基础生物学实验讲义.docx

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基础生物学实验讲义

基础生物学实验讲义

（生命科学类本科生使用）

广西大学行健文理学院

实验一普通光学显微镜的使用与生物绘图

一、实验目的

1.了解普通光学显微镜的基本构造，能规范和较熟练地使用；

2.学习细胞临时装片的制作方法和生物绘图的方法。

二、实验材料

细菌涂片

三、实验用具

显微镜、载玻片、盖玻片、胶头滴管

四、实验内容

1、普通光学显微镜的基本构造、使用方法及保护

显微镜的基本结构

显微镜构造很复杂，种类很多，但基本结构是由机械和光学两大部分构成，现分述如下：

1.1机械部分它是为光学部分服务的部件，包括以下六部分：

（1）镜座：

显微镜最下面呈马蹄形或圆形的部分，起稳定和支持显微镜作用。

（2）镜柱：

直立于镜座上的短柱，支持显微镜的其它部分。

（3）镜臂：

弯曲成马蹄形的部分，便于手持，下端与镜柱相连接的地方有一个倾斜关节，可使镜臂倾斜，便于观察。

（4）载物台：

自镜臂下端向前伸出，放置标本用的平台，其中央有一个园孔，叫通光孔。

台上有一移动器（老式的左右各有一个压片夹），用以固定和移动标本。

（5）镜筒：

和镜臂上方连接的园筒部分。

有的显微镜镜筒内有一抽管，可适当抽长，一般长度是160-170mm。

镜筒上端装有目镜，下端有一个可转动的园盘，叫物镜转换器（或叫物镜旋转盘），其上装有2-4个物镜。

（6）调焦器（调节器或调节螺旋）：

为镜壁上两种可转动的螺旋，一大一小，能使镜筒上下

移动，调节焦距。

大的叫粗调焦器，升降镜筒较快，用于低倍镜对焦；小的叫细调焦器，升降镜筒较慢。

1.2光学部分由接目镜、接物镜、反光镜、聚光器等四部件组成。

（1）接目镜：

装于镜筒上方，由两组透镜构成，接目镜的作用是把接物镜所形成的倒立实像再放大成为一个虚像。

接目镜上刻有5×，8×，10×，15×，25×等符号，表示放大倍数。

我们所观察到的标本的物像，其放大倍数是接物镜和接目镜放大倍数的乘积。

如接物镜是10×，接目镜是8×，其物像的放大倍数是10×8＝80倍。

可在接目镜内两个透镜间的光栏上可装一根剪短的毛发，做为指针，用以指示要观察的材料。

（2）接物镜：

装在镜筒下端物镜转换器的孔中，一般的显微镜有2-4个接物镜镜头，每个镜头都是由一系列的复式透镜组成的，其上也有放大倍数记号，有4×，10×，40×及100×。

4×及10×接物镜是低倍镜，40×是高倍镜，100×是油镜。

低倍镜常用于搜索观察对象及观察标本全貌，高倍镜则用于观察标本某部分或较细微的结构，油镜则常用于观察微生物或动植物更细微的结构。

（3）聚光器（集光器）：

位于载物台（通光孔）下方，由两块或数块镜组成，它能将反光镜反射来的光线集中以射入接物镜和接目镜，有的聚光器可升降，便于调光，集光器下有一可伸缩的园形光圈，叫虹彩光圈，可调集光器口径的大小和照射面，以调节光线强弱（有的显微镜只有遮光极而无集光器）。

光线过强时，可缩小虹彩光圈。

（4）反光镜：

是显微镜观察时获得光源的装置，位于显微镜镜座中央，一面为平面镜，一面为凹面镜。

转动反光镜，可使外面光线通过集光器照射到标本上。

使用时，光线强用平面镜，光线弱用凹面镜。

显微镜的使用方法

（1）取好光源（调光）

用显微镜观察标本前，先要取好光源。

首先把显微镜放在自己左肩一侧台前，镜座距桌边约两寸，镜臂朝自己，镜筒朝外。

用手转动物镜转换器，使低倍接物镜和镜筒成一直线，正对通光孔。

用左眼从接目镜向下注视，同时用手拨动反光镜，让镜面对着光源，当看到圆形镜界（视野）呈现光亮而均匀的时候即调好光了，如视野阴暗不明，则需再调节反光镜和集光器，直到视野明亮均匀为止。

