植物拟南芥水稻原位杂交详细protocol试验方法.docx
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植物拟南芥水稻原位杂交详细protocol试验方法
植物材料的固定、包埋和制片
一、植物材料的固定和包埋
在此过程应注意防止Rnase的污染。
所使用的熔蜡管〔管盖不能耐受180℃烘,只需高压湿热灭菌即可〕、量筒、三角瓶和药勺均需180℃烘5小时以上。
所用蒸馏水无需用DEPC处理。
所固定的材料越小越好,尽可能切除多余的材料。
材料取下后应立即固定。
取材后假设不能立即固定,则应置于冰上运输。
配试剂前请计算一下所需用量,用多少配多少,节约试剂。
第一天
一、配制甲醛溶液〔以300ml量为例〕
1、先打开一个60℃左右的水浴锅。
2、在通风橱中往三角瓶中加入12g多聚甲醛(终浓度为4%)。
3、用量筒配300mlPBS缓冲液〔30ml10×PBS+270ml水〕,另加1粒NaOH,盖好锡箔纸后,轻轻摇动,稍微溶化后置于水浴锅中溶解。
4、完全溶解后,取出,加0.1%Tween-20(300ul)和0.1%Triton(300ul)混匀〔包埋水稻时还要再加3ml25%的戊二醛〕。
5、置于冰上或4℃冰箱降至室温,然后用硫酸调pH至。
6、把配制好的甲醛溶液分装到小瓶中,〔一般用10ml的小瓶〕。
7、分装好的甲醛溶液应放置在冰浴中当天使用。
二、固定材料
1、取植物新鲜材料,去除不需要的部分至适当大小。
注意:
所固定的材料越小越好,尽可能去除无用多余的部分。
2、把取好材料放入冰浴的装有甲醛溶液的小瓶中。
注意每瓶中的切块数:
太多固定不好;太少则浪费固定液〔固定液:
材料≥20:
1〕。
3、材料放入固定液后,应通过抽真空〔1至数分钟,视具体情况而定:
尽可能短时间,以材料沉入固定液中为准〕,帮助固定液进入组织中,以到达迅速固定植物材料的目的。
抽气减压时,尽量不要使液体过分沸腾。
抽真空时,材料一般在固定液中浮起;抽完真空的材料应该沉入固定液中,有时可能要反复多次抽真空,直至材料沉没在固定液中。
一般抽真空多于5分钟大部份材料还不沉没在固定液中的情况极少见,如果此情况发生,建议抽真空达10分钟后,继续做步骤4。
4、抽真空后需要更换一次新鲜的固定液。
5、更换新鲜固定液后,材料在4℃过夜。
注意:
甲醛有剧毒,因此药品的称取和溶液的配置必须在通风橱中进行!
多聚甲醛极易飞散;称取时通风橱可暂不抽风;要防止将多聚甲醛洒落在天平或台面上造成污染,如有洒落,要及时清理。
第二天按以下序列对材料进行脱水〔水为高压灭过菌的双蒸水〕。
1、0.85%NaCl冰浴,30分钟
2、50%乙醇/0.85%NaCl冰浴,5小时
3、70%乙醇/0.85%NaCl冰浴,5小时
4、85%乙醇/0.85%NaCl4℃,过夜
注:
进入50%乙醇后,材料应开始脱色。
第三天
1、95%乙醇/水4℃,5小时
2、100%乙醇4℃,5小时
3、100%乙醇4℃,过夜
注:
第三天起,每个脱水步骤时间可延长至一天。
两次100%乙醇脱水后,材料应为无色。
第四天
1、100%乙醇室温,2小时
2、50%乙醇/50%二甲苯室温,1小时
3、100%二甲苯室温,1小时
