黄酮规范标准曲线绘制的试验报告.docx
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黄酮规范标准曲线绘制的试验报告
黄酮标准曲线绘制的实验报告
1.总黄酮的测定
1.1实验仪器
电子天平AR2140;
紫外可见分光光度计UV2754;
型数控超声波清洗器KQ3200DB;
超级恒温槽;
RotavaporR200旋转蒸发仪;
FD21C250冷冻枯燥机2
1.2试剂及药品
产丁标准品
硝酸铝国产分析纯〔配成5%〕
亚硝酸钠国产分析纯〔配成10%〕
氢氧化钠国产分析纯配成〔配成1mol/L〕
95叱醇,无水乙醇国产分析纯〔配成60%L醇50%乙醇〕
DPPH〔2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,二苯代苦味肥基自由基〕
Vc〔Ascrobicacid,维生素C,抗坏血酸〕
没食子酸对照品:
基准纯.
大青叶子采摘于海南大学东坡湖畔
1.3实验步骤:
1.3.1准备工作及波长确实定
样品60c烘干粉碎机粉碎,过20目筛,装入试剂瓶中备用.根据查阅文献
总黄酮在波长为510nm处吸收值最大.
1.3.2参照品产丁标准溶液的制备
精密称取120C枯燥至恒重的产丁标准样品37.5mg置于100mL烧杯中,用60叱醇溶解后定容至25mL容量瓶中,摇匀,即可得1.5mg/mL的产丁标准溶液.
1.3.3标准品的测量及绘制标准曲线
精密吸取产丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL,分别置于
10mL容量瓶中,并定容至刻度线.得到0.0mg/ml、0.15mg/ml、0.3mg/ml、
0.45mg/ml、0.6mg/ml、0.75mg/ml、0.9mg/ml的标准品溶液,分别取1ml到试管中各加5%亚硝酸钠溶液0.3mL摇匀,放置6min,加10%肖酸铝溶液0.3mL摇匀,放置6min,加1mol/L氢氧化钠溶液4mL,再用60叱醇溶液稀释至刻度,放置15min后,分别在510nm处测定其吸光度(Tai,Cai&Dai,2021).(以试剂空白做参比)
以吸光度A为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线.用最小二乘法进行线性拟合,得c与A的线性回归方程以及相关系数R.
厅P
ug/ml
1
0
0
2
15
0.180
3
30
0.349
4
45
0.546
5
60
0.727
6
75
0.884
7
90
1.063
表1-1:
产丁标准曲线测定数据
y=0.0138x^0.0023R"2=Q.
0111'<
05040€0SOLOO
Rutinconcentraiiontis/iil)
图1-2:
芦丁标准曲线
1.3.5样品的测试
根据查阅文献总黄酮在波长为510nm处吸收值最大.取黄酮提取液,取提
液2ml至10ml的比色管中用60%勺乙醇定容至亥U度线那么稀释5倍.取稀释好的溶液4份1ml置入10ml的比色管中,其中一份用60%勺乙醇定容,作为参比溶液.其余各份各加5祉硝酸钠溶液0.3mL摇匀,放置6min,加10%肖酸铝溶液0.3mL摇匀,放置6min,加1mol氢氧化钠溶液4mL,再用60%L醇溶液稀释至刻度,放置15min后,分别在510nm处测定其吸光度.代入标准曲线回归方程可得浓度数据〔以产丁为参比〕,三次结果取平均值.经换算后得样品中总黄酮含量.
样品总黄酮含量〔mg/g尸X*n*V1/〔V*W〕
式中:
X—测出的浓度,mg/mL;〔直接代入,不用换算.〕
n一稀释倍数,量纲为1;
V一样液总体积,mL;
V—测定时取样体积,mL;
W-样品质量,g.
2,总分含量的测定
2.1实验仪器
ALZO例电子分析天平:
上海梅特勒一托利多仪器;
DELAJEO型pH计:
上海梅特勒一托利多仪器;
723可见分光光度计:
上海菩华科技仪器;
DK—512型电热恒温水浴锅:
上海森信实验仪器;
容量瓶〔250mL,100mL25mL〕、比色管管〔10mL〕;
烧杯、移液管、吸耳球.
2.2试剂及药品
没食子酸对照品:
基准纯,购于上海分析试剂厂,置50c真空枯燥箱真
空中枯燥4h0乙醇为工业级,蒸储水,其他试剂均为分析纯.
