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SOPHCV
中国人民解放军第一八一医院
HCV抗体初筛实验室
标准操作程序(SOP)
(第四版)
编写人:
唐立红、吴润强
审核人:
陈洁晶
批准人:
眭维国
启用时间:
2008年2月2日
目录
程序文件的管理和维护制度--------------------------------------------------------------------------------3
标本接收、贮存、处理标准操作程序--------------------------------------------------------------------4
HCV抗体初筛检测过程标准操作程序---------------------------------------------------------------------6
万泰ELISA(间接法)试剂-------------------------------------------------------------------------------7
结果解释与报告标准操作程序----------------------------------------------------------------------------9
实验室清理与消毒标准操作程序-------------------------------------------------------------------------10
存档管理与追踪标准操作程序----------------------------------------------------------------------------12
HCV筛查实验室安全标准操作程序-----------------------------------------------------------------------15
职业暴露处理标准操作程序-------------------------------------------------------------------------------17
酶标仪使用与维护标准操作程序-------------------------------------------------------------------------18
洗板机使用与维护标准操作程序-------------------------------------------------------------------------21
实验室人员配置及培训程序-------------------------------------------------------------------------------23
测量仪器设备校准程序-------------------------------------------------------------------------------------25
实验室试剂、耗材购买管理程序-------------------------------------------------------------------------26
普通冰箱使用、维护和保养标准操作程序-------------------------------------------------------------28
移液器使用和维护标准操作程序-------------------------------------------------------------------------30
移液器校准操作程序----------------------------------------------------------------------------------------32
普通离心机使用和维护操作程序-------------------------------------------------------------------------33
垃圾处理记录表---------------------------------------------------------------------------------------------34
程序文件的管理和维护制度
1.目的:
HCV程序文件是指导HCV检测及相关环节的法规性文件,属内部受控文件,不得擅自修改、涂改,不得遗失、外借翻印。
为保持其现行有效和持续适应性,并确立因条件变化进行修改的程序。
2.编写依据:
全国HCV检测技术规范NationalGuidelineforDetectionofHCV(2004年版)
3.适应范围:
HCV筛查实验室程序文件及标准化操作程序
4.内容:
程序文件应包含下列内容:
文件名称、编号、页号、总页数例:
页眉
文件名称程序文件的管理和维护
编号
日期年月日
版本
责任部门
第页共页
页底应有:
编写人:
XXX批准人:
XXX生效日期:
XX年XX月XX日。
5.编制及职责:
程序文件由HCV实验室负责人主持编写、修订、审核并保持它的现行有效性。
由科主任批准和颁布实施,并负责解释。
6.发放与持有者责任:
程序文件由科主任批准发放,发放与回收要登记签字,由HCV实验室负责人保管,并组织全室工作人员认真学习,了解内容,熟悉其中各项规定,程序文件执行情况纳入实验室目标管理,与奖惩挂钩。
持有者调任时,要收回该程序文件。
7.修订:
科室任何工作人员均可提出对程序文件的修改建议,文件修改须经有关人员讨论,HCV实验室负责人根据条件变化提出是否修改的决定,如作小的修改则可在修改页上进行,修改文件经科主任审核批准后,并填写入程序文件修改页。
如果文件须作重大修改,HCV实验室负责人可进行改版。
新版程序文件经科主任批准后生效,收回旧版,并予以销毁,登记签字后发出新版,保证工作现场只有唯一的,最新的使用版本。
标本接收、贮存、处理标准操作程序
编号:
HCV/SOP/001
1范围
本章规定了用于丙型肝炎病毒抗体(HCV)检测的血清、血浆采集和处理方法,适用于HCV抗体检测。
2规范性引用文件
GuidelinesforUsingHCVTestingTechnologiesinSurveillance
WHO/CDS/CSR/EDC/2001.16UNHCV/01.22EISBN9713-92-063-7.