4、100%二甲苯室温,1小时
5、100%二甲苯室温,1小时
6、50%二甲苯/50%石蜡58℃,过夜〔使用熔蜡台〕
注:
使用二甲苯后,应在通风橱中操作,要防止让在同一实验室工作的人闻到二甲苯的味道。
第五至七天
每天换两次100%石蜡〔58℃〕,倾倒时防止产生气泡。
注意:
在换石蜡前1-2小时,把石蜡装于干净熔蜡管内,置于熔蜡台上熔化备用。
第八天
纸盒的处理:
将折好的纸盒于氯仿〔废氯仿可回收重复利用〕中泡一会,再取出晾干。
包埋蜡块:
先准备一盆水放在旁边备用,再将大小合适的纸盒放在熔蜡台上〔在纸盒上写明材料的名称等有关内容〕,将新熔化的石蜡倾倒于此盒内,把材料放到此盒内。
用加热的镊子迅速把材料按需要的切面及材料之间的间隔排列整齐。
用嘴吹气,使石蜡外表凝固形成一层薄膜时,再平放入冷水中,使其尽快凝固,数秒后翻转蜡块。
约半小时后取出,置于有吸水纸的塑料框里晾干。
包埋好的蜡块放入4℃冰箱中备用。
二、载玻片和盖玻片的处理
1、将挑好的载玻片和盖玻片放入洗液〔2%HCl+70%乙醇溶液:
70ml无水乙醇+2ml浓HCl+28mlH2O〕浸泡过夜,流水冲洗干净。
2、准备2个烧杯的双蒸水、2个烧杯的95%乙醇和2个烧杯的无水乙醇,将洗好的载玻片和盖玻片依次经过这6个烧杯,在干的纸上蘸干酒精后,于酒精灯上烧干。
3、烧好的载玻片和盖玻片放在折好的锡纸上晾干,最后用锡箔纸包裹。
4、180℃烘5个小时。
5、待载玻片冷却,加4ul多聚-L-赖氨酸〔1mg/ml〕于一端。
用盖玻片〔已经过180℃烘5个小时处理〕的一边接触液滴,进行涂片。
涂片时应观察到“虹膜”的形成。
注意:
假设涂片后多聚-L-赖氨酸不形成一层水膜,则说明载玻片没有洗干净,必须重洗。
请注意标记载玻片的哪一面涂有多聚-L-赖氨酸。
6、涂片之后放入37℃的烫板中干燥过夜〔最短可以4小时,水干了即可〕,准备切片。
经过处理的载玻片应在一周内使用。
。
7、最后封片用的盖玻片不需作任何处理。
使用前用擦镜纸擦净即可〔主要是防尘〕。
三、切片和展片
1、修块。
将包有材料的小蜡块〔包含一个材料〕初步修成六面体,粘在硬木块上。
用刀片将蜡块修成梯形,在材料的周围各留2mm的石蜡即可〔尽可能少留〕。
2、切片。
切片的厚度为7-10um。
在解剖镜下用暗视野观察蜡带,以决定取舍。
3、展片。
将DEPC处理过的蒸馏水滴加在涂有多聚赖氨酸的载玻片上〔注意分清哪一面涂有多聚赖氨酸〕,将蜡带的反面〔注意正反面!
〕漂浮于其上放入烫板上〔42℃〕进行展片。
蜡带完全展开后〔数分钟至几十分钟不等,注意观察以免展过头,以组织不裂开为度〕,吸去多余的水,用一张镜头纸轻轻压在蜡带上,然后用吸水纸吸去多余的水。
置于42℃烫板上干燥过夜。
4、切好的片子应尽量在一星期内进行杂交。
植物组织RNA原位杂交
第二部分RNA探针的地高辛标记
一、转录模板的线性化
要转录的DNA〔150-1200bp,无polyA尾〕被克隆在合适转录载体的多克隆位点上,多克隆位点的外端带有SP6、T7或T3RNA多聚酶的启动子,如pSK、pKS、pGEM-T和pSPT18或19。
转录反应开始之前必须将DNA模板在插入序列的一端进行酶切。
为防止转录出非目的的RNA,应选用产生5’端凸出〔或平端?
