有机酸苹果酸的发酵生产工艺设计.docx
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有机酸苹果酸的发酵生产工艺设计
有机酸—苹果酸的发酵生产工艺设计》报告
精细0520陈思陈姣丽孙鑫冯琪
(有机酸的分类:
1、柠檬酸
柠檬酸是生物体主要代谢产物之一,在自然界中分布很广,主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中,尤其以未成熟者含酸量较多。
植物叶子中(如烟叶、棉叶、菜豆叶等)也含有柠檬酸。
柠檬酸在植物体内常与苹果酸、草酸及酒石酸等共同存在。
在动物中,柠檬酸存在于骨骼、肌肉、血液、乳汁、唾液、汗和尿中,或者以游离状态或金属盐类的形式存在。
2、乳酸
早在1841年,Boutron和Fremy的记载中就有关于乳酸的生产方法,即是将麦芽或酸乳放入淀粉浆和牛乳中,任其自然发酵,然后逐渐中和而的记载中就有关于乳酸的生产方法,即是将麦芽或酸乳放入淀粉浆和牛乳中,任其自然发酵,然后逐渐中和而产出乳酸。
但是,实际上用工业方法生产乳酸是在1881年开始于美国。
约在1894年,乳酸开始成功地用于皮革和纺织工业,当时美国的生产量折合纯品约为每年5吨。
我国也早就有乳酸盐额度研究和生产。
1944年,重庆振元化学药品厂首先生产乳酸钙,在1955年发表了“乳酸发酵和乳酸钙制造”一文。
该厂以后迁到无锡,改名为无锡第二制药厂,生产乳酸钙。
现在已采用真菌制剂代替砻糠曲的生产工艺,采用大米等为原料,并发行发酵法生产乳酸钙。
3、醋酸
醋酸发酵可以说是起源于食醋发酵,而食醋发酵在古代最早只是酿酒受细菌污染的结果,即所谓“酒酸变醋”。
因此醋酸发酵的历史几乎与酿酒一样悠久,可以追溯到一万年以前。
中国的“醋”一词有陈酒之意。
能生产食醋的原料很多,如葡萄、苹果、麦芽、谷物原料、乳清等天然含糖原料皆可。
我国食醋生产的历史非常悠久,现已有多种风味和特色的食醋生产方法。
早先获得醋酸的方法有天然发酵醋的蒸馏和木材的分解蒸馏(所谓“木醋”)。
真正的醋酸发酵应该说是从快速制醋法开始发展起来的,它是现代淋醋工艺的前身。
快速制醋工艺由德国学者舒莱巴赫在1823年首先提出,因此在国外称为“德国工艺”。
4、葡糖酸
1880年,Boutroux首先发现利用微生物的氧化作用,能将葡萄糖氧化成葡糖酸。
他发现用醋化醋杆菌能发酵葡萄糖产生一种不挥发酸,后来确定为葡糖酸。
以后许多研究者也相继报道,其他数种细菌也能产生葡糖酸或酮基葡糖酸。
本世纪30年代以前,细菌发酵是生产葡糖酸的主要方法。
1922年,Molliard发现,利用霉菌的氧化作用也能产生葡糖酸。
后来人们知道,黑曲霉、米曲霉、文民曲霉和青霉都有上述氧化作用。
Bernhager1942年发现,采取中和生成酸的方法,黑曲霉能高效地将葡萄糖转化成葡糖酸,而添加碳酸钙最好。
在较低温度、限制氮源的条件下,生成的葡糖酸几乎可达理论产率。
我国在1955年由轻工业部上海工业试验所试制葡糖酸成功,选出了黑曲霉87号菌种,不久即在山东投入生产。
目前,我国已经有数家葡糖酸发酵工厂。
5、衣康酸
衣康酸(又称为甲叉琥珀酸、分解乌头酸)最早是由Baup1836年蒸馏分解柠檬酸时发现的。
而微生物产生衣康酸的能力是日本人木下广野1929年在一种嗜高参压的霉菌培养物中首先发现的,他称之为衣康酸曲霉。
原来Raistrick通过对霉菌代谢物的长期研究发现,土曲霉表面培养时也能产生衣康酸。
我国的衣康酸生产尚属空缺。
金其荣等人于1984年开始着手对衣康酸产生菌进行选育和工艺条件的研究。
6、苹果酸
苹果酸广泛存在于生物体中,它在很多水果中是占优势的酸。
微生物产生苹果酸的能力也早已被人们所认识,早在1928年,Yuill就报道过,在培养黄曲霉时,有少量苹果酸伴随琥珀酸和富马酸产生。
Schreyer1931年报道,在丛花青霉的表面培养液中,生成的有机酸钙相当于耗糖的1/4,其中大部分是苹果酸钙。
Bernhauer等报道,在蔗糖为碳源的黑曲霉发酵液中,除生成大量的柠檬酸之外,也有少量苹果酸生成。
我国在发酵法生产苹果酸方面也有很大进展。
北京微生物研究所研究了固定化皱褶假丝酵母的苹果酸生产技术。
福建三明真菌研究所试验过L-苹果酸的霉菌固体发酵。
6/1苹果酸的性质
苹果酸是一种较强的有机酸,又名羟基丁二酸,是一种白色或荧白色粉状、粒状或结晶状固体。
晶体中不含结晶水,DL-型熔点129℃,L-型熔点100℃,加热到180℃可以失水分解成富马酸或马来酸。
在通常条件下,苹果酸是稳定的,但其纯晶体稍有吸湿性,在高湿度条件下可能液化。
在相对湿度98%,25℃下放置6天,约增重50.4%.
