牛巴贝斯虫病诊断技术编制说明.docx
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牛巴贝斯虫病诊断技术编制说明
《牛巴贝斯虫病诊断技术》编制说明
一、工作简况
(一)任务来源
牛巴贝斯虫病(Bovinebabesiosis)是由巴贝斯虫科、巴贝斯虫属的原虫寄生于牛红细胞内引起的一种血液原虫病。
我国牛巴贝斯虫病最为主要、致病性最强的病原为牛巴贝斯虫(Babesiabovis)和双芽巴贝斯虫(Babesiabigemina),这两种病原在我国的传播媒介为微小扇头蜱(Rhipicephalismicroplus),微小扇头蜱在我国23个省份广泛分布,导致该病在我国分布范围十分广泛。
该病的主要特征为发热、贫血、血红蛋白尿、共济失调、厌食、消瘦等临床症状,犊牛及引进牛、纯种牛和改良牛感染后容易发病,甚至引起死亡,对我国养牛业造成巨大经济损失。
因此,制定简单快速、敏感度高、特异性号的标准化检测技术,对有效预防该病、降低经济损失将会起到十分重要的作用。
根据《国家标准化管理委员会关于下达第二批推荐性国家标准计划的通知》(国标委发[2019]22号)和全国动物卫生标准化技术委员会下达的《关于公布第二批动物卫生国家标准立项项目的通知》(动卫标[2019]8号),中国农业科学院兰州兽医研究所承担推荐性国家标准《牛巴贝斯虫病诊断技术》的制定工作,项目编号20192296-T-326。
(二)起草单位
本项目的起草单位为中国农业科学院兰州兽医研究所。
本项目的主要起草人为殷宏、关贵全、刘爱红、刘军龙和罗建勋。
其中殷宏为项目负责人,负责标准起草的总体工作、任务分工及联系标准意见征求和技术复核专家与单位;关贵全负责标准起草、征求意见汇总处理、技术标准化、征求意见后的修改等工作;刘爱红负责实验材料准备,并参与技术标准化、标准初稿起草;刘军龙参与技术标准化、标准初稿修订;罗建勋参与标准初稿修改、征求意见后的修改。
(三)主要工作过程
1.起草阶段
根据项目书的要求,我们对现有的文献和标准技术库的相关材料进行了梳理,明确了牛巴贝斯虫病现有的诊断技术及其应用情况。
结合本实验室前期的研究工作,确定了标准的编制工作方案。
本标准设计的检测技术包括血涂片显微镜检测、用于区分鉴定牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫聚合酶链式反应(PCR)和区分牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫感染的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)。
因血涂片显微镜检测方法采用的是OIE手册中的方法,故本标准中只对PCR和ELISA方法开展验证和标准化,并拟将在完成征求意见后进行技术复核。
上述工作完成后,标准起草工作组开始本标准的起草工作,于2019年8月完成了标准的初稿。
然后,所有起草人对初稿进行修改。
2.征求意见阶段
在完成“1”的基础上按照GB/1.1-2009的要求,完成该项标准“征求意见稿”的编制。
拟将在2019年8月,送中国农业大学、上海兽医研究所、浙江大学、南京农业大学、吉林大学、东北农业大学、黑龙江八一农垦大学、哈尔滨兽医研究所、华中农业大学、河南农业大学、广西大学大学、西北农林科技大学、四川农业大学、中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所、深圳出入境检验检疫局等单位的15位长期从事寄生虫研究工作的国内著名专家征求意见。
并根据专家的意见,完成标准修改,计划该项工作将于9月底完成。
3.技术复核
按照要求,将于2019年9月,将本标准中涉及的“区分鉴定牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫聚合酶链式反应(PCR)”和“区分牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫感染的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)”在国内长期从事动物梨形虫病研究工作的华中农业大学、上海兽医研究所、南京农业大学等三家单位进行技术复核,计划将于9月底完成对这两种分法的验证工作。
