酸和核苷酸的产生不能作为分离中的压力,可用随机方法分离产生菌,并通过随后的筛选试验检测得到生产菌。
通过观测分离菌能否促进营养缺陷型菌株的生长,来检出生长因子生产菌。
(6)免疫激活剂生产菌的分离
一般认为能作用细胞表面的物质,可能具有免疫修饰作用,因此以存在于细胞表面的氨基肽酶B,白氨酸氨基肽酶,氨基肽酶A,碱性磷酸脂酶为靶分子,筛选这些酶的抑制剂,发现抑制这些酶,会增强细胞性免疫或抗体产生能力。
(7)多糖产生菌的分离
从菌落的粘性状外关识别这类产生菌。
4.性能鉴定
菌种性能测定包括菌株的毒性试验和生产性能测定。
菌株选育典型流程
出发菌株(砂土管或冷冻管)小试
↓原种特性考擦↓
斜面→或摇瓶培养24h培养基优化
↓↓↓
单孢子悬液菌悬液挑出高产菌株
↓↓↓
诱变处理←-----摇瓶筛
↓处理前后计数↓
稀释涂平板传种斜面
↓观察单菌落形态↓
挑选单菌落转种斜面保藏菌株
↓对照组比较↓
摇瓶初筛----------→挑出高产斜面
3.2自然选育
自然选育是指在特定环境下长期处理某一微生物培养物,同时不断地移种传代,以达到积累和选择合适的自发突变(spontaneousmutation)体的古老的育种方法。
自发突变的频率较低,变异程度不大,所以,用该法培育新菌种的过程十分缓慢。
后来发展了诱变育种、杂交育种、基因工程等育种技术。
自然选育最为成功的例子是目前被广泛使用的卡介苗(BCGvaccine)。
法国的卡尔密脱(Calmette)和介林(Guerin)把牛型的结核分枝杆菌接种在牛胆汁、甘油、马铃薯培养基上,连续传代培养230代,前后经历13年时间,终于在1923年获得显著减毒的结核杆菌----卡介苗。
自然选育的作用:
自然选育在工业生产中可以达到纯化菌种,防止菌种衰退,稳定生产,提高产量的目的。
3.2诱变育种
诱变育种是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群,促进其突变率大幅度提高,然后采用简便、快速和高效的筛选方法,从中挑选少数符合育种目的的突变株,以供生产实践或科学研究用。
3.2.1 诱变剂及其诱发机理
1.物理诱变剂
物理诱变主要是采用辐射。
如紫外线、X射线、γ射线、激光和快中子等都是常用的物理诱变剂。
本节将主要讨论紫外线。
生物中核酸物质的最大紫外线吸收峰值在265nm波长处,该波长也是微生物的最敏感点。
紫外线诱变机理是它会造成DNA链的断裂,或使DNA分子内或分子之间发生交联反应。
交联是由二聚体引起的,二聚体可以在同一条链相邻的碱基之间产生,也可以是在二条链的碱基之间形成。
它会引起DNA复制错误,正常的碱基无法配对,造成错义或缺失。
嘧啶比嘌呤对紫外线敏感得多。
嘧啶的光化产物主要是二聚体和水化物。
图1.嘧啶的紫外线光化产物
过量的紫外线照射会造成菌体丢失大段的DNA,或使交联的DNA无法打开,不能进行复制和转录,从而引起菌体死亡。
在正常的微生物细胞中,紫外线造成的DNA损伤是可以得到及时修复的。
若将受紫外线照射后的细胞立即暴露在可见光下,菌体的突变率和致死率均会下降,这就是光复活作用。
光复活作用是因为微生物等生物的细胞内存在光复活酶(photoreactivatingenzyme),即光裂合酶(photolyase)。
光复活酶会识别胸腺嘧啶二聚体,并与之结合形成复合物,此时的光复活酶没有活性。
可见光光能(300-500nm)可以激活光复活酶,使之打开二聚体,将DNA复原。
与此同时,光复活酶也从复合物中释放出来,以便重新执行光复活功能。
图2光复活作用修复胸腺嘧啶二聚体的过程(PRE为光复活酶)
一般微生物细胞内都具有光复活酶,所以,微生物紫外线诱变育种应在避光或红光条件下操作。
但因为在高剂量紫外线诱变处理后,细胞的光复活主要是致死效应的回复,突变效应不回复,所以,有时也可以采用紫外线和可见光交替处理,以增加菌体的突变率;光复活的程度与可见光照射时间、强度和温度(45-50℃下光复活作用最强)等因素有关。
细胞内还存在另一种修复体系,它不需要光激活,所以称为暗修复(darkrepair)或切除修复作用(excisionrepair)。