苹果酸在催化剂存在下与醇可发生酯化反应。
以三氟化硼为催化剂与醇回流可形成单酯。
与多元醇、芳香多元羧酸作用,可形成树脂类产品,如醇酸聚酯树脂。
在氧化银存在下,苹果酸酯与卤代烷反应可以产生醚类,如乙氧基琥珀酸。
在醇溶液中,苹果酸酯与氨作用,可以生成苹果酸酰胺。
6/2苹果酸的发酵机理
L-苹果酸在生物体中普遍存在,它作为三羧酸循环的一员而参与细胞代谢。
在一般生物中它只参与循环而不会大量积累,否则会造成代谢流的阻塞。
要想积累苹果酸,必须要有补充4碳酸的途径。
理论上讲,补充4碳酸的途径有两种:
乙醛酸循环和丙酮酸羧化支路。
实际上,苹果酸的生物合成机理虽然早就研究得很清楚,但它只是从生物生理学的角度去研究的。
对于微生物发酵中苹果酸合成机理尚没有进行过细致研究。
一般认为,苹果酸发酵牵涉到CO2的固定(即丙酮酸羧化),其证据有:
发酵依赖于CaCO3或其他碳酸盐,添加生物素可以促进苹果酸积累等。
但是,CO2固定反应在各种菌的发酵中究竟占多大比例还未见有报道。
毫无疑问,无论有无乙醛酸循环存在,提高丙酮酸羧化的比例则能提高碳源的利用率,也即能提高苹果酸产率。
因此,这是苹果酸发酵值得研究的课题。
6/3苹果酸发酵微生物的分类
一、黄曲霉
二、米曲霉
三、寄生曲霉
四、华根霉
五、无根根霉
六、膜瞨毕赤酵母
七、短乳杆菌
八、产氨短杆菌
6/4苹果酸的发酵工艺
L-苹果酸的发酵工艺大体可以分为三类:
一步发酵法、两步发酵法和酶法转化。
一步发酵又称为直接发酵,它用糖类为原料,用霉菌直接发酵产生苹果酸。
两步发酵法也是用糖类为原料,先由根霉发酵成富马酸(或富马酸-苹果酸混合物),再由酵母或细菌转化成苹果酸。
酶法转化是用富马酸(盐)或马来酸为原料,用微生物酶(包括全细胞)转化成苹果酸。
与化学合成法不同的是,发酵方法利用了微生物酶的立体异构专一性,生产的都是L-苹果酸,是生物体内所存在和可以利用的构型,而化学合成法只能生产DL-苹果酸,如作为食品和药物,则有一半不能得到利用。
6/4.1直接发酵工艺
(一)菌种扩大培养
用于苹果酸直接发酵的黄曲霉和米曲霉都易于产生孢子。
将保存在麦芽汁琼脂斜面上的黄曲霉孢子用无菌水洗下,接到三角瓶中。
瓶中装有种子培养基。
在33℃静置培养2~~4天,待长出大量孢子,接到种子罐中。
种子罐装有下述种子培养基(g/L)
葡萄糖(水解糖中)30
豆饼粉10FeSO40.5
K2HPO40.2NaCL0.01
MgSO40.1CaCO360(单独灭菌)
种子罐培养的目的是使孢子发芽,以缩短生产罐的发酵迟滞期。
种子罐的体积是生产罐的10%,装液70%,例如50L罐装液35L。
在100℃灭菌20~30min后,冷至40℃以下,加入单独灭菌的CaCO3,接种黄曲霉孢子后在33~34℃通气搅拌培养。
通气量0.15~0.3vvm,罐压维持100KPa,加入泡敌(50l罐加20ml)抑制泡沫生成。
培养18~20h后接入生产罐。
(二)发酵规程
发酵培养基采用葡萄糖70~80g/l,其余成分与种子培养基相同。
生产培养基除CaCO3以外,直接在生产罐内配制,在缓慢搅拌下直接通蒸汽升温至100℃,维持20min灭菌。
冷至40℃时,加入单独灭菌(干热160℃,2h)的CaCO3。
当品温降到34℃时,接种10%种子培养液,通气搅拌进行发酵。
发酵时控制温度33~34℃,通气量0.7vvm,搅拌转速180r/min,泡沫自由控系统流加泡敌控制。
整个发酵过程约需40h。
待残糖降到1g/l以下,放罐进入提取工序。
(三)、影响苹果酸发酵的因素
1.氮源
2.碳酸盐种类
3.碳酸钙用量
4.碳源种类
5.金属离子
6.铁盐
7.抑制剂
8.氨基酸和维生素
9.温度