4.审查阶段
根据“1”和“2”的意见和结果,对征求意见稿进行修改,形成标准送审稿,报全国动物卫生标准化技术委员会组织专家进行审定,然后根据审查意见,对标准进行修改,修成报批稿上报。
目前完成1和征求意见稿,正在进行意见征集;技术复核、审查和报批的工作尚未开展。
二、标准编制原则和确定标准主要内容的依据
(一)标准的编写原则
本标准按照GB/T1.1-2009编写初稿和征求意见稿。
标准编制过程中遵循的基本原则为:
保证标准的适用性;保持标准的先进性;注意标准的统一性和规范性;注意标准的经济效益和社会效益。
(二)提出本标准的依据
牛巴贝斯虫病在我国广泛流行于微小扇头蜱分布的23个省份,在我国某些地区,感染率可高达47%。
本病对牛危害严重,尤其是对犊牛和引进牛、纯种牛及改良牛。
然而对于本病的诊断技术,我国现阶段暂无标准化的方法。
使用最多的是《OIETerrestrialManual》中提及的血涂片显微镜镜检。
该方法虽然操作简单,且在急性发病情况下具有很好的检测效果。
但对持续期感染的动物,检出率较低,容易漏检,而且难于区分不同的巴贝斯虫种。
为配合《国家中长期动物疫病防治规划》及为我国牛巴贝斯虫病的防治工作提供标准化技术,本项目参考《OIETerrestrialManual》2014年版中牛巴贝斯虫病诊断方法,并结合我国国情,以操作性好、易标准化为主要准则,确定其中操作简单的血涂片显微镜镜检,具有高的敏感性和特异性、且可鉴别巴贝斯虫种的PCR方法,及在持续感染其具有较高敏感性、并易于标准化的ELISA方法为本标准中的诊断方法。
从而结合各种方法的有点,为本病的准确诊断,提供标准化的方法。
标准中血涂片显微镜镜检技术采用OIE的方法,PCR方法源于刘军龙、关贵全、刘爱红等人于2014年发表于《ActaParasitologica》上的APCRmethodtargetinginternaltranscribedspacers:
thesimultaneousdetectionofBabesiabigeminaandBabesiabovisincattle(ActaParasitol.2014Mar;59
(1):
132-138)的方法;ELISA方法采用以目前世界上牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫检测评价良好的重组RAP-1单位为抗原建立的间接ELISA方法,同时在国家重点研发计划项目的支持下,现已组装出诊断试剂盒的间接ELISA方法。
应用该间接ELISA,已对我国17省份的2364份样品进行了评价,具有很好的特异性、敏感性和稳定性(YangCetal.LiuJ,LiA,LiY,LiuA,XieJ,LiuG,YinH,GuanG,LuoJ.EvaluatingtheBabesiabovisinfectionofcattleinChinawithenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA).ActaParasitol.2015Dec;60(4):
721-726.)。
(三)制定本标准的基础
中国农业科学院兰州兽医研究所起草小组是国内专门从事动物梨形虫病研究的实验室,自从上世纪八十年代以来一直从事牛羊梨形虫病的生物学、诊断、药物治疗和免疫预防的研究。
在承担的国家“七五”、“八五”攻关专题项目、国家重点研发计划、国家“973”项目、国家“863”项目、国家支撑计划项目、农业部重点项目、国家自然基金、国际科学基金资助项目、甘肃省重点计划项目和欧盟INCO-DEV项目的研究工作中,积累了丰富的动物梨形虫病的研究经验。
利用多种基因为靶标对牛梨形虫病病原进行了分类分析,厘定了我国动物梨形虫的分类,同时建立了能够鉴别检测各种巴贝斯虫和泰勒虫的PCR、定量PCR、多重PCR、反向线性印记(RLB)、环介导恒温扩增(LAMP)等分子检测方法和血清学的IFA和ELISA方法。