3操作步骤
3.1样品的采集和处理
丙型肝炎病毒抗体检测最常用的样品是血液,包括血清、血浆。
唾液或尿液有时也可作为测试样品。
本室主要进行HCV抗体的酶标检测,采用血清标本。
常用的血液样品的采集和处理方法如下:
3.1.1血清样品采集和处理
3.1.1.1用一次性注射器(或真空采血管)抽取一定量静脉血,室温下自然放置l~2h,待血液凝固、血块收缩后再用3000r/min离心15min,分离出血清备用。
3.1.3采集样品注意事项
3.1.3.1采集样品原则上应按临床采血技术规范操作(试剂盒说明书有特殊要求除外)。
3.l.3.2采集样品时应注意安全,建议采用真空采血管及蝶形针具,以避免直接接触血液;直接接触HCV感染者/艾滋病(AIDS)病人血液/体液的操作,应戴双层手套。
3.2接收标本
3.2.1标本采集:
生化管抽取静脉血2ml以上
3.2.2标本性状:
无溶血、细菌污染、脂血及黄疸,严重溶血或污染的标本应重取。
3.2.3检查标签上姓名、床号、科室字迹是否清晰,是否与HCV抗体检测单一致,如不一致必须与临床科联系,并予改正。
如标本均符合以上要求才可接收签名。
3.3样品的保存
3.3.1用于抗体检测的血清或血浆样品,应存放于-20℃以下,短期(1周)内进行检测的样品可存放于立式冰箱专用的试管架上2-8℃。
如标本要保留一个月以上,必须将血清样本
冻存于-80℃以下。
3.3.2用于核酸检测的血浆和血细胞样品应冻存于-20℃以下,进行病毒RNA检测的
样品如需保存3个月以上应置于-80℃。
3.4废弃标本处理
对于检测过的样本要求放在专用4℃冰箱保存一周,以便核查。
一周以后要丢弃的标本倒入专用容器中,加入5000mg/L次氯酸钠浸泡,然后送医院统一医疗垃圾处理点处理。
HCV抗体初筛检测过程标准操作程序
编号:
HCV/SOP/002
1范围
本章规定了HCV抗体的检测方法、检测程序、检测报告及检测策略,适用于本院针对临床患者的HCV抗体实验室。
可作为对HCV感染者病人的诊断、报告和处理的实验室依据。
2规范性引用文件
RevisedrecommendationsfortheselectionanduseofHCVantibodytests.
WHO/UNHCVRevisedversion2001.
实验室生物安全通用要求(GB19489-2004)。
3HCV抗体检测的目的和要点
3.1HCV抗体检测的目的
3.1.1HCV抗体检测可用于监测、诊断、血液筛查。
3.1.2以监测为目的的检测是为了解不同人群HCV感染率及其变化趋势而进行的检测,检
测的人群包括各类感染人群和一般人群。
3.1.3以诊断为目的的检测是为了确定个体HCV感染状况而进行的检测,包括临床检测和
自愿咨询检测、术前检测、根据特殊需要进行的体检等。
3.2HCV抗体检测的要点
3.2.1严格遵守实验室标准操作程序(SOP)。
3.2.2严格按照试剂盒说明书操作。
3.2.3注意防止样品间交叉污染。
4检测
4.1试剂:
所用试剂应为国家批准注册,并经中国药品生物制品检定所“批批检”合格,且
在有效期内的一流国产或是进口试剂检测。
本室采用北京万泰的试剂。
4.2操作:
接收标本后用间接酶联免疫法HCVELISA(万泰)试剂进行检测,详见(HCV/SOP/004)。
5报告
5.1阴性报告:
经一种试剂检测为阴性反应,报告:
HCV抗体阴性。
5.2阳性报告:
经一种试剂检测为阳性反应,报告:
HCV抗体阳性。
万泰ELlSA(间接法)试剂
编号:
HCV/SOP/003
1设备和材料(详见附件)
1.1北京万泰生物药业股份有限公司
丙型肝炎病毒抗体(酶联免疫法)
检测原理:
本试剂盒采用间接法酶联免疫吸附法原理。
在微孔条上预包被基因重组HCV结构和非结构区抗原,配以酶标记IgG抗体及TMB显色剂等其它试剂。
检测人血清或血浆中的丙型肝炎病毒抗体。
适应范围:
丙型肝炎病毒抗体辅助检查及献血员筛查。
2工作流程:
2.1用去离子水或蒸馏水20倍稀释浓缩洗涤液。