2.3Folin—Ciocalteu比色法测定总酚酸含量
3.3.1Folin-Ciocalteu试剂的配制
称取20g鸨酸钠和5g铝酸钠于圆底烧瓶中,用140ml蒸储水溶解,参加10ml85%的磷酸溶液和20ml浓盐酸,文火回流10h,然后参加3g硫酸锂及15ml双氧水,加热沸腾15min至亮黄色,不得带微蓝和绿色.冷却,移入250ml容量瓶中,定容,贮于棕色瓶中,4c冰箱保存.
3.3.2对照品溶液制备
准确称取15.00m时燥的没食子酸,加蒸储水适量,超声溶解,放冷,以蒸储水定容至50ml,制成0.3mg/m改食子酸的溶液,作为对照品溶液.
将0.3mg/mL的没食子酸标准?
§液分别配制成0.0mg/mL,0.03mg/mL,0.06mg/mL,0.09mg/mL,0.12mg/mL,0.15mg/mL、0.18mg/mL、0.21mg/mL勺溶液,分别取1mLS于10mLi勺容量瓶中,参加2ml福林试剂,充分摇匀,参加0.75ml7.5%
碳酸钠溶液.混匀,以蒸储水稀释至刻度.振荡一下,静置2h(Guo&Wei,2021).同时制作空白管.为消除供试品溶液本身颜色的干扰,同时制作不加显色剂的对照管.于765nm波长处测定吸光度值.
3.3.3标准曲线的制备
以吸光度A为纵坐标,
浓度c为横坐标,绘制标准曲线.用最小二乘法进行
线性拟合,得c与A的线性回归方程以及相关系数R2o
厅P
浓度
(ug/ml)
吸光度(WL765.0
0
0
0
1
3
0.132
2
6
0.284
3
9
0.411
4
12
0.582
5
15
0.712
6
18
0.843
7
21
1.013
表3-1:
没食子酸标准曲线测定数据
图3-1:
没食子酸标准曲线
3.3.4样品的测定
取提液2ml至10ml的比色管中用60%勺乙醇定容至亥U度线那么稀释5倍.取稀释后溶液1ml四份,分别置于10mL比色管中,参加2ml福林试剂,充分摇匀,参加0.75ml7.5%碳酸钠溶液.混匀,以蒸储水稀释至刻度.振荡一下,静置2h0同时制作空白管.为消除供试品溶液本身颜色的干扰,同时制作不加显色剂
的对照管.于765nm波长处测定吸光度值.总酚酸含量计算:
3.去除DPPH-的水平的测定
3.1.实验仪器、药品及试剂
3.1.1实验仪器
ALZO例电子分析天平:
上海梅特勒一托利多仪器;
DELAJEO型pH计:
上海梅特勒一托利多仪器;
723可见分光光度计:
上海菩华科技仪器;
DK—512型电热恒温水浴锅:
上海森信实验仪器;
容量瓶〔250mL,100mL25mL〕、比色管〔10mL〕;
烧杯、移液管、吸耳球.
3.1.2试剂及药品
DPPH〔2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,二苯代苦味肥基自由基〕;
Vc〔Ascrobicacid,维生素C,抗坏血酸〕为分析纯;
无水乙醇,蒸储水
3.2.1配制DPPFHSM
配制0.06mMDPPH剂J,放入冰箱4c进行冷藏,以备用
3.2.2参照品Vc标准溶液的制备
准确称取17.6mgVc至ij100mL的烧杯中用无水乙醇溶解后,置于50mL的容量瓶中定容至刻度线及可以得到2mmol/L的母液,分别量1、2、3、4、5、6ml至10ml的比色管中用无水乙醇定容至刻度线,那么可以得到0.2mmol/L、0.4mmol/L、
0.6mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L、1.2mmol/L的溶液.从以上比色管中分别取0.1ml溶液置于试管中再参加3.9ml的DPPH反响30min,在517nm测出吸光值〔Thoo&Ho,2021〕,用无水乙醇代替待测液作为对照,用无水乙醇作空白,重复三组.
消除率=[〔Ac-Ai〕/Ac]X100%
式中,Ac:
0.1mL无水乙醇加3.9mLDPPH溶液的吸光度;
Ai:
0.1mL待测液加3.9mLDPPH溶液的吸光度.