〕的内切酶,酶切必须完全。
酶切时要同时制备正义和反义DNA模板。
酶切体系:
总体积200ul
H2O152或172ul
10×Buffer20ul
10×BSA0或20ul
质粒〔1ug/ul〕6ul
酶〔10u/ul〕6ul
RNase〔10mg/ml〕6ul
1、质粒终浓度为ug/ul,加入合适的内切酶及缓冲液〔200ul酶切体系〕,在合适的温度下保温〔如37℃,2小时〕,电泳检查是否酶切完全。
酶切后可以加入等体积的水〔200ul〕,这样可以减少后面抽提时的损失〔注意:
此时应该以混合后的体积作为1倍体积〕
将3M的醋酸钠取出化冻
2、酶切后,加入等体积的酚〔Tris饱和的酚,下层溶液才是酚〕〔200ul〕:
氯仿〔200ul〕〔先加酚,振荡,再加氯仿,振荡〕抽提,12000转/别离心,5min,取上清夜〔弃下层有机相〕到EP管中。
再加等体积的氯仿〔400ul〕抽提,12000转/别离心,5min,取上清夜〔弃下层有机相〕到EP管中。
再重复一次氯仿抽提,取上清。
3、在上述水相中加入3M的醋酸钠〔中和磷酸基团,有助于沉淀DNA〕,使终浓度到达〔由最后所得的上清液的体积决定〕。
约1分半以后再加入2倍冰预冷的乙醇,置冰上1小时〔推荐是-20℃过夜〕。
4、样品取出,12000g离心,10min。
弃上清,加400ul70%乙醇,颠倒混匀后再12000rpm离心10min。
把残液吸尽后,真空干燥〔约1.5min〕,重悬于水或1/10TE〔〕溶液中使终浓度达ug/ul〔视最初的质粒浓度来决定应加TE的体积〕,-20℃保存。
二、
RNA探针的标记
下午开始做,先将Buffer,DDT,ATP,GTP,CTP和Dig-UTP化冻,不同公司用各自的一套反应体系。
1、标记反应体系:
〔室温下,以T7RNA聚合酶为例。
〕
宝丽曼反应体系
10ulDEPC水〔要根据模板加样量决定〕
ul10×T7转录缓冲液
ulRNA酶抑制剂〔50u/ul〕
ul5mMATP
ul5mMGTP
ul5mMCTP
ul1mMDIG-UTP
1ulDNA线性模板〔ug〕
1ulT7RNA聚合酶
Total:
25ul
Promega的反应体系
4-5ulDEPC水〔要根据模板加样量决定〕
5ul5×T7转录缓冲液
ulDDT(100mM)
ul5mMATP
ul5mMGTP
ul5mMCTP
ul1mMDIG-UTP
1-2ulDNA线性模板ug,视模板浓度而定加样体积)
ulRNA酶抑制剂(40u/ul)
1ulT7RNA聚合酶(20u/ul)
Total:
25ul
Takara的反应体系
4.5ulDEPC水〔要根据模板加样量决定〕
ul10×SP6转录缓冲液
ulDDT(100mM)
ul0.1%BSA
ul5mMATP
ul5mMGTP
ul5mMCTP
ul1mMDIG-UTP
1.0ulDNA线性模板(0.05-ug,视模板浓度而定加样体积)
0.6ulRNA酶抑制剂(40u/ul)
1.0ulSP6RNA聚合酶(10-50u/ul)
Total:
25ul
此时将tRNA(100mg/ml)和3.8MNH4Ac拿出来化冻并混匀。
2、37℃温育2小时〔此时可跑胶检测转录产物的长度,但多省略〕。
3、终止转录反应:
75ul1xMS
2ultRNA(100mg/ml)(Sigma,R4251,500units,TypeXXI,Ribonucleicacid,transfer,放在-20℃的EP管;它在万一有RNAase的情况下,则可以保护转录的RNA,牺牲自己去被降解;而且在沉淀的时候可以与合成的RNA共沉淀,尤其在合成的RNA量很少的情况下可以减少损失)
1ulDNA酶〔无RNA酶污染的DNaseI(10u/ul)〕
4、37℃温育10分钟。