若为自带电源，则在使用前打开电源开关，逐步调节光亮度旋钮，直至亮度合适为止。

（2）观察

将要观察的玻片标本放在载物台通光孔的中央，玻片标本两端用压片夹夹紧，再用手沿顺时针方向旋转粗调节器，把镜筒徐徐降到物镜头差不多接近玻片标本（约半厘米）为止（从侧面观察下降镜筒）。

然后左眼观察，边观察边用调节器将镜筒徐徐上升（逆时针方向旋转粗调节器）直到发现物象，观察清晰为止。

如果观察部分不在视野中心，可移动玻片标本到视野中心，再上下转动粗调节器至物象清晰为止。

如果要观察视野内某部分更细微的结构，则需要用高倍镜观察，首先要把观察的部分移至视野中心，然后移动物镜转换器换上高倍镜（使正对通光孔）（使用镜头转化器，不要直接扳动镜头），再用粗调节器徐徐将镜筒距离调整，至视野中出现物象，然后用细调节器调节到看清物象止。

如光线太弱，可放大虹彩光圈的口径或调节光亮度旋钮。

高倍镜下观察的标本，如果放大倍数还不够，可用油镜，换用前，同样要先在高倍镜下观察，把要观察的部分放在视野的正中央。

观察到清晰的物象之后，在盖玻片上表面的中央滴一小滴香柏油，再换上油镜头，使油镜头与香柏油接触，然后由目镜观察。

一边观察，一边用手稍移动细调节器（切忌用粗调节器）以看清物象。

用油镜观察完毕后，转开油镜，必须用擦镜纸点二甲苯擦去镜头上的香柏油。

下降镜筒，直立反光镜，使光学部件的光线不再对在一条直线上。

应当了解的是，在显微镜中观察到的物象是倒象，因此移动玻片时，应注意移动方向。

如果要使物象左移动就要向右移动玻片，同样要使物象向前移动，就要向后移动玻片。

观察结束后，降下载物台，取掉载玻片，光源调至最弱后关闭电源（为防止下次打开电源时因电流过大烧毁照明灯泡，请在关闭电源前一定将光源亮度调至最暗）。

显微镜的保养

（1）取送显微镜时，必须右手握住镜臂，左手托住镜座，轻拿轻放。

（2）显微镜的使用，一定要按实验指导写的方法和步骤，认真仔细去做，不然，容易损坏标本和镜头，又达不到看清物象的目的。

（3）观察标本时，一定要先用低倍镜观察，再用高倍镜，低倍镜能看清，就不必用高倍镜。

（4）不能用硬纸擦透镜，必须用干净的擦镜纸或细软纱布，朝一个方向擦试透镜，以免损坏镜头。

（5）不要随便转动粗细调节器，以免机器损伤，调节失灵。

（6）载物台要保持清洁、干净，不要让水或其他液体（酸、碱或其他化学药品等）流到台上，以免生锈或腐蚀。

（7）避免阳光直接照射，要防潮湿、防灰尘，经常保持镜体和镜体箱的干燥和清洁。

2．细菌涂片形态、结构的观察

将标本片置于镜台上，先练习低倍镜的使用，然后再换高倍镜和油镜观察，绘出各细菌形态图。

生物绘图的要求

（1）具有高度的科学性，不得有科学性错误。

形态结构要准确，比例要正确，要求真实感，立体感，精美而美观。

（2）图面要力求整洁，铅笔要保持尖锐，尽量少用橡皮。

（3）绘图大小要适宜，位置略偏左，右边留着注图。

（4）绘图的线条要光滑、匀称，点点要大小一致。

（5）绘图要完善，字体用正楷，大小要均匀，不能潦草。