3.2.3标准曲线的绘制
3.2.2测试数据及标准曲线的绘制
'P
C(mmol/L)
吸光度
消除率/%
0
0
0
1
0.2
0.529
14.92
2
0.4
0.424
30.90
3
0.6
0.32
46.73
4
0.8
0.209
63.62
5
1
0.11
78.69
6
1.2
0.02
92.39
表3-1:
VC标准曲线测定数据
以吸光度A为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线.用最小二乘法进行线性拟合,得c与A的线性回归方程以及相关系数R.
图3-1:
VC含量与吸光度的关系
3manaaiE口屿TEvHm
图3-1:
VC含量与去除率的关系
3.2.4样品的测定
取提液4ml至10ml的比色管中用60%勺乙醇定容至亥U度线那么稀释2.5倍.取稀释后溶液0.1mL三份,分别置于10mL试管中,再分别参加配置好的DPP哈液3.9mL,摇匀,反响30min后,分别在517nm处测定其吸光度.代入标准曲线回归方程可得浓度数据(以Vc为参比),三次结果取平均值.经换算后得样品自由基消除率.
4.去除ABTS自由基水平的测定
4.1ABTS+自由基的配制
准确称取0.19215gABTS于50mL的容量瓶中,用无水乙醇定容,摇匀,浓度7mmol/L;7mmol/LABTS+.与2.45mmol/L的高硫酸钾等体积混合,在室温、避光黑暗的条件下静置过夜反响12~16h,形成ABTS+自由基储藏液.该储藏液在
室温,避光的条件下稳定.用前用无水乙醇稀释成工作液,于波长734nm处测得其吸光度为0.7000(±0.02),再装入棕色试剂瓶中,放入冰箱4c进行冷藏,以备用.
4.2标准曲线的绘制
4.2.1参照品Vc标准溶液的制备及测试
准确称取8.8.mgVc到100mL的烧杯中用无水乙醇溶解后,置于50mL的容量瓶中用无水乙醇定容至刻度线及可以得到1mmol/L的母液,分别量1、2、3、4、5、6、7、8ml至10ml的比色管中用无水乙醇定容至刻度线,那么可以得到0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L的溶液.从以上比色管中分别取0.1ml溶液置于试管中再参加3.9ml的DPPH反响30min,在517nm测出吸光值,用无水乙醇代替待测液作为对照(Zhu&Lian,2021),用无水乙醇作空白,重复三组.
消除率=[(Ac-Ai)/Ac]X100%
式中,Ac:
0.1mL无水乙醇加3.9mLABTS+自由基溶液的吸光度;
Ai:
0.1mL待测液加3.9mLABTS+自由基溶液的吸光度.
4.2.2测试数据及标准曲线的绘制
'P
C(mmol/l)
吸光度
消除率/%
1
0
0.00
2
0.1
0.57
12.04
3
0.2
0.493
23.92
4
0.3
0.422
34.88
5
0.4
0.351
45.83
6
0.5
0.276
57.41
7
0.6
0.2
69.14
8
0.7
0.118
81.79
90.80.03594.60
表4-1:
Vc浓度与吸光值和去除率的数据
图4-1Vc浓度与其吸光值的关系
图4-2:
Vc浓度与其去除ABTStt力的关系
5.复原水平的测定
5.1实验试剂
磷酸盐缓冲溶液(配成PH6.60.2mol/l);
K3Fe(CN)6溶液(配成1%);
三氯乙酸(配成10%);
FeCl3(配成0.1%);
没食子酸无水乙醇5.2标准曲线的绘制5.2.1试剂的配制
磷酸盐缓冲溶液(pH6.60.2mol/L):
准确称取7.16g的磷酸氢二钠至100mL的烧杯中用蒸储水溶解后,置于100mL的容量瓶中用蒸储水定容,即可得到
0.2mol/L的磷酸氢二钠,同样的方法配制0.2mol/L的磷酸二氢钠.准确量取
37.5mL的0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和62.5mL的0.2mol/L磷酸二氢钠溶液至烧杯中,用pH校正既可以得到磷酸盐缓冲溶液(pH6.60.2mol/L).