所在实验室为我国兽医微生物保藏中心原虫分中心,保藏30多个动物梨形虫活虫种和100多个地方分离株,其中包括牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫的多个单一虫种,拥有牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫繁殖系统和其传播媒介微小扇头蜱活蜱及培养系统为本项目的顺利执行提供了基本的材料保障。
本项目起草小组在牛巴贝斯虫研究方面具有坚实的研究基础,依托国家重点实验室,具有良好的实验设备,具备制定本标准的技术水平与实力。
(四)实验内容
1.鉴别检测牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫的PCR方法
(1).引物设计
根据牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫转录间隔区(ITS)基因序列,设计了针对两种巴贝斯虫的特异性引物,扩增目的基因片段长度分别为408bp和646bp。
(2).PCR反应条件优化
通过实验摸索,确定了PCR反应过程中的最佳引物浓度配比和反应程序。
反应体系为25μL,引物的使用量为1μmol,待检样品核酸为2μL。
反应条件为:
95℃预变性5min;然后92℃变性1min,56℃退火1min,72℃延伸1min,共扩增35个循环;72℃延伸10min。
2.鉴别检测牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫感染的ELISA方法
(1)抗原
用大肠杆菌表达系统,分别表达牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫RAP-1基因3’端的825bp和435bp的片段,纯化后作为该方法的抗原。
(2)间接ELISA方法条件的优化
通过对方法和组装试剂盒检测条件优化,确定了抗原浓度、封闭液种类、待检血清稀释度及所有的反应时间。
优化后的条件为:
牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫RAP-1C端重组抗原分别为每孔0.2μg和0.1μg,包被条件和时间为4℃冰箱15h,包被液使用pH9.6,0.05M碳酸盐缓冲液;封闭液使用5%的脱脂奶粉,每孔200μL,封闭条件37℃孵育,时间是双芽巴贝斯虫的1h,牛巴贝斯虫的1.5h;血清稀释液为pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS),稀释度为1:
20,加样量为每孔100μL,反应条件为37℃孵育1h;二抗稀释液为pH7.4的PBS,稀释度个公司产品不尽相同,Sigma公司的为牛巴贝斯虫的7500倍稀释,双芽巴贝斯虫的10000倍稀释,反应条件为37℃孵育1h。
底物使用TMB,37℃避光作用10min。
终止液使用2MH2SO4。
结果判定阈值采用计算S/P值(S/P=(样品OD450平均值—标准阴性对照OD450平均值)/(标准阳性对照OD450平均值—标准阴性对照OD450平均值))的方法,牛巴贝斯虫的S/P值大于等于0.28时判定为抗体阳性,双芽巴贝斯虫的大于0.32时判定为抗体阳性。
(五)实际应用效果
应用本项目的PCR检测方法和血涂片显微镜镜检方法对采自我国6个省份(吉林、甘肃、河北、河南、广西)的260份血液样品进行检测。
结果显示,PCR检测方法中,牛巴贝斯虫阳性率为5.8%(15/260),双芽巴贝斯虫阳性率为7.3%(19/260),混合感染率为1.2%(3/260);血涂片显微镜镜检方法中,牛巴贝斯虫阳性率为1.5%(4/260),双芽巴贝斯虫性率为2.3%(6/2630),没有检测到混合感染。
说明该PCR方法的敏感性比血涂片显微镜镜检方法,具有作为本病诊断的实际应用价值。
应用本项目的特异性检测牛巴贝斯虫感染的间接ELISA方法,对采自我国17个省45个地区的2364份牛血清进行检测,结果显示个省份牛巴贝斯虫抗体阳性率在6.4%-47.3%之间,这些省份的平均阳性率为24.9%;用特异性检测双芽巴贝斯虫感染的间接ELISA方法,对对采自我国6各省份的516份牛血清进行了检测,结果显示个省份双芽巴贝斯虫抗体阳性率在9.6%-30.5%之间,平均阳性率为18.4%。