2.2将所需数量的条板固定于支架,按顺序编号,设置样品孔、空白对照孔(用双波长检测,可不设空白对照孔)、阳性对照孔和阴性对照孔(阳性对照2孔,阴性对照3孔)。
每孔加100μl稀释液,空白孔除外,然后分别在相应孔中加入待测样品或阴性阳性对照10μl,轻轻振荡混匀。
2.3置37℃水浴温育60分钟。
2.4将孔内液体甩干,置洗板机用洗涤液充分洗涤5遍,扣干,(注:
洗涤时各孔要加满洗液,勿使孔间交叉污染。
采用洗板机时应设定每遍有40秒的浸泡时间)。
2.5每孔加入100μl酶标试剂空白孔除外,轻轻振荡混匀。
2.6置37℃水浴温育30分钟。
2.7将孔内液体甩干,置洗板机用洗涤液充分洗涤5遍,扣干,(注:
洗涤时各孔要加满洗液,勿使孔间交叉污染。
采用洗板机时应设定每遍有40秒的浸泡时间)。
2.8每孔加显色剂A50μl和显色剂B50μl,轻拍混匀置37℃避光温育30分钟。
2.9每孔加入终止液50μl终止显色反应。
2.10用酶标仪单波长450nm(需设空白对照并以空白对照孔调零)或双波长450/630nm测定各孔A值。
2.11完成实验
2.11.1未用完的试剂盒放回冰箱。
2.11.2关闭酶标仪和洗板机。
2.11.3处理各种废物,清洁和消毒工作区。
2.11.4保存标本:
阳性或可疑阳性的标本要离心吸取血清,并分装数管冻存,以备复检或送检。
3结果判定:
3.1临界值(cutoff)=0.12+阴性对照的A值
3.2样品的A值≥cutoff值者为HCV抗体反应阳性
3.3样品的A值 3.4正常时,阴性对照A值应≤0.08阳性对照≥0.5 3.5对于可疑结果应重新取样进行双孔复试 4记录与报告 4.1填写“仪器使用登记表”,“垃圾处理登记表”。 4.2阴性报告: 经一种试剂检测为阴性反应,报告: HCV抗体阴性。 4.3阳性报告: 经一种试剂检测为阳性反应,报告: HCV抗体阳性。 5注意事项 5.1检查水浴箱的温度(37℃),移液器的准确性。 5.2操作 按照试剂盒说明书规定的操作步骤进行检测,试剂盒的说明书要统一集中保管。 5.3加标本和质控时要注意,冻融或长期存放的标本加样前应摇匀,有絮状沉淀时应离心取上清。 5.4每次试验应包括1孔空白,3孔阴性对照,2孔阳性对照,并加外部对照。 空白对照只加底物和终止液。 所有使用过的吸头要放入盛有消毒剂的容器内。 5.5未用完的板条应置于有干燥剂的密封袋中。 5.6显色 每孔加显色A液、B液各50µl,在37℃环境下温育30分钟后,加终止剂50µl终止显色。 注意避光。 加样要求准确,加酶、A液、B液、终止液时尽量用移液器加。 5.7读数(程序见HCV/SOP/006) 终止显色后在30分钟内读数,酶标仪用检测波长450nm,参考波长为630nm。 结果解释与报告标准操作程序 编号: HCV/SOP/006 1范围 本章规定了HCV抗体初筛实验中各种结果的解释,适用于临床患者及自愿检测者结果的报告与解释。 2规范性引用文件 全国丙型肝炎病毒检测技术规范NationalGuidelineforDetectionofHCV(2004年版) 3结果的报告 3.1阴性对照孔A值≤0.08,阳性对照孔A值≥0.50,否则实验无效 3.2若有1孔阴性对照A值≥0.08应舍弃;若有两孔或两孔以上阴性对照A值≥0.08应重复实验。 3.3阴性判定: 样品A值<临界值(CUTOFF)者为HCV抗体阴性。 3.4阳性判定: 样品A值>临界值(CUTOFF)者为HCV抗体阳性(注意: 可疑结果应重新取样双孔复试) 4.检验方法局限性 4.1由于方法学原理的限制,本试剂检测结果阴性并不排除丙型肝炎病毒感染的可能性,阳性结果必须结合其他指标判断。 4.2本试剂为定性试剂,不能做为定量试剂使用 4.3本试剂仅用于人血清或血浆样品的检测。 实验室清理与消毒标准操作程序 编号: HCV/SOP/008 1范围 本章规定了HCV抗体初筛实验中室中各种清理与消毒规定、标准、措施。 为了保护操作者,对HCV污染物进行无害化处理,以防止污染物感染其它人。 