5.2.2标准溶液的配制及测试
用没食子酸做标准曲线其浓度范围在50—300ug/ml,准确称取50mg没食子酸到100mL烧杯中用无水乙醇溶解后,置于容量瓶中用无水乙醇定容至刻度线,得到0.5mg/ml的母液,在分别取1mL2mL3mL4mL5mL6mL至10mL的容量瓶中用无水乙醇定容至刻度先,得到50ug/ml、100ug/ml、150ug/ml、200ug/ml、250ug/ml、300ug/ml的溶液,取不同浓度的待测液或样品1ml于试管中,依次
参加PH6.6磷酸盐缓冲溶液(0.2mol/l)2.5ml和1%K3Fe(CN)6溶液2.5ml后混合均匀,混合液于50c水浴20min,再参加10%勺三氯乙酸2.5ml.于
(3000r/min)离心10min,取2.5ml的上清液再依次加2.5ml蒸储水和0.1%的FeCl30.5ml混合均匀,静置10min在700nm处测定吸光值,通过在700nm下的吸收值来测量提取物的复原水平,吸光值越高说明复原力越强,ECo的计算是吸
光值为0.5时的浓度(Roy&Laskar,2021).
5.2.3测试数据及标准曲线的绘制
gallicacid
Testset
concentration
Absorbency
ug/ml
1
0
0
2
50
0.59
3
100
1.1
4
150
1.527
5
200
2.073
6
250
2.579
7
300
3.1
表5-1:
没食子酸的质量浓度和吸光值的数据
GallieacidconcentrationusZmL
图5-1:
没食子酸的质量浓度与其吸光值的关系
6.超氧自由自测定
6.1实验试剂1实验试剂Tris-Hcl缓冲液(配制PH8.2050mmol/L)邻苯三酚(配制3mmol/L)
VC
无水乙醇
6.2标准曲线的绘制
6.2.11试剂的配制
Tris-HCl(pH8.250mmol/L)缓冲溶液:
取0.6057g三羟甲基氨基甲烷(Tris),蒸储水溶解定容至50mL容量瓶;取0.309mL分析纯盐酸溶液至100mL的容量瓶中用蒸储水定容至刻度,即得0.1mol/L盐酸溶液;分别取配置好的Tris50mL和0.1mol/L盐酸溶液22.9mL于100mL>量瓶中,蒸储水定容至刻度,用pH计进行校正即可以得到Tris-HCl(pH8.250mmol/L)缓冲溶液.邻苯三酚:
配制10mmol/L的稀盐酸,取0.310mL分析纯盐酸溶液至1000mL的容量瓶中用蒸储水定容至刻度线;取焦性没食子酸0.0095g,至25mL的容量并中用10mmol/L的稀盐酸溶液定容至刻度线.
6.2.2标准溶液的配置及测试
精密称取Vc标准样品0.0300g置于100mL烧杯中,用纯洁水溶解后定容至100mL容量瓶中,即可得0.3mg/mL的Vc标准溶液.
将0.3mg/mL的Vc标准溶液分别配制成0.0mg/mL,0.03mg/mL,0.06mg/mL,0.09mg/mL,0.12mg/mL,,0.15mg/mL,0.18mg/mL,0.21mg/mL,0.24mg/mL,0.27mg/mL,0.3mg/mL勺溶液,分别参加4.5mL的Tris-HCl(pH8.250mmol/L)缓冲溶液于10mL的试管中,再参加1mL不同浓度样品或待测液,25c反响10min,再参加25c预热的邻苯三酚0.1mL(3mmol/L用10mmol/L的盐酸配制),迅速摇匀,于325nm出测定,参加邻苯三酚即开始计时,每隔30s读取一次,至5min,
做好记录.邻苯三酚的自氧化速率以无水乙醇代替样品,Tris-HCl缓冲溶液作
空白.
消除率%=[(AAc-AAi)/AAc]乂100%
式中,△Ac:
邻苯三酚自氧化速率;
△Ai:
参加待测液后邻苯三酚自氧化速率
6.2.3测试数据及标准曲线的绘制
吸光值
自氧化速率
抑制率
时间min
1st
5th
J丁P
邻苯三酚0.1ml
0.142
0.411
0.06725
1
浓度ug/ml0
0
0
0
0
2
30
0.032
0.246
0.05350
20.45
3
60
0.015
0.179
0.04100
39.03
4
90
0.012
0.13
0.02950
56.13
5
120
0.007
0.074
0.01675
75.09
6
150
0.006
0.025
0.00475
92.94
表6-1:
Vc的质量浓度与吸光值和抑制率的的数据
决LRcTPreJ心PFNUJUUncc-HQg5』由bos
图6-1:
Vc的质量浓度与其去除超氧自由基关系
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