注图线用直尺画出，间隔要均匀，且一般多向右边引出，图注部分接近时可用折线，但注图线之间不能交叉，图注要尽量排列整齐。

（6）绘图完成后在绘图纸上方要写明实验名称、班级、姓名、时间，在图的下方注明图名及

放大倍数。

生物绘图的方法

生物绘图的方法有多种，最常见的是点点衬阴法和线条衬阴法。

点点衬阴法即将图形画出后，用铅笔点出圆点，以表示明暗和深浅，给予立体感。

在暗处点要密，明处要疏，但要求点要均匀，点点要从明处点起，一行行交互着点，物体上的斑纹描出再点点衬阴。

线条衬阴法又称涂抹阴影法，是依靠线条的疏密来表示阴暗和深浅。

点点衬阴法要求不能用涂抹阴影的方法以代替点点。

生物绘图的步骤

（1）绘图前认真的观察标本，搞清实物标本的结构特点，切忌抄书或平空想象。

（2）用HB铅笔轻轻将图轮廓画出，作为草图要掌握好比例和位置。

（3）在草图的基础上绘详图，此时要用2H和3H铅笔，线条要流畅，点要匀称，点线不要

重复描绘。

（4）按注图要求绘图，写上图名及班级、姓名、放大倍数等。

五、实验要求

按实验目的的要求完成实验内容和实验报告，报告要求：

1.写出使用普通光学显微镜的注意事项。

2.按生物绘图的要求准确绘出细菌形态。

实验二生物细胞的显微结构

一、实验目的

（1）了解植物细胞的基本构造及装片观察的操作方法。

（2）了解动物细胞及基本组织的结构和功能。

（3）进一步掌握显微镜的使用方法。

二、实验材料

洋葱鳞叶、白菜叶、胡萝卜

三、实验用具

显微镜、刀片、摄子、载玻片、盖玻片、培养皿、滴管、蒸馏水、吸水纸

四、实验内容

1、植物细胞的显微结构

1.1观察洋葱鳞叶的表皮细胞

首先在干净的载玻片中央加一滴蒸馏水，然后取洋葱鳞茎剥去外皮较老的鳞叶片，用摄子撕去内部鳞片叶表皮一小块放在载玻片水滴中，将其展平后，再用摄子夹取一干净的盖玻片，将其一边放于载玻片上，和水面接触，另一边慢慢放下，以免产生气泡防碍观察。

如水不足，沿盖玻片边缘滴加，如边缘水分过多，可用纱布拭去，这样做成临时装片后，就可放置显微镜下观察。

先用低倍镜观察，再选择一个清晰的细胞用高倍镜仔细观察细胞形状及各部分构造，可见洋葱鳞片叶表皮细胞多数呈长方形，外为细胞壁，内有无色细胞质和细胞核，圆形的细胞核内可见到1-2个更小的折光较强的核仁。

由于洋葱表皮细胞较为透明，故必须缩小虹彩光圈，避免过强光线，否则反而看不清。

1.2质体

（1）观察白菜叶肉细胞中的叶绿体

取载玻片一块，在其中滴入清水，然后用摄子撕取白菜叶带叶肉的下表皮，放在载玻片的水滴中，盖上盖玻片，在显微镜下观察，可看见在叶的细胞中有许多圆形绿色颗粒－－叶绿体。

在表皮细胞中一般不含叶绿体，但在组成气孔的两个半圆的保卫细胞中可见圆形叶绿体。

（2）观察胡萝卜细胞的有色体

在培养皿中盛好水，将胡萝卜（储藏根）切成2-3cm长，用左手的食指和大姆指夹持，中指在下顶住，使胡萝卜顶部置于指上4-6mm，右手拿刀片，刀口朝内保持水平方向，自左前方向右后方拉动刀片，胡萝卜片就被切下。