2规范性引用文件 全国艾滋病检测技术规范NationalGuidelineforDetectionofHCV(2004年版) 3HCV常用的消毒方法 3.1实验室的清理与消毒是个人防护、防止暴露的重要措施之一,要求严格按《全国丙型肝炎病毒检测技术规范》进行。 3.2从免疫实验室出来的所有废弃物,包括不再需要的样品,培养物和其它物品,均应 视为感染性废弃物,应置于专用的密封防漏容器中,容器中加入5000mg/L次氯酸钠,进行消毒处理30分钟后,安全运至医院统一的医疗垃圾处理点进行进一步处理。 高压蒸汽消毒,121℃,保持15—20分钟。 干燥空气烘箱消毒,140℃,保持2—3小时。 化学消毒,常用的化学消毒剂是含氯消毒剂(次氯酸钠、含有效氯2000—5000mg/L)、 75%乙醇、2%戊二醛,保持30分钟。 废弃物缸: 5000mg/L次氯酸钠。 工作台面: 2000mg/L次氯酸钠。 仪器表面;75%乙醇。 冰箱、水浴箱;75%乙醇。 3.3工作台面、地面、仪器表面每天都要进行消毒处理,冰箱、水浴箱等定期进行消毒,清洗后要干燥20分钟以上。 实验室环境每天操作前和操作后都要用紫外线照射30分钟以上。 紫外线强度要经常监测。 3.4每次穿过的污染的防护服应及时放入污衣袋中,待消毒后方可洗涤或废弃。 3.5操作中有标本、检测试剂外溅时应及时消毒。 对大量溅出的高浓度传染物在清洁之前应先用5000mg/L有效氯清洗消毒剂溶液浸泡,然后戴上手套擦挣。 3.6加样用的吸头用过后直接打入防漏容器中,容器中加入5000mg/L次氯酸钠,消毒剂的量要足够浸入所有吸头。 至少浸泡半小时以上,然后作为医疗垃圾送医院统一处理。 3.7锐器医疗垃圾放入专用的一次性锐器桶中,锐器桶中加入5000mg/L次氯酸钠,浸泡 30分钟以上,丢弃时连锐器桶一起安全运送到医院医疗垃圾处理点。 3.8其它医疗垃圾: 垃圾桶上要套上专用医疗垃圾袋(黄色),垃圾丢弃前30分钟,向袋中倒入5000mg/L次氯酸钠,然后连垃圾袋一起送医疗垃圾处理站处理。 存档管理与追踪标准操作程序 编号: HCV/SOP/009 1范围 本章规定了HCV抗体初筛实验中各种档案的归档与档案管理方法,目的是为了规范化管理,方便数据调取查询,同时为了保密,完整的档案管理也是自我保护的重要环节,为各种医疗事故提供客观依据。 2规范性引用文件 全国丙型肝炎病毒检测技术规范NationalGuidelineforDetectionofHCV(2004年版) 3存档程序 存档是追踪与处理的关键步骤,如果没有完整的数据,没有规范的档案,追踪与处理只是一纸空文。 HCV实验室建立了专门的档案柜,建立了12个档案盒,每个档案盒存不同的内容,档 案盒暂存短期文件,当积累较多资料后要装订成册,做封面,标明日期及档案号,分门别类封存,放入资料室专用资料柜内,资料柜外面要贴上标签,标明类别。 档案盒外面要标记清楚,含如下内容: 资料名称、起止日期。 目前所建档案盒有: 室内质量控制档案、原始记录档案、试剂批批检报告档案、HCV初筛阳性送检档案、HCV抗体确认档案、HCV政策与法规档案、职业暴露登记档案、标准操作程序档案、仪器使用登记档案、仪器设备校准档案、HCV培训与认证档案、室间质评档案。 原始实验记录归档: 每次的原始实验记录填写完后与结果登记表、仪器打印OD值粘贴在一起,按时间顺序放入档案盒中,积累一个月后做一个封面,标记时间,名称等内容,装订成册。 暂存于HCV实验室档案柜中,一年后入资料室档案管理。 保存10年以上。 其余文件归档与上面程序一样。 所有文件归档后由专人管理,必须保证档案的完整、齐全,入档与管理要规范化、正规化、HCV档案有特殊性,每个环节都要注意保密。 档案的查询、追溯都必须由专人进行, 档案室也要有专人管理,非本室人员不能随意进出。 4档案管理程序 调档申请: 如要对数据进行追踪,先向负责人申请,经审查同意后才能接触资料原件。 调档过程: 非HCV管理人员追踪数据必须经由HCV资料管理员,防止泄秘、方便查找、 避免弄乱资料。 追踪人向本室HCV资料管理员提交要追踪的受检者信息,如: 姓名、ID号、 大约检测日期等信息,越详细越好,以方便管理员快速调出资料。 