5、沉淀:
100ul3.8MNH4Ac〔可增加离子浓度〕
600ul乙醇〔冰上预冷〕
6、-20℃过夜。
〔或在干冰上10分钟,时间稍微长点没关系〕。
配好明天用的70%乙醇/NaCl溶液,体积视标记的数量而定,于4℃冰箱存放。
早上过来先打开离心机和冷井制冷,同时打开60℃水浴。
7、样品取出,4℃13000-15000转/分〔F2402转头〕,离心10分钟,弃上清。
8、用200ul冰预冷的70%乙醇/NaCl冲洗沉淀〔H2O405ul+45ul5MNaCl+1050ul乙醇〕。
9、4℃13000转/分,离心10分钟。
弃上清,真空干燥。
10、加入50ulDEPC水〔4℃溶解10min后再到下一步〕。
11、加入50ul2×碳酸缓冲液〔,使终浓度为200mM〕
12、60℃水解:
模板〔插入片段〕长度水解时间
600-1200bp80-90分钟
400-500bp60分钟〔如Histone〕
200-400bp20-30分钟〔如cyclin〕
小于200bp1-5分钟
此时取出10%醋酸和3MNaAc(pH4.8)化冻。
13、沉淀10ul10%醋酸
12ul3MNaAc(pH4.8)
312ul乙醇〔冰预冷〕
14、-20℃,2小时。
此时打开冷井。
15、重复7-9步。
此时取出TE(pH7.6)化冻。
16、沉淀重悬于50ulTE(pH7.6)中,置-20℃保存〔加入0.5ulRNasin(20u/ul)的RNA酶抑制剂,赵忠不加,因为他配的TE可靠,无RNase〕。
三、RNA探针的检测
先配40mlDig1和15mlDig5溶液,再称取40mgBlockingreagent加入8mlDig1中配Dig2溶液。
1、点膜〔Southern用剩下的膜〕:
ul待测探针;
1-5ng/ul地高辛标记的对照RNA〔宝丽曼公司〕。
2、自然吹干。
3、置于小培养皿中,用5ml地高辛缓冲液1浸湿。
4、地高辛缓冲液2中30分钟。
5、在5ml用5ml地高辛缓冲液1冲洗。
6、在5ml地高辛缓冲液1+1ul地高辛抗体中30分钟。
7、用5ml地高辛缓冲液1冲洗2次,每次15分钟。
8、用5ml地高辛缓冲液5稍加冲洗。
9、在地高辛缓冲液6中〔5ml地高辛缓冲液5中加入7ulNBT和5ulBCIP〕暗处显色10分钟以上。
第三部分原位杂交
前一天晚上
每24张片子准备4-5升无菌水〔无须DEPC处理〕。
盖玻片〔24-30片/30片载玻片〕,25ml量筒1个、50ml量筒5个、100ml量筒1个、250ml量筒3个、500ml量筒7个,1000ml烧杯4个,250ml三角瓶4个,500ml三角瓶4个,1000ml三角瓶8个,铁药勺3把,切片篮2个,平头镊2把。
以上均需180℃烘5小时。
检查储备液
准备新灭菌的枪头、离心管。
第一天
1.早上过来后先把下午实验所需的玻璃缸洗净:
先自来水冲洗,双蒸水过一次,再用无水乙醇过一次,略晾干,最后用氯仿过一次。
然后置于通风橱中吹干备用。
2.同时准备以下12种溶液:
首先从准备多聚甲醛开始,Rnase处理之前的溶液均需用灭菌的蒸馏水配制,Rnase处理之后即可直接使用蒸馏水。
将以下溶液倒入通风橱中的玻璃缸中:
二甲苯1和2(2X300ml二甲苯溶液)
100%乙醇1和2〔2X300ml无水乙醇溶液〕
100%乙醇
8.5%NaCl
水
95%乙醇
285ml
---
15ml
85%乙醇,0.85%NaCl
255ml
30ml
15ml
50%乙醇,0.85%NaCl
150ml
30ml
120ml
30%乙醇,0.85%NaCl
90ml
30ml
180ml
0.85%NaCl
---
30ml
270ml
PBS1和2(2X300ml)
10XPBS2X30ml
水2X270ml
