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RhoGDI2antagonizesovariancarcinomagrowthinvasionandmetastasis
抽象
以往的研究功能角色Rho的GDP解离抑制剂2(RhoGDI2),膀胱癌,胃癌和乳腺癌。
然而,只有有限的表达和没有功能上的分析已经完成在卵巢癌RhoGDI2。
我们确定RhoGDI2蛋白表达和功能的卵巢癌。
首先,蛋白质凝胶印迹分析是为了确定卵巢细胞系中的表达水平RhoGDI2。
RhoGDI2,但不是RhoGDI1蛋白质表达水平差别很大卵巢癌细胞株,水平升高可见于的Ras转化卵巢上皮细胞。
接下来,进行免疫组化检测RhoGDI2已知的病理类型,分期,等级和结果卵巢囊肿和卵巢癌患者样品中的表达。
显著RhoGDI2蛋白过度表达在高档与低档的卵巢癌相比,与组织学亚型,与卵巢癌的阶段也不癌和良性囊肿之间没有相关性。
不料,稳定抑制RhoGDI2蛋白表达在HeyA8卵巢癌细胞增加锚地独立增长和基底膜浸润在体外和尾静脉肺菌落转移在体内生长。
最后,我们发现是RhoGDI2稳定地相关联的优先与Rac1和抑制RhoGDI2表达的Rac1的活性和消旋相联JNK和p38mitogenactivated的的蛋白激酶信号下降导致。
卵巢癌细胞HeyA8,拮抗RhoGDI2侵袭转移表型。
总之,我们的研究结果表明显著细胞上下文差异在RhoGDI2癌细胞生长的功能。
关键词:
鸟嘌呤核苷酸分解抑制剂2,罗小GTPase,卵巢癌,RAC,转移
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介绍
RAS同源(RHO)GTP酶包括Ras超家族小GTP酶,一大分支与Rac1的Cdc42和RhoA蛋白是最好的特征。
- 3 RhoGTP酶的重要调节肌动蛋白细胞骨架组织,细胞极性和迁移,细胞周期进程和基因表达。
像RAS,其功能异常与人类癌变和其他疾病相关。
1 -然而,不像频繁直接激活的Ras突变在癌症,RhoGTP酶不直接突变,相反,他们的功能都放开间接通过改变的Rho调节蛋白的表达和活性。
至目前为止,最好的机制之一涉及不适当的鸟嘌呤核苷酸交换因子激活(RhoGEFs)促进形成的RhoGTP酶激活,GTP结合的形式,GTPase激活蛋白的表达和损失(RhoGAPs)的加速GTP水解和无效GDP结合RhoGTP酶的形成。
第三类监管机构的参与,罗GDP解离抑制剂(RhoGDIs),是很好理解的少,并在最近获得了更多的关注,因为可能用于治疗癌症的治疗靶点。
4 , 5
三个人类RhoGDI亚型,RhoGDI1(也称为GDI,GDIα),RhoGDI2(LyGDI/D4GDI/GDIβ),RhoGDI3(GDIγ),通常被认为是负向调节功能的RhoGTPase活性首先通过三个不同的生化机制。
6RhoGDIs绑定和掩码翻译后连接到靶序列的Rho家族小GTP酶的C-端膜的C-末端异戊二烯组。
的RhoGTP酶RhoGDI结合形式在细胞质中的无效复杂,因为异戊二烯的脂质修饰是必不可少的,适当的亚细胞定位和生物活性膜协会。
其次,RhoGDIs抑制RhoGEF介导的GDP-GTP交换,有利于的无效GDP结合的形式。
第三,他们与GTP结合的形式进行交互抑制GTP水解,RhoGAP的催化GTPase活性的,防止与下游效应目标的相互作用。
然而,RhoGDIs也可以作为积极的监管通过针对RhoGTP酶亚膜,它们与不同的效应或保护RhoGTP酶,蛋白酶降解。
最后,不同的组织表达模式,亚细胞定位和特定的RhoGTP酶家族成员的互动与建议鲜明三个RhoGDIs功能。
而RhoGDI1广泛表达,在多种癌症中表达的改变RhoGDI1和/或RhoGDI2的RhoGDI2正常造血组织中优先表达,据报道,在参考文献4和5 。
然而,癌细胞生长的RhoGDI1RhoGDI2的确切作用是复杂的,有时是相反的作用及可能的肿瘤的类型不同描述的功能。
在膀胱癌转移抑制RhoGDI2角色已经建立。
应用基因芯片分析,Theodorescu和他的同事们报告说,减少RhoGDI2但不RhoGDI1更微创HRAS突变阳性T24膀胱癌的细胞株变种基因/