高效代谢木糖产乙醇的酵母菌株的选育.docx
- 文档编号:23573186
- 上传时间:2023-05-18
- 格式:DOCX
- 页数:8
- 大小:20.88KB
高效代谢木糖产乙醇的酵母菌株的选育.docx
《高效代谢木糖产乙醇的酵母菌株的选育.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《高效代谢木糖产乙醇的酵母菌株的选育.docx(8页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
高效代谢木糖产乙醇的酵母菌株的选育
高效代谢木糖产乙醇的酵母菌株的选育
摘要
木糖发酵是生物转化木质纤维素产生酒精及其他化工产品最为重要的一环,但自然界中缺少能将上述生物质有效转化为乙醇的微生物菌种。
为提高季也蒙毕赤酵母和休哈塔假丝酵母代谢木糖生产乙醇能力,采用原生质体融合以及化学及物理诱变方法进行育种,得到五个乙醇产量较高的菌株XX2,X1,X4,X12和X13。
说明原生质体融合和诱变育种是筛选高效菌种的有效途径。
关键词:
木糖乙醇原生质体融合诱变育种
ABSTRACT
Efficientfermentationofxyloseconstitutesamajorpartofsuccessfulbioconversionoflignocellulosicbiomassforethanolandotherimportantchemicalproduction,butthereisnonaturalmicroorganismsuitableforefficientlytransformingtherenewablelignocellulosicmaterials.ToimprovetheEthanolFermentationofXyloseofPichiaguillermondiiandCandidashehatea,weusestheProtoplastFusionandMutagenisistobreedfivebetterstrainsXX2,X1,X4,X12andX13.AndthisshewthatProtoplastFusionandMutagenisisweregoodforfungusbreeding.
Keywords:
xyloseethanolprotoplastfusionmutagenisisbreeding
目录
一前言6
二本论7
2.1材料7
2.1.1菌种7
2.1.2培养基7
2.1.3试剂[5]7
2.2方法[15]8
2.2.1菌种活化8
2.2.2原生质体的制备[6]8
2.2.3原生质体的形成率与再生率测定8
2.2.4PEG融合技术9
2.2.5电击融合9
2.2.6诱变处理方法[8]9
2.2.7诱变致死率的测定10
2.3结果与讨论10
2.3.1原生质体[14]的形成率与再生率10
2.3.2融合子复筛后乙醇发酵能力10
2.3.3紫外诱变时间的选择10
2.3.4诱变菌株的发酵筛选11
三结论12
一前言
发展可再生清洁能源、保护生态环境已成为人类必须面对的两大课题,燃料酒精被公认为最有发展前景的可再生清洁能源之一。
汽油中添加10%~15%酒精的复合燃料汽油醇(Gasohol),是良好的无铅汽油,在一些欧美国家已经开始使用这种燃料。
2001年4月国家计委决定十五期间将在大中城市逐步推广使用车用乙醇汽油(汽油醇),这一政策的出台必将给燃料酒精的发展带来极大的商机。
目前,国内外均以淀粉质和糖蜜为原料生产酒精,底物成本在生产总成本中占有很大的比例,在欧美发达国家为40%左右[1],而在中国这一数值高达60%~70%。
因此开发用于燃料酒精生产的廉价原材料是这一能源领域研究的主要方向之一。
地球上最丰富的可再生资源木质纤维素,是光合作用产物,充分将其中可利用成分转化为燃料酒精,不仅可以提供清洁能源,而且有利于推动太阳光能的转化利用,同时促进大气中CO2的循环[2],减少由矿物燃料燃烧造成的CO2净排放。
木糖是半纤维素的主要组成部分,在植物纤维材料水解液中占30%左右,是继葡萄糖之后自然界中最丰富的糖分[3],以木糖[4]为底物转化酒精的研究,是酒精途径工程研究的热点之一。
二本论
2.1材料
2.1.1菌种
季也蒙毕赤酵母(Pichiaguillermondii,以下简称G)和休哈塔假丝酵母(Candidashehatea,以下简称X)。
2.1.2培养基
普通YPD:
蛋白胨20g,葡萄糖20g,酵母膏10g,蒸馏水定容至1L;固体YPD再加20g琼脂。
115℃灭菌30min。
再生培养基:
在普通YPD中添加17%的蔗糖。
115℃灭菌30min。
复筛培养基:
蛋白胨20g,木糖200g,酵母膏10g,琼脂20g,蒸馏水定容至1L,115℃灭菌30min。
木糖YPD:
用木糖替换普通YPD中的葡萄糖。
诱变固体培养基:
普通固体YPD培养基中加0.2%的LiCl。
亚硝酸钠和盐酸制取,将亚硝酸钠配成0.01-0.1mol/L的浓度,使用时加入等浓度等体积的盐酸即可。
2.1.3试剂[5]
磷酸缓冲液:
0.2MNaH2PO492mL和0.2MNa2HPO48mL,pH=5.8。
高渗缓冲液:
100mL磷酸缓冲液中加17g蔗糖。
蜗牛酶(Snaillase):
购买于北京欣经科生物技术有限公司。
用高渗缓冲液配制为1.5%(用0.22μm滤膜过滤除菌)。
预处理剂:
100mL磷酸缓冲液中加0.1gEDTA和0.1mLβ-巯基乙醇。
融合剂:
PEG(MW=6000)35%-10mMCaCl2-17%蔗糖(用0.22μm滤膜过滤除菌)。
0.2M的EMS:
用pH=7.2的磷酸缓冲液配制,0.22μm滤膜过滤除菌。
2%的NaS2O3:
0.22μm滤膜过滤除菌。
0.1M的EMS:
用pH=7.2的磷酸缓冲液配制,0.22μm滤膜过滤除菌。
木糖。
2.2方法[15]
2.2.1菌种活化
将两种酵母接种在YPD斜面上,30℃恒温培养1d,重复两次。
将活化的酵母菌斑用牙签挑取适量接种于液体YPD培养基中,30℃200r/min摇床震荡培养12~16h,此时可达到对数生长期。
2.2.2原生质体的制备[6]
取上述活化的处于对数生长期中期的菌液(浓度约为2×107个/mL)3mL,3500r/min离心5min得菌体。
磷酸缓冲液洗2次,加3mL预处理剂,28℃培养10min。
3500r/min离心5min,弃上清,磷酸缓冲液洗2次,加2mL1.5%蜗牛酶液,30℃处理30~45min。
高渗缓冲液洗2次并悬浮。
2.2.3原生质体的形成率与再生率测定
用平板菌落法测定[7]。
原生质体形成率=(A-B)/A×100%,原生质体再生率=(C-B)/(A-B)×100%。
其中,A为酶解前每mL菌液在普通平板上长出的菌落数,B为酶解后每mL菌液在普通平板上长出的菌落数,C为酶解后每mL菌液在高渗再生平板上长出的菌落数。
2.2.4PEG融合技术
融合处理:
将X和G两种原生质体进行种内和种间融合,即XX融合,GG融合,XG融合。
融合步骤:
取两种原生质体按等量混合(各取0.5mL),离心,用0.4MCaCl2洗涤,离心。
加入2mL35%PEG(MW=6000)-CaCl2(10mM),30℃下震荡融合30min。
用高渗缓冲液洗2次,适当稀释。
涂于再生培养基,30℃培养2~4d。
继代培养融合子以检测稳定性。
2.2.5电击融合
融合处理:
同PEG融合。
融合步骤:
两种原生质体按等量混合(各取0.5mL),离心,用0.4MCaCl2洗涤,离心。
用Bio-Red生产的电击仪进行电击,条件为5kV/cm,25F和200Ω,电击时间40ms。
涂于高渗筛选固体培养基,30℃培养2~4d。
继代培养融合子以检测稳定性。
2.2.6诱变处理方法[8]
取适量1.2.1活化的菌液分别用以下三种方法进行诱变:
(1)EMS与LiCl复合诱变:
1mL0.2MEMS缓冲液加1mL菌液于试管中加塞密闭,30℃暗处震荡5h,加2mL2%NaS2O3终止反应,适当稀释诱变液并涂布在诱变固体培养基。
(2)紫外照射与LiCl复合诱变:
5mL菌液于直径9cm的平皿中,20W紫外30cm处分别照射一段时间。
同时不断搅拌,稀释涂布诱变固体培养基(红光下操作)。
(3)紫外、EMS及LiCl复合诱变:
2.5mL0.1MEMS缓冲液加2.5mL菌液混合于试管中,加塞密闭30℃暗处震荡5h,转入直径9cm的平皿中,20W紫外30cm处照射一段时间,同时不断搅拌,稀释涂布诱变固体培养基(红光下操作)。
2.2.7诱变致死率的测定
(1)紫外单独照射菌液:
分别在2、4、6、8和10min后稀释涂布平板,同时用未经紫外照射的菌液作对照,30℃恒温培养,3d后平板计数,取平均值,计算致死率。
(2)将EMS处理5h的菌液紫外照射:
分别在2、4、6、8和10min后稀释涂布平板,同时用未经紫外照射的菌液作对照,30℃恒温培养,3d后平板计数,取平均值,计算致死率。
诱变致死率计算公式:
致死率=(对照组菌落数-诱变组菌落数)/对照组菌落数×100%。
2.3结果与讨论
2.3.1原生质体[14]的形成率与再生率
根据X和G的原生质体形成率与再生率,来确定在制备原生质体的过程中,所选择的试验条件是否有效。
2.3.2融合子复筛后乙醇发酵能力
X和G融合后,不断提高培养基中木糖浓度经过多次继代培养,挑选出生长较好的菌株至30%木糖YPD平板,生长5d后出现几个生物量较对照显著增加的菌斑。