链蛋白酶〔protease〕0.125mg/ml(300ml)
〔如果材料不同,则条件中需改变的是链蛋白酶的浓度及时间〕
20X链蛋白酶缓冲液15ml
水285ml
链蛋白酶粉剂40mg
甘氨酸0.2%(300ml)
10XPBS30ml
水264ml
甘氨酸粉剂克
4%多聚甲醛(300ml)
10XPBS30ml
水270ml
多聚甲醛12克
注意:
〔1〕多聚甲醛有毒应在通风橱中称取配制,多聚甲醛极易飞散称取时通风橱不要抽风,防止将多聚甲醛洒落在天平或台面上造成污染。
〔2〕PBS和水加入三角瓶后,加入2-3粒NaOH,摇匀加热到60℃。
在通风橱中加入12克多聚甲醛,用parafilm封口摇匀直到完全溶解。
置于冰上降温,用硫酸调。
调pH值时不要心急,20ul一次慢慢地加。
乙酸酐溶液〔溶于M三羟基乙基胺pH8〕〔现用现配〕
2M三羟基乙基胺35ml
水665ml
乙酸酐3.6ml
注意:
此溶液现配现用,置于600ml大缸中。
大缸中先放入一个空的载片篮及转子,当盛满载玻片的载片篮放入玻璃缸、搅拌子开始搅拌时,再加入乙酸酐。
一、
组织预处理
下午一点左右可以开始做。
先打开37℃的水浴锅。
切片经镜检后,装入不锈钢载片篮中〔24片/篮〕,在通风橱中进行以下操作:
〔1〕二甲苯110分钟
(1)
〔2〕二甲苯210分钟
〔3〕100%乙醇11分钟←←↑〔新鲜〕
〔4〕100%乙醇230秒↑
〔5〕95%乙醇30秒↑
〔6〕85%乙醇,0.85%NaCl30秒↑
〔7〕50%乙醇,0.85%NaCl30秒↑
〔8〕30%乙醇,0.85%NaCl30秒→→↑
〔9〕0.85%NaCl2分钟〔此时于37℃水浴中配链蛋白酶溶液,枪
头助溶;同时第二篮开始进入脱水程序〕
〔10〕PBS12分钟(3)〔PBS溶液中可以多放置一会〕
〔11〕链蛋白酶10分钟〔37℃水浴,水解RNA上的蛋白,同时使探
针容易进入〕
〔12〕甘氨酸2分钟〔终止链蛋白酶的反应〕
〔13〕PBS12分钟
〔14〕多聚甲醛10分钟〔后固定的作用,将RNA与细胞中的蛋白交
联再一起,同时可固定蛋白酶,同时应开
始配乙酸酐溶液〕
〔15〕PBS12分钟
〔16〕PBS22分钟
〔17〕乙酸酐10分钟〔消除RNA上或细胞外表的正电荷〕
〔18〕PBS22分钟
〔19〕0.85%NaCl2分钟
3、上行〔↑〕脱水,从30%乙醇到100%乙醇〔‘100%乙醇1’换成新鲜的〕。
注意:
对于第二篮:
(1)将原‘二甲苯1’倒掉〔回收〕,原‘二甲苯2'成为新二甲苯1,新加入的二甲苯作为二甲苯1。
(2)系列乙醇可以再用。
(3)将原PBS1倒掉,原PBS2仍为PBS2,新配的PBS作为PBS1。
(4)玻璃缸用完后,用灭菌蒸馏水冲洗,加少量乙醇浸泡,用时吹干即可。
上行结束后,把载片篮取出,把无水乙醇吸干后用锡纸包好,留一个小口,与超净台上吹干。
二、杂交
先打开80℃的水浴锅。
1、准备杂交缓冲液〔32ul/张,可以多准备一些。
〕
24张载玻片
10Xsalt
125ul
甲酰胺a〔1〕
500ul
tRNA(100mg/ml)
ul
50XDenhardt's
25ul
水
ul
50%dextransulphate
250ul
总体积
1000ul
注意:
50%dextransulphate非常粘稠,加热后,再用剪去尖端的枪头加。
2、震荡混合杂交缓冲液,离心,置于室温下。
3、在冰上混合:
〔每一张载玻片〕〔根据探针的浓度决定探针的加样量〕
探针2ul
水2ul
甲酰胺a〔1〕4ul
4、将探针/水/甲酰胺混合物在80℃加热2分钟,离心,在冰上迅速冷却。
5、将探针混合液〔8ul/张〕与杂交缓冲液〔32ul/张〕混合,震荡,离心,置于室温下。
6、将载片篮拿出,吹干载玻片上乙醇。