2005年以前未启用实验 室信息管理系统,追踪住院病人结果时可以查询住院时间,估计大概检测时间段,然后按年 月调出部分资料进行查阅。 如非住院受检者要求提供大概检测时间,尽量缩小时间范围,以方便查找。 2005年以后的检测结果都已输入实验室管理系统,可以直接按ID号、姓名等内容进行 查询,可以查到具体到哪一天的历史电子记录,然后根据查到的时间很快捷地调出档案资料。 根据结果登记表上的检测号可以对应查到原始记录上加样位置,然后对照仪器打印结果可以 方便地查到该受检者OD值。 如要查找某次检测结果失控与否,可以对应原始记录加样蓝图找到质控位置,从仪器找 打印结果上相应位置找出该质控OD值,然后调出这段时间质控记录,看所记录OD值是否与打印结果一致,再看质控图上监控标记是否显示失控。 如要查该次检测所用仪器信息,只要对应受检者信息,按上程序找出原始记录,然后对 应原始记录上的时间调出仪器档案,便可以方便地找到检测该受检者所用仪器的时间,仪器状态、仪器名称、校准时间、维护记录等信息。 如要查该受检者所用试剂信息,可以按上程序调出原始记录,然后查出所用试剂批号, 再从试剂批批检档案中找出批批检报告。 如要查该受检者检测时试验是否成立,只需按上程序找出原始实验记录,看原始记录中 各项判别试验成立与否的标准是否符合即可。 资料管理员调出的各种资料必须与追踪人一起查阅,无特殊原因不得复印,而且必须复 印的特殊情况要上报负责人同意后方可进行。 追踪完毕后资料管理员要及时将资料归位,然 后检查看有无遗漏。 5处理程序 追溯的结果具有法律效力,无论追溯的原因是否属于医疗纠纷,对结果产生的漏洞都要 严肃对待。 追溯可能是医疗纠纷时要求取证,但我们要经常性自查自纠。 定期由科室不同人员对实 验结果进行试验性追溯,看有无安全隐患、有无漏洞。 对于医疗纠纷取证时所发现的漏洞要按法律程序追究当事人和负责人的法律责任,或视 情节严重程度给予行政处罚或经济处罚。 对于自查自纠所发现的漏洞视情节严重程度给予经济处罚或行政处罚。 HCV初筛实验室安全标准操作程序 编号: HCV/SOP/010 1范围 本章规定了HCV初筛实验室的各种安全规定,以加强生物安全,保护操作人员,防止重大事故发生,所有进入实验的人员要遵守该规定。 2规范性引用文件 全国丙型肝炎病毒检测技术规范NationalGuidelineforDetectionofHCV(2004年版) 3安全规定细则 1、进入实验室应穿防护服,戴手套,防护服置于实验室清洁区内专用存放处。 不用戴手套的手触摸暴露的皮肤、口唇、眼睛、耳朵和头发等。 2、离开时应脱去防护服,每次穿过的污染的防护服应及时放到污衣袋中,待消毒后方可洗涤或废弃。 3、当含有HCV的液体(样品或病毒培养液)有可能溅到工作人员时,应使用防渗透性的(如塑料)围裙。 4、当发现防护服已被污染时,应立即更换。 5、进入实验室应换专用的工作鞋或穿上鞋套。 6、皮肤的任何伤口和擦伤都应以防水敷料覆盖。 7、进实验室前要摘除首饰,修剪长的带刺的指甲,以免刺破手套。 8、如果接触物传染危险性大,则应戴双层手套和防护眼罩。 操作时手套破损,应立即丢弃、洗手消毒并戴上新手套。 9、严禁在HCV实验室内进食、饮水、吸烟和化妆。 10、HCV实验室所用的个人防护装备均应符合国家有关标准的要求。 11、禁止采用口腔吸液管,必须使用移液器来操作实验室的所有液体标本或试剂。 12、操作中有标本、检测试剂外溅时应立即用大量清水冲洗,及时消毒。 对大量溅出的高浓度传染物在清洁之前应先用5000mg/L有效氯清洗消毒剂溶液浸泡,然后戴上手套擦净。 13、工作完毕,要用500mg/L有效氯清洗消毒剂溶液对工作台面消毒,清洗后要干燥20分钟以上,并用紫外线消毒30分钟以上。 严格执行消毒隔离制度。 14、工作完毕,脱去手套后洗手,再脱去工作衣,用肥皂和流动水洗手。 15、加强人员培训。 向管理人员和所有检测人员提供并完成相关的充足有效的技术
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