它可修复由紫外线、γ射线和烷化剂等对DNA造成的损伤。
暗修复体系有四种酶参与反应。
首先由核酸内切酶切开二聚体的5’末端,形成3’-OH和5’-P的单链缺口,然后,核酸外切酶从5’-P到3’-OH方向切除二聚体,并扩大缺口,接着,DNA聚合酶以另一条互补链为模板,从原有链上暴露的3’-OH端起合成缺失片段,最后,由连接酶将新合成链的3’-OH与原链的5’-P相连接。
光复活作用使胸腺嘧啶二聚体复原成两个胸腺嘧啶,暗修复则是将胸腺嘧啶二聚体切除。
细胞中还存在另一种在并不改变胸腺嘧啶二聚体的情况下的修复系统,即重组修复(recombinationrepair)。
重组修复必须在DNA进行复制的情况下进行,所以又称为复制后修复(postreplicationrepair)。
重组修复中DNA损伤并没有除去,当进行下一轮复制时,留在母链上的损伤仍会给复制带来困难,还需要重组修复来弥补,直到损伤被切除修复消除。
但是,随着复制的进行,若干代后,即使损伤未从母链中除去,而在后代的细胞群中也已被稀释,事实上消除了损伤的影响。
图3重组修复过程
2.化学诱变剂
化学诱变剂的种类有许多,但具有高效诱变作用的并不多,常用的化学诱变剂根据其作用方式不同分为三种类型。
(1)与核酸碱基化学反应的诱变剂。
此类型主要有烷化剂、亚硝酸和羟胺等。
烷化剂(alkylatingagent)带有一个或多个活性烷基,带一个活性烷基称单功能烷化剂,带二个或多个的分别称为双功能或多功能烷化剂。
它们的烷基可转移至其它分子中电子密度高的位置,它们的诱变作用是其与DNA中的碱基或磷酸作用。
常见的烷化剂有硫酸二乙酯(EDS)、甲基磺酸乙酯(EMS)、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、亚硝基甲基脲(NMU)、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙酸等。
甲基磺酸甲酯是单功能烷化剂,氮芥是双功能烷化剂。
NTG和NMU因为有突出的诱变效果,所以被誉为“超诱变剂”。
双功能烷化剂可引起DNA二条链交联,造成菌体死亡,所以其毒性比单功能烷化剂强。
碱基中的鸟嘌呤最易受烷化剂作用,形成6-烷基鸟嘌呤,并与胸腺嘧啶错误配对,造成碱基转换。
胸腺嘧啶被烷基化后,可与鸟嘌呤错误配对,见图4。
图4EMS的烷基化造成的碱基转换
胸腺嘧啶:
thymine;胞嘧啶:
cytosine鸟嘌呤:
guanine;胞嘌呤:
adenine
亚硝酸的作用主要是使碱基氧化脱氨基,如使腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)分别脱
氨基成为次黄嘌呤(H)、尿嘧啶(U)和黄嘌呤(X)。
复制时,次黄嘌呤、尿嘧啶和黄嘌呤分别与胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)配对,见上图(上图为亚硝酸引起碱基氧化脱氨基效应:
1.腺嘌呤氧化脱氨基成为次黄嘌呤,与胞嘧啶配对;2.胞嘧啶氧化脱氨基成为尿嘧啶,与腺嘌呤配对;3.鸟嘌呤氧化脱氨基成为黄嘌呤,仍与胞嘧啶配对,不能引起碱基转换)
(2)碱基类似物
这些化合物有5-溴尿嘧啶(5-BU),5-氟尿嘧啶(5-FU)、8氮鸟嘌呤(8-NG)和2-氨基嘌呤(2-AP)等。
它们与碱基的结构类似,在DNA复制时,它们可以被错误地掺入DNA,引起诱变效应,所以说它们引起碱基置换的作用是间接的。
(3)移码突变的诱变剂
移码突变是指由一种诱变剂引起DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的插入或缺失,从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和翻译错误的一类突变。
由移码突变产生的突变体称为移码突变体。
吖啶类染料(原黄素、吖啶黄、吖啶橙及α-氨基吖啶等)和一系列称为ICR类的化合物(它们是一些由烷化剂与吖啶类化合物相结合的化合物)都是移码突变的有效诱变剂
3.2.3诱变育种方法中应注意的问题
1.出发菌株的选择