这些结果表明,该方法可作为牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫感染的检测方法在实际诊断检测中使用。
三、主要试验或验证的分析、综述报告,技术经济论证,预期的经济效果
(一)主要试验或验证的分析
1.鉴别检测牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫的PCR方法
(1).引物设计
以牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫转录间隔区(ITS)为目的片段,设计PCR扩增引物,通过筛选最终选取反应性好、特异性高的引物序列。
牛巴贝斯虫引物:
上游引物为BoF:
5’-CTTGCGGCGATTTGGC-3’,下游引物为BoR:
5’-CGTGAAGGAGCGGTGTAGAG-3’;扩增产物大小为408bp。
双芽巴贝斯虫引物:
上游引物为BbF:
5’-GCGTTGTCGTCGCTCTTG-3’,下游引物为BbR:
5’-CTTAAATTCGGCGGATGG-3’;扩增产物大小为646bp。
(2).PCR方法特异性测试
图1.PCR方法特异性评价电泳图
A:
双芽巴贝斯虫引物扩增产物。
M,DL2000TM标准分子量(TakaRa);1,双芽巴贝斯虫;2,牛巴贝斯虫;3,卵形巴贝斯虫;4,大巴贝斯虫;5,巴贝斯虫未定种喀什株;6,环形泰勒虫;7,瑟氏泰勒虫;8,中华泰勒虫;9,阴性牛DNA。
B:
牛巴贝斯虫引物扩增产物。
M,DL2000TM标准分子量(TakaRa);1,牛巴贝斯虫;2,双芽巴贝斯虫;3,卵形巴贝斯虫;4,大巴贝斯虫;5,巴贝斯虫未定种喀什株;6,环形泰勒虫;7,瑟氏泰勒虫;8,中华泰勒虫;9,阴性牛DNA。
从上述电泳图中可以看出,两种巴贝斯虫的引物都能扩增出合适大小的片段,通过测序确定该扩增的片段为对应巴贝斯虫种的ITS基因的目的片段,且其他虫种及对照组中无扩增条带,说明两对引物的特异性都很好。
(3).PCR反应条件优化
通过条件优化,确定了PCR反应过程中的最佳引物浓度配比和反应程序。
反应体系为25μL,引物的使用量为1μmol,待检样品核酸为2μL。
反应条件为:
95℃预变性5min;然后92℃变性1min,56℃退火1min,72℃延伸1min,共扩增35个循环;72℃延伸10min。
(4).PCR方法敏感性
以牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫阳性基因组DNA(初始浓度均为10ng/μL)进行10倍比稀释,稀释至10-8ng/μL,进行PCR敏感性测试。
图2.PCR方法敏感性评价电泳图。
M,DL2000TM标准分子量(TakaRa);泳道1-10:
10倍比稀释的双芽巴贝斯虫(图A)和牛巴贝斯虫(图B)DNA,DNA浓度依次为10ng/μl至10-8ng/μl。
结果显示:
当阳性DNA稀释至10-8ng/μl时,两对引物仍能扩增获得目的条带,表明该方法具有很好的敏感性。
2.鉴别检测牛巴贝斯虫感染的ELISA方法
(1)鉴别检测牛巴贝斯虫感染的间接ELISA方法特异性评价
使用感染牛的4种巴贝斯虫、3种泰勒虫、1种无浆体阳性牛血清和梨形虫、无浆体阴性牛血清,对该方法的特异性进行评价。
图3.鉴别检测牛巴贝斯虫感染的间接ELISA特异性评价
1:
牛巴贝斯虫阳性血清;2:
双芽巴贝斯虫阳性血清;3:
大巴贝斯虫阳性血清;4:
巴贝斯虫未定种喀什株阳性血清;5:
环形泰勒虫阳性血清;6:
瑟氏泰勒虫阳性血清;7:
中华泰勒虫阳性血清;8:
边缘无浆体阳性血清;9:
阴性牛血清对照。
AbR%=S/P%。
结果显示,该重组蛋白在ELISA中只与牛巴贝斯虫阳性血清有反应,与其他血清无反应,表明该方法具有很好的特异性。
(2)鉴别检测牛巴贝斯虫感染的间接ELISA方法检测能力的评价
应用本项目的特异性检测牛巴贝斯虫感染的间接ELISA方法,对实验感染牛巴贝斯虫的2头牛(血涂片显微镜镜检时在感染后第6天和第8天可检查到虫体)的血清进行了检测。
图4.牛巴贝斯虫感染牛后抗体动态曲线
结果显示,在感染后第6天出现抗牛巴贝斯虫抗体,第12天达到最高水平,50天后,抗体水平仍为阳性。