为了切得厚薄均匀，刀片与材料断面要平行，左手保持平稳不动，右手拉刀迅速均匀，材料与刀片保持湿润。

切好的切片，立即放入培养皿的水中。

选择最薄的切片，做成水装片，在显微镜下观察，有色体为红橙色，不规则的颗粒或棒状。

2、动物细胞的显微结构

人口腔上皮细胞

用牙签粗的一端放在自己的口腔里，轻轻地在口腔颊内刮几下（注意不要用力过猛，以免损伤颊部）。

将刮下的白色粘性物薄而均匀地涂在载玻片上，加一滴0.7％NaCl溶液，然后加盖玻片，在低倍镜下观察。

口腔上皮细胞常几个连接在一起。

由于口腔上皮细胞薄而透明，因此光线需要暗些。

找到口腔上皮细胞后，将其放在视野中心，再转高倍镜观察。

口腔上皮细胞呈扁平多边形。

试辨认细胞核、细胞质、细胞膜。

若观察不清楚时，可在盖片一侧加一滴0.1％的亚甲基蓝，另一侧放一小块吸水纸。

如此，可使染液流入盖片下面，将细胞染成浅蓝色。

核染色较深。

注意染液不可加得过多，以免妨碍观察。

五、实验要求

（1）绘一个洋葱鳞片叶的表皮细胞，并注明各部分名称。

（2）绘白菜叶肉中的叶绿体，胡萝卜根细胞中的有色体。

（3）绘人口腔上皮细胞图。

实验三植物细胞的质壁分离与质壁分离复原

一、实验目的

（1）了解植物细胞质壁分离的原理，了解渗透势与植物水分代谢、生长及抗逆性等的密切关系。

原理：

生长的植物细胞是一个渗透系统，活细胞的原生质及其表层具有分别透性，原生质层内部含有一个大液泡，具有一定的溶质势。

当细胞与外界高渗溶液接触时，细胞内的水分外渗，原生质随着液泡一起收缩而发生质壁分离，其后，当与清水（或低渗溶液）接触，或当外面的溶质进入时，具有液泡的原生质体就又吸水而发生质壁分离复原。

（2）进一步掌握显微镜的使用方法。

二、实验材料

洋葱鳞叶

三、实验用具

显微镜、小培养皿、载玻片、盖玻片、刀片、尖头镊子、酒精灯、火柴、吸水纸适量、0.03%中性红溶液；1mol/L硝酸钾溶液

四、实验内容

（1）切下一片较幼嫩的洋葱鳞片，用单面刀片在鳞片内侧割划成0.5cm2左右的小块，用尖头镊子将内表皮小块轻轻撕下，投入0.03%的中性红溶液中染色5～10min，取出1～2片，在蒸馏水中稍加冲洗，在载玻片上滴一滴蒸馏水，小心地将制片平展到载玻片上，加盖玻片，在显微镜下观察，可以看出明显的液泡染色，无色透明的原生质层则紧贴细胞壁（在细胞的角隅上可以看见）。

（2）从盖玻片的一边滴一滴1mol/L硝酸钾溶液并在对边用滤纸吸水，将硝酸钾溶液引入盖玻片下使与制片接触并立即镜检，可看到细胞内很快发生凸形质壁分离。

（3）观察到质壁分离后，在盖玻片一边小心加清水一滴，并对边用滤纸缓缓吸去硝酸钾溶液，重复二次，使质壁分离剂（即高渗的硝酸钾溶液）被基本上洗吸掉。

镜检，可看到质壁分离停止进行，相反，带有液泡的原生质体开始重新吸水膨大，最后又充满整个细胞腔，这就是质壁分离复原现象。

质壁分离复原缓缓进行时，细胞仍会正常存活；如进行很快，则原生质体会发生机械破坏而死亡。

（4）另取一部分制片置载玻片上，先在酒精灯上加热，以杀死细胞，再引入高渗硝酸钾溶液，观察有无质壁分离发生。

五、实验要求

绘细胞的质壁分离及质壁分离复原图。

实验四原生动物的显微观察

一、实验目的

通过对大草履虫等的观察，了解原生动物的主要特征。

二、实验材料

大草履虫培养液

三、实验用具

显微镜，载玻片，盖玻片，吸管，吸水纸，5％冰醋酸。

四、实验内容

滴1滴草履虫培养液制成临时装片，在低倍镜下观察，可见许多形似草鞋的草履虫。

若其游动太快，可用吸水纸在盖玻片一侧吸去一些水，等静止后，再行观察。

首先分辨出草履虫的前、后端，前端较圆后端较尖。

选择1个比较清晰而不太活动的草履虫，将光线调暗一些观察，可见虫体长满纤毛，并时时摆动。

在虫体的前端稍后，有一斜向后直达体中部的口沟，口沟后端有胞口，其下连一短管为胞咽。

虫体最外为表膜，有弹性，当虫体穿过棉纤维时，体形可以改变。

表膜以内是透明的外质，外质内有椭圆形的刺丝泡。

外质以内是颗粒状的内质，里面有食物泡，前后有2个伸缩泡，当伸缩泡缩小时，可见其周围有6-7个放射状的长形小管--收集管。

请注意前、后伸缩泡之间及伸缩泡与收集管之间的收缩规律。

它们有何功能？

草履虫有2个细胞核，位于内质里，小核不易看到，在盖玻片一边滴1滴5％的冰醋酸，另一边用吸水纸吸水，过2～3min后，在光线充足的情况下，用低倍镜即可见到肾形的大核，换高倍镜，在大核凹处可见有一点状的结构，即为小核。