挑较大菌落发酵,发酵液组分为(20%木糖+2%蛋白胨+1%酵母提取物),3mL体系,发酵后3d取样,液相色谱检测发酵液中乙醇含量,筛选出生产乙醇能力较高的菌株进一步发酵,检测乙醇含量,这样每批发酵都将乙醇产量不稳定的以及产量低的剔除,不断缩小范围,最终筛选出生产乙醇高效的菌株。
可能是融合菌株里面的一种。
2.3.3紫外诱变时间的选择
高致死率容易产生突变株,但负突变较多;低致死率不易产生突变,但正突变比例较高。
选择合适的诱变剂量。
2.3.4诱变菌株的发酵筛选
液相色谱检测发酵液中乙醇含量,筛选出生产乙醇能力较高的菌株进一步发酵,这样每批发酵实验都将乙醇产量不稳定的以及产量低的剔除,不断缩小范围,最终筛选出生产乙醇高效的菌株。
三结论
燃料乙醇是一种清洁便捷的可再生能源[12],被纳入许多国家的发展战略规划[9]。
木糖的乙醇发酵一直被人们视为植物纤维原料生物转化生产乙醇的关键因素。
研究表明,适宜的木糖发酵[13]产率和乙醇浓度可以降低工艺总成本的25%[10],因此提高木糖的乙醇发酵产率是该技术商业化生产的必要条件[9,10]酵母木糖发酵酒精途径工程研究进行了20多年。
尽管某些方面还需要改进,但是,从生物质原料生产燃料,高效转化木质纤维素水解物中的糖类,因其良好的应用前景,从未减慢过它发展的步伐。
随着酿酒酵母全序列的得到以及DNA重组技术的飞速发展,途径工程变得更加理性化,通过选择合适的受体菌株、进一步加强分子水平的代谢工程菌株改造以及后期同步发酵技术的改进,我们相信,不久的将来,必将有实用的木糖代谢[11]工程酿酒酵母用于燃料酒精的生产。
参考文献:
[1]ZaldivarJ,NielsenJ,OslssonL.Fuelethanolproductionfromlignocelluloses:
achallengeformetabolicengineeringandprocessintegration.ApplMicrobiolBiotechnol,2001,56:
17-34.
[2]ZHANGHZ(张惠展).MetabolicEngineering1ed,ChinaLightIndustryPress,2002.
[3]RodneyJB,NancyN,BruceSD.Fermentationswithnewrecombinantorganisms.BiotechnolProg,1999,15,867-875.
[4]刘巍峰,张晓梅,陈冠军等.木糖发酵酒精代谢工程的研究进展[J].过程工程学报,[J].2006,6
(1):
138-143.
[5] 蔡车国,刘月英.用原生质体融合法优化啤酒酵母的凝絮性和发酵性能[J].厦门大学学报,2006,45
(1):
110-113.
[6]李华,何忠宝.原生质体融合构建葡萄酒降酸酵母的研究[J].微生物学杂志,2006,26
(2):
5-8.
[7]郝林.食品微生物学实验技术[M].北京:
中国农业出版社,2001:
76-83.
[8]杜娟,曲音波,林觐勤,等.灰绿曲霉高产纤维素酶突变株的选育[J].厦门大学学报(自然科学版),2006,45(增刊):
23-26.
[9]ZaldivarJ,NielsenJ,OlssonL.Fuelethanolproductionfromlignocellulose:
achallengeformetabolicengineeringandprocessintegration[J].ApplMicrobiolBiotechnol,2001,56:
17-34.
[10]JeffriesTW,KurtmanCP.Strainselectiontaxonomyandgeneticsofxylose2fermentationyeasts[J].EnzymeMicrobTechnol,1994,16:
922-932.
[11]田沈,徐鑫,孟繁燕等.木质纤维素乙醇发酵研究进展[J].农业工程学报,2006,(S1).
[12]邓雪柯,廖翀,李晋川等.可再生资源中木糖利用的研究概况[J].技术与市场,2006,(08).
[13]王铮,陈红英,沈才洪等.热带假丝酵母利用酒糟水解液发酵生产木糖醇的初步研究[J].中国酿造,2006,(03).
[14]魏运平,叶俊华,赵光鳌.原生质体融合技术及其在酿酒酵母菌株选育中的应用[J].2003
(1):
87-8.
[15]涂振东,叶凯,韩丽丽等.高效代谢木糖产乙醇酵母菌株的选育[J].新疆农业科学 2008,45(5):
945-949.
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 高效 代谢 木糖产 乙醇 酵母 菌株 选育