到第270天检测结果仍为阳性(数据未附),表明该方法能够进行牛巴贝斯虫早期和持续期感染的检测。
3.鉴别检测双芽巴贝斯虫感染的ELISA方法
(1)鉴别检测双芽巴贝斯虫感染的间接ELISA方法特异性评价
使用感染牛的3种巴贝斯虫、3种泰勒虫和梨形虫阴性牛血清,对该方法的特异性进行评价。
图5.鉴别检测双芽巴贝斯虫感染的间接ELISA特异性评价
结果显示,该重组蛋白在ELISA中只与双芽巴贝斯虫阳性血清有反应,与其他血清无反应,表明该方法具有很好的特异性。
(2)鉴别检测双芽巴贝斯虫感染的间接ELISA方法检测能力的评价
应用本项目的特异性检测双芽巴贝斯虫感染的间接ELISA方法,对实验感染双芽巴贝斯虫的2头牛(血涂片显微镜镜检时在感染后第11天和第14天可检查到虫体)的血清进行了检测。
图6.双芽巴贝斯虫感染牛后抗体动态曲线
结果显示,在感染后第7-8天出现抗双芽巴贝斯虫抗体,第24天达到最高水平,高水平抗体一直持续到160天,266天后尚未回归到感染前水平。
表明该方法能够进行双芽巴贝斯虫早期和持续期感染的检测。
(二)预期的经济效果
建立的鉴别检测牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫的PCR检测方法,具有高敏感性、强特异性、快速、准确,与其他梨形虫没有交叉反应,敏感性较血涂片显微镜镜检高,适用于急性感染期病原核酸检测;区分牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫感染间接ELISA方法特异、敏感、易于标准化,适用于感染早期和持续期抗体检测。
本标准可应用于牛巴贝斯虫病的临床诊断、检验检疫、流行病学调查和疾病控制等,对制定防控本病的有效措施具有重要意义。
本标准的使用推广,将为我国养牛业在防控牛巴贝斯虫病方面提供有效的检测方法,降低本病导致的经济损失,提高养牛业的经济效益。
四、采用国际标准和国外先进标准的程度
国内尚无针对牛巴贝斯虫病的诊断标准,《OIETerrestrialManual2014》规定的牛巴贝斯虫病的诊断方法有血涂片显微镜检、体外培养和易感动物接种的病原检测方法,分子检测方法有针对18SrRNA、RAP-1和gp45基因的PCR方法,抗体检测方法有虫体抗原ELISA方法、间接荧光抗体检测(IFA)方法、补体结合试验(CF)方法等,其中较为易于标准化的方法主要有血涂片显微镜镜检、PCR和ELISA方法。
其中的PCR方法由于使用18SrRNA、、RAP-1和gp45基因,实际操作中易于出现交叉反应或难于覆盖不同地方分离株;ELISA方法是用虫体抗原,难于标准化,而且交叉反应较强。
因此本标准中采用操作简便、且易于标准化的血涂片显微镜检方法,同时以不同虫株间变异较小,且种间差异较大的ITS基因为靶基因,现已经过多年评价的区分两种病原的PCR方法,极大的改善了PCR方法的特异性、敏感性和稳定性;同时使用重组的RAP-1蛋白差异性较大的C端,建立的间接ELISA方法,该方法通过多年的评价和验证,具有良好的特异性、敏感性、稳定性。
且对PCR和ELISA方法进行了标准化,易于操作,在国内外具有较好的先进性。
五、与现行的法律、法规和强制性国家标准的关系
《牛泰勒虫病诊断技术》的制定遵循GB/T1.1-2009、《中华人民共和国动物防疫法》、《GB/T18088-2000》、《病原微生物实验室生物安全管理条例》、《动物检疫管理办法》、《农业部国家(行业)标准的计划编制、制定和审查管理办法》等相关法律、法规规定,是编写本标准的主要法律依据。
六、重大分歧意见的处理经过和依据
无。
七、标准性质(强制性、推荐性)的建议,特别是对建议批为强制性标准的理由应充分说明
建议将本标准批为推荐性国家标准。
八、贯彻标准的要求和建议措施(组织实施、技术措施、过渡办法等)
标准发布后,为有效贯彻实施,建议农业部相关部门确定培训对象,委托标准起草单位举办全国技术培训班,对有关技术人员进行相关技术强化操作培训,培训效果要达到:
懂原理、操作熟练、判定准确,回单位能够独立工作。
九、废止现行有关标准的建议
无。
十、其他应予说明的事项。
无。
- 配套讲稿:
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