五、实验要求

1．绘草履虫的形态结构图并注明各部分的名称。

草履虫的培养方法

一、草履虫（Paramecium）

草履虫属于原生动物门的纤毛纲，是一类体型较大的原生动物，在自然界广泛分布，又容易采集和培养，是观察研究原生动物的好材料。

草履虫种类很多，其中体型最大和最常见的是大草履虫（Parameciumcaudatum）。

1.采集

草履虫通常生活在水流速度不大的水沟、池塘和稻田中，大多积聚在有机质丰富，光线充足的水面附近。

当水温在14～22℃时，繁殖最旺盛，数目最多、草履虫的这些习性，是确定采集地点和方法的重要依据。

（1）到水沟、池塘采集草履虫。

水沟和池塘是草履虫的主要生活场所。

在气候温暖的季节，到水质没有污染的水沟、池塘岸边，选择枯枝落叶多的地方，用广口瓶沿水面采集池水，这样的池水往往含有许多草履虫。

为了更有把握，可在不同地点多采几瓶。

采集后，广口瓶内要放置少许水草，瓶口不要加盖，以免草履虫因缺氧而窒息死亡。

回到实验室后，要把盛有池水的广口瓶放在温暖、明亮、阳光又不直射的地方，使瓶中的草履虫迅速繁殖。

三五天以后，对着光线用肉眼观察，如果看到水中有许多小白点在不停地游动，很可能就是草履虫。

这时，用吸管吸取一滴带有小白点的水，放在载玻片上，用显微镜进行观察，在视野中会看到各种微小生物。

如果发现有象倒置的草鞋一样的小动物，不停地螺旋运动，那就是草履虫，采集就成功了。

（2）到稻田采集草履虫。

在稻田灌水期间，寻找田中的旧稻茬，用广口瓶在稻茬附近取水，随后放进几根旧稻草。

这样的水中往往会有许多草履虫。

返回实验室后，放在温暖明亮处，三五天后，用显微镜检查是否有草履虫存在。

（3）从新鲜稻草上采集草履虫。

当环境变得干旱或寒冷时，草履虫能向身体表面分泌一层蛋白质的薄膜，虫体不吃不动，进入休眠状态。

这种状态叫作包囊。

在稻田水抽干时，草履虫便形成许多包囊，附着在稻草近根部的几节茎上。

因此，可选取新鲜稻草近根部的几节，剪成3～4厘米长的小段，放入广口瓶中，注入清水，放在明亮温暖处，一周以后，用显微镜检查是否有草履虫。

2.配制培养液

草履虫的食物主要是细菌。

为了培养繁殖草履虫，必须配制含有大量细菌的培养液。

培养液的配制方法通常有以下两种。

（1）稻草培养液。

取新鲜洁净的稻草，去掉上端和基部的几节，将中部稻茎剪成3～4厘米长的小段，按1克稻草加清水100毫升的比例，将稻草和清水放入大烧杯中，加热煮沸10～15分钟，当液体呈现黄褐色时停止加热。

这样的液体，由于加热煮沸，只留下了细菌芽孢，其它生物已均被杀死，为培养草履虫创造了良好条件。

为了防止空气中其它原生动物的包囊落入和蚊虫产卵，烧杯口要用双层纱布包严。

然后放置在温暖明亮处进行细菌繁殖。

经过3～4天，稻草中的枯草杆菌的芽孢开始萌发，并依靠稻草液中的丰富养料迅速繁殖，液体逐渐混浊，等到大量细菌在液体表面形成了一层灰白色薄膜时，稻草培养液便制成了。

由于草履虫喜欢微碱性环境，如果培养液呈酸性，可用1％碳酸氢钠调至微碱性，但pH值不能大于7.5。

（2）麦粒培养液。

将5克麦粒（大麦、小麦均可）放入1000毫升清水中，加热煮沸，煮到麦粒胀大裂开为止。

然后在温暖明亮处放置3～4天，便制成了麦粒培养液，此时培养液中已繁殖有大量的细菌。

3.接种

接种是指将采集来的草履虫转移到培养液的过程。

接种草履虫时必须提纯，否则会混入其它小动物。

这不但会影响草履虫的纯度，而且一旦混入草履虫的天敌水轮虫（Rotaria），将会使培养液中草履虫的数量急剧下降。

接种时，先将含有草履虫的水液吸到表面皿中，再将表面皿置于低倍显微镜或解剖镜下检查，发现有草履虫后，用口径不大于0.2毫米的微吸管，将表面皿中草履虫逐个吸出，接种到培养液的广口瓶中进行繁殖。