用来育种处理的起始菌株或称为出发菌株,合适的出发菌株就是通过育种能有效地提高目标产物产量的菌株。
首先应考虑出发菌株是否具有特定生产性状的能力或潜力。
出发菌株的来源主要有三方面:
(1)自然界直接分离到的野生型菌株 这些菌株的特点是它们的酶系统完整,染色体或DNA未损伤,但它们的生产性能通常很差(这正是它们能在大自然中生存的原因)。
通过诱变育种,它们正突变(即产量或质量性状向好的方向改变)的可能性大。
(2)经历过生产条件考验的菌株 这些菌株已有一定的生产性状,对生产环境有较好的适应性,正突变的可能性也很大。
3)已经历多次育种处理的菌株 这些菌株的染色体已有较大的损伤,某些生理功能或酶系统有缺损,产量性状已经达到了一定水平。
它们负突变(即产量或质量性状向差的方向改变)的可能性很大,可以正突变的位点已经被利用了,继续诱变处理很可能导致产量下降甚至死亡。
出发菌株最好已具备一些有利的性状,如生长速度快、营养要求低和产孢子早而多的菌株。
一般可选择
(1)或
(2)类菌株,第
(2)类较佳,因为已证明它可以向好的方向发展。
4)连续诱变选育过程中如何选择出发菌株
由于突变株的产量只能逐步累加,一次性大幅度提高发酵水平不太容易。
在选择出发菌株时,应挑选每代诱变处理后均有一些表型上改变的菌株,如发酵单位有一定程度的提高、形态上发生过一次变异或产生过回复突变的菌株等,以利于突变率的增加。
灰黄霉素产生菌荨麻青霉D-756诱变系谱菌株表型变异与产量递增的关系
菌号
诱变代数
菌落大小/cm
菌落表面结构
菌落颜色
可溶性色素
变株效价提高%
4541
1
1.3
平滑疏松
龟背灰绿
赭石
100
71046
10
0.8
平滑紧密
白
火泥棕
2011
B-53
11
0.6
平滑紧密
白
海螺橙
2642
C-04
自然分离后
0.5
平滑紧密
白
淡可可棕
3547
D-756
13
0.4
平滑紧密
白
鱼鳃红
6911
头孢菌素C产生菌C-20诱变系谱菌株表型变异与产量递增关系
菌株编号
抗生素产量/%
表型特征
菌落直径
基质菌丝颜色
其他
C-1
100
组织松,生长速度快
C-2UV
213
组织紧密,生长速度较慢
C-3NM
548
乳白
生长速度快
C-4X射线
829
8~11.5
柠檬黄
菌落表面不规则纹密集
C-7
1120
7~8
柠檬黄
沉没培养形成菌团
C-8UV
1610
6~8
柠檬黄
菌苔变厚,纹变疏
C-15NTG
2630
4~5
鹅黄
菌落边缘不规则,生长较慢
C-17EMS
3028
4.5~5.2
鹅黄(边缘柠檬黄)
菌苔稍增厚
C-19NS
3223
8~9
乳黄
菌苔厚,边缘规则,放射纹路
C-20EMS
4000
8~9
粉玉色
菌苔扁薄,边齐,放射纹密
2.出发菌株的纯化
确定诱变出发菌株后,就要进行纯化。
因为微生物容易发生变异和染菌。
一步丝状菌的野生菌株多数为异核体;产生菌在不断移代过程中,菌丝间接触、吻合后,易产生异核体、部分结合子、杂合二倍体及自然突变产生变株等。
这些都会造成细胞内遗传物质的异质化,使遗传性状不稳定。
划线分离法和稀释分离法纯化。
3.单孢子(或单细胞)菌悬液的制备
在诱变育种中,所处理的细胞必须是单孢子、均匀的菌悬状态。
这是因为,一方面分散状态的细胞可以均匀的接触诱变剂,另一方面又避免长出不纯菌落,给后续的筛选工作造成困难。
1)供试菌株的孢子和菌体要年轻、健壮
供试细胞要新培养的,细胞生理活性方面既要同步,又要处在最旺盛的对数期,这样突变率高,重现性好。
一般要求菌体处于对数生长期;对产孢子或芽孢的微生物最好采用成熟、新鲜的孢子或芽孢,
制备菌悬液时,采用分散法,使细菌或孢子团块在培养液或悬浮液中充分分散,力求90%以上未单孢子,除去菌丝片断,因为一般菌丝是多核的。
霉菌孢子悬液浓度:
106/ml;放线菌孢子悬液浓度:
106~107/ml;
孢子和细菌数用平板计数、血球计数器计数、光密度法测定。
2)单孢子(或单细胞)菌悬液的制备方法
细菌预培养及菌悬液的制备:
细菌经20~24h培养的新鲜斜面,移接到盛有基本培养基的三角瓶中,于35~37℃振荡培养到对数期,再于6℃培养1h,使之同步生长,然后加入一定浓度的嘧啶、嘌呤或酵母膏(为加速DNA复制提供营养而增加变异率),继续振荡培养20~60min。
置于低温(约2℃)10min,离心洗涤,用冷生理盐水或缓冲液制备菌悬液,放在盛有玻璃珠的三角瓶内振荡10min,令其分散,用脱脂棉花或滤纸过滤。
通过菌体计数,调整菌悬液的浓度供诱变处理。
孢子菌悬液的制备:
如果是产孢子的菌类进行诱变,处理的材料是孢子,而不是菌丝,因为孢子一般是单核的(如青霉和黑曲霉),菌丝是多核的。
孢子是处于休眠不活跃状态的细胞,在试验中应尽量采用成熟而新鲜的孢子,并且置于液体培养基中振荡培养到孢子刚刚萌发,即芽长相当孢子直径0.5~1倍。
离心洗涤,加入生理盐水或缓冲液,振荡打碎孢子团块,以脱脂棉花或G3-G5玻璃过滤器过滤。
用血球计数法进行孢子计数,调整菌体浓度,供诱变处理。
真菌孢子对诱变剂比较敏感,不一定都要培养萌芽,可以直接用斜面孢子诱变处理。
△对某些不产孢子的真菌,可直接采用年幼的菌丝体进行诱变处理。
有三种方法:
第一,菌丝尖端法。
取灭菌后的玻璃盖片或玻璃纸,紧贴于平皿的营养琼脂平板上,其上滴上数滴培养基,接上菌丝,培养后菌丝生长延伸到盖片以外的培养基上,揭去盖片及其上的菌丝,使盖片周围部分尖端菌丝断裂而留在平皿培养基上,然后对这些菌丝进行诱变处理;
第二,处理单菌落周围尖端菌丝。
通过自然分离,平皿上挑选数个单独生长的菌落,利用紫外线对菌落四周延伸的菌丝尖端进行照射或加入杀菌率低的一定浓度化学诱变剂处理。
培养一定时间,经过繁殖使突变的遗传性状统一、稳定,挑取顶部尖端一小段菌丝于斜面,培养后进一步摇瓶筛选;
第三,混合处理法。
常用于化学诱变剂,取培养后年幼的菌丝体,用玻璃匀桨、过滤,取小段菌丝的菌悬液进行处理。
利用孢子进行诱变处理的优点是能使分散状态细胞均匀地接触诱变剂,更重要的是它尽可能地避免了出现表型延迟现象。
所谓的表型延迟(phenotypiclag)就是指某一突变在DNA复制和细胞分裂后,才在细胞表型上显示出来,造成不纯的菌落。
表型延迟现象的出现是因为对数期细胞往往是多核的,很可能一个核发生突变,而另一个核未突变,若突变性状是隐性的,在当代并不表现出来,在筛选时就会被淘汰;若突变性状是显性的,那么,在当代就表现出来,但在进一步传代后,就会出现分离现象,造成生产性状衰退。
所以应尽可能选择孢子或单倍体的细胞作为诱变对象。
另外,还有一种生理性延迟现象,就是虽然菌体发生了突变,并且突变基因由杂合状态变成了纯合状态,但仍不表现出突变性状。
这可以用营养缺陷型来说明。
一个发生营养缺陷型突变的菌株,产某种酶的基因已发生突变,但是由于突变前菌体内所含的酶系仍然存在,仍具有野生型表型。
只有通过数次细胞分裂,细胞内正常的酶得以稀释或被分解,营养缺陷型突变的性状才会表现出来。
4.诱变剂及诱变剂量
1)诱变剂选择:
诱变剂主要对DNA分子上基因的某一位点发生作用。
如紫外线的作用是使二个嘧啶之间聚合,形成嘧啶二聚体;亚硝酸的作用点主要在嘌呤和嘧啶碱基上;5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶的作用主要在复制过程中取代DNA分子上相同结构的碱基成分。
根据诱变剂作用机制,再结合菌种特性来考虑选择哪种诱变剂进行诱变。
灰黄霉素野生菌使用紫外线和氯化锂,取得惊人诱变效果;头孢菌素C产生菌有效的诱变剂是紫外线、氯化锂、甲基磺酸已酯;博莱霉素、四环素族产生菌常用一些具有氨基、硝基、亚硝基还原性质的亚硝酸、羟胺、氯化锂等诱变剂,突变率较高;青霉素生产菌以亚硝基胍、氮芥、乙烯亚胺等烷化剂更为适合。
2)根据菌株特性和遗传稳定性来选择诱变剂
对遗传稳定的出发菌株,最好采用以前未使用过的、突变谱较宽的、诱变率高的强诱变剂进行复合处理,使DNA结构发生严重损伤,造成大的变异,然后再采用一些作用较缓的诱变剂处理;
对遗传性不稳定的出发菌株,它们的遗传背景复杂,为了提高这类菌株的产量,常采取的选育路线:
首先进行自然分离,划分菌落类型,从中
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