6/4.2两步发酵工艺
两步发酵是先用根酶将糖类发酵成富马酸(或富马酸与苹果酸混合物),再由酵母或细菌发酵成L-苹果酸的工艺。
这前一步称为富马酸发酵,后一步称为转换发酵。
(一)富马酸发酵
根霉产生富马酸的能力早就被人们所认识。
著名的根霉富马酸发酵菌种有华根霉、无根霉和黑根霉。
根霉在葡萄糖马铃薯汁琼脂斜面上,于30℃培养7天后,易于长出大量孢子。
对于华根霉6508的富马酸发酵,可以采用下述培养基(%)
:
葡萄糖10(NH4)2SO40.5
K2HPO40.1MgSO4·7H2O0.05
FeCl3·6H2O0.002CaCO35
在500ml三角瓶中装液50ml,另外还要加入各种表面活性剂,具体添加量见后述。
接种华根霉孢子后,先静置培养一段时间,再振荡培养,维持温度30℃。
(二)转换发酵
转换发酵是在根霉发酵一定时间后,再加入第二种微生物使富马酸发酵转换成苹果酸发酵。
有这种转换能力的微生物很多。
佐佐木等普查了分别属于假丝酵母属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、酵母属和球拟酵母属的23株酵母,发现膜璞毕赤酵母的转化率最高。
6/4.3酶法转化工艺
酶法转化工艺相当于两步发酵工艺中的转换发酵。
转换发酵是将第一步发酵生成的富马酸转化成苹果酸;而酶法转化是用富马酸盐(一般是化学合成的)为原料,利用微生物的富马酸酶转化成苹果酸(盐)。
酶法转化是现在国外生产L-苹果酸的主要方法。
如果转化是以钙盐的形式进行的,则称为“转晶”,即富马酸钙晶体转化成苹果酸钙晶体:
Ef
CaFuCa2++Fu2-Ma2++Ca2+CaMa
6/4.4固定化细胞转化工艺
前面已经提到,富马酸向L-苹果酸的转化只牵涉一步酶催化反应,因此只要把富马酸酶提取出来,固定到载体上,就可以利用固相酶反应柱连续生产L-苹果酸。
但实际上遇到的问题是,酶的提纯手续复杂,酶的回收率低,成本高。
(一)产氨短杆菌细胞固定与苹果酸生产
(二)黄色短杆菌细胞固定与苹果酸生产
1.氮源
2.碳源
3.玉米浆
4.通气
5.温度
6.培养时间
6/4.5其他发酵方法
(一)担子菌发酵法
(二)产碱杆菌酶法转化
(三)解脂假丝酵母转化法
(四)解烃富马酸假丝酵母发酵法
(五)假丝酵母酶法转化
(六)栖热菌酶法转化
(七)固定化皱褶假丝酵母转化法
6/5苹果酸的提取和精制
一.苹果酸的提取
发酵液的处理包括前6个步骤,即酸解、过滤、中和、过滤、酸解、过滤。
由于苹果酸发酵中需要添加过量的CaCo3,另外形成放的苹果酸钙盐溶解度也极低,所以成熟的发酵酿成浓浆状。
发酵液——————————
无砷硫酸—
石膏渣、菌体CaCo3+Ca(OH)2
滤液无砷硫酸
——
石膏渣
结晶成品
50%浓缩液
苹果提取工艺流程
二、苹果酸的精制
三、苹果酸结晶工艺流程
苹果酸溶液
富马酸晶体
富马酸晶体
苹果酸结晶工艺流程
6/6苹果酸的检验
6/6.1定性检验
1.三氯化钛法
2.美国药典法
3.纸层析法
6/6.2定量检验
1.酸碱滴定法
2.紫外分光光度法
3.荧光分光光度法
6/7苹果酸的用途
苹果酸广泛存在于各种生物体中,是生物体重要的代谢循环——三羧酸循环的成员之一。
在天然水果(苹果、山楂、葡萄、樱桃)中含量较高,它具有明显的呈味作用,其酸味柔和别致,解渴爽口。
苹果酸广泛用于食品和医药工业中,它的质地稳定,在水中溶解度大。
它在食品等部门中的用途简介如下:
1.食品酸味剂
2.食品加工
3.食品添加剂加工
4.烟草加工
5.医药
6.日用化工
7.化学工业
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