铺一层吸水纸,上面覆一层保鲜膜,还有平头镊子。
7、每一张载玻片加38-40ul的杂交缓冲液/探针溶液,用处理过的盖玻片盖于其上,防止产生气泡。
〔此时最好关空调,防止产生气泡〕
8、准备2XSSC,50%甲酰胺〔50ml/盒,8张载玻片/盒,共三盒〕
3盒6盒
20XSSC15ml30ml
水60ml120ml
甲酰胺b〔2〕75ml150ml
9、将4张吸水纸双折,铺于盒底,加入50ml2XSSC,50%甲酰胺,再于纸上盖一层保鲜膜,载玻片置于其上。
盖上盒盖,用胶带密封。
、
10、在50℃水浴中杂交过夜。
注:
甲酰胺a〔1〕----指去离子甲酰胺〔MolecularBiologygrade〕,保存与冰箱中;
甲酰胺b〔2〕---国产,保存于通风橱下储藏柜。
准备冲洗缓冲液和NTE溶液,明天备用;同时清洗装乙酸酐的盒子备用。
第二天
如果在早上准备第四步地高辛缓冲液2,第三、四步可以在同一天内完成,共需12个小时。
三、冲洗
1、将一个水浴设定在37℃,如果要进行抗体染色〔第四步〕还需要一个50℃的水浴用于配置地高辛缓冲液2。
2、准备冲洗缓冲液:
〔每篮需要:
1X500ml+3X300ml=1400ml〕
冲洗缓冲液:
2XSSC,50%甲酰胺b
20XSSC
50ml
30ml
甲酰胺b
250ml
150ml
水
200ml
120ml
总体积
500ml
300ml
3、将载玻片放回入载片篮中。
4、在800ml大塑料盒底部放入一个空载片篮,将装有载玻片的篮置于其上,加入700ml冲洗缓冲液。
在50℃水浴中温育30分钟。
注意:
此时盖玻片会落下。
5、换入300ml玻璃缸,加入新鲜冲洗缓冲液,在50℃水浴中温育1小时30分钟。
重复一次。
6、在冲洗的过程中,准备NTE溶液〔每篮需要:
5X300ml〕
NTE溶液
1篮
2篮
5XNTE
300ml
600ml
200ml
水
1200ml
2400ml
800ml
总体积
1500ml
3000ml
1000ml
7、用NTE溶液,在37℃水浴中冲洗两次,每次5分钟。
8、载片篮放入RNA酶A溶液〔20ug/ml〕中,37℃水浴温育30分钟。
RNA酶A溶液
1篮
2篮
RNA酶A储备液10mg/ml
0.6ml
1.2ml
NTE溶液
300ml
600ml
注意:
〔1〕RNA酶A溶液应提前放入37℃水浴中预热5分钟。
〔2〕加入RNA酶A以后各步:
直接使用蒸馏水仪的蒸馏水即可。
〔3〕加入RNA酶A之前和之后使用的玻璃缸一定要分开放置,切勿混用!
〔4〕加入RNA酶A之前使用的玻璃缸,每次用完后冲洗干净,加入部分100%乙醇浸泡,下次使用前在通风橱中吹干即可。
9、准备如下溶液:
1XSSC
1篮
2篮
20XSSC
15ml
30ml
水
285ml
570ml
PBS(每篮需要:
2X300ml)
1篮
2篮
10XPBS
60ml
120ml
水
540ml
1080ml
10、NTE溶液,室温冲洗两次,每次5分钟。
11、冲洗缓冲液,50℃水浴,温育1小时。
12、1XSSC,室温,2分钟。
13、PBS,室温,5分钟。
四、抗体染色
1、用上面的50℃的水浴用于配制地高辛缓冲液2〔因为有BSA的缘故,为半透明的溶液〕。
2、准备如下溶液:
地高辛缓冲液1〔100mMTris-Hcl,150mMNaCl〕(每24片需800ml)
24片载玻片
48片载玻片
10X地高辛缓冲液1
80ml
160ml
水
720ml
1440ml
地高辛缓冲液2〔0.5%[W/V]blockingreagent〕(每24片需90ml)
3盒
6盒
Blockingreagent
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