如果要培养纯系的草履虫，可按上述方法，在显微镜或解剖镜下，从表面皿中吸出一个草履虫，放入盛有少量培养液的凹玻片中，上面再覆盖一片凹玻片，用以防止培养液干燥。

待草履虫经过横分裂达到20～30个个体时，移到培养液的广口瓶中进行繁殖。

4.培养

（1）将接种有草履虫的培养液的广口瓶，放在温暖明亮处进行培养，培养液的容器口要用纱布包严。

大约1周后，就会有大量草履虫出现。

（2）如果是长期培养，就要定期更新培养液。

这是因为随着虫体大量繁殖，培养液中营养逐渐减少，而虫体排出代谢物却又不断增加，这就会引起草履虫数量减少甚至全部死亡。

因此在培养过程中，每隔3天左右须更新一次培养液。

更新时，用吸管从广口瓶底部吸去培养液及沉淀物，每次要吸去一半培养液，加入等量新鲜培养液。

这样可使草履虫长期得到保存。

方法一：

将稻草用水煮沸，然后添加部分自来水，使稻草与水的比例大致达到1：

100，同时将水温控制在20℃左右，或者也可以放置在阳光下照射。

如此，大约经过10余天后，草履虫便会在此环境中自行繁殖出来。

但需要即时捞取，并不断添加适量的新水和煮沸的稻草，草履虫就会不断地生长，这样就可以用之不竭了！

草履虫的培养方式是非常简单，也可以说没有任何操作上的麻烦，而且培养的数量，可以根据实际需求情况自行调整容器的大小来决定。

但是，这种以人工方式培养的草履虫毕竟营养不够丰富。

一般情况下，并不适合长期喂饲，一旦仔鱼可以进食一些体型较大的饵料的时候，就应该改换其他饵料，以不影响它们的正常发育生长。

实验五叶绿体色素的提取、分离及含量测定

一、实验目的

（1）掌握叶绿素的提取、分离和定量测定方法。

（2）熟练掌握分光光度计的使用原理及其方法。

二、实验原理

根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其光密度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。

根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的光密度D与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，

即：

D=kCL

式中：

k为比例常数。

当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，k为该物质的比吸收系数。

各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的光密度而求得。

如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总光密度等于各组分在相应波长下光密度的总和，这就是光密度的加和性。

测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的光密度D，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。

在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

已知叶绿素a、b的80%丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm和645nm，

又知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的比吸收系数分别为82.04和9.27，在波长

645nm下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式：

D663=82.04Ca+9.27Cb

（1）

D645=16.75Ca+45.60Cb

（2）

式

（1）、

（2）中的D663和D645为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时的光密度，Ca、Cb分别为叶绿素a和b的浓度，以mg/L为单位。

解方程组

（1）、

（2），得：

Ca=12.72D663–2.59D645（3）

Cb=22.88D645–4.67D663（4）

将Ca与Cb相加即得叶绿素总量（CT）：

CT=Ca+Cb=20.29D645+8.05D663（5）

另外，由于叶绿素a、b在652nm的吸收峰相交，两者有相同的比吸收系数（均为34.5），

也可以在此波长下测定一次光密度（D652）而求出叶绿素a、b总量：

CT=Ca+b=（D652×1000）/34.5（6）

在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。

丙酮提取液中类胡萝卜素的含量：

Ck=4.7D440-0.27Ca+b

由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。

叶绿素a、b在96%乙醇中最大吸收峰的波长分别为665nm和649nm，

类胡萝卜素为470nm，可据此列出以下关系式：

Ca=13.95D665–6.88D649（7）

Cb=24.96D649–7.32D665（8）

Ck=（1000D470–2.05Ca–114.8Cb）/245（9）

三、实验材料

新鲜的菠菜叶片

四、实验用具

分光光度计、研钵、剪刀1把、玻璃棒、25ml棕色容量瓶3个、小漏斗3个、直径7cm定性滤纸、吸水纸、擦镜纸、滴管、电子天平、大试管（带胶塞）、大头针、毛细管、96%乙醇、石英砂、碳酸钙粉。

推动剂：

按石油醚：

乙醚（4：

1）（V／V）。

五、实验内容

1、叶绿体色素的提取

（1）取新鲜植物叶片，擦净组织表面污物，剪碎，混匀。

（2）称取剪碎的新鲜样品1g，共2份，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3mL96%乙醇，研成匀浆，再加96%乙醇5mL，继续研磨至组织变白，静置3～5min。

（3）取滤纸1张，置漏斗中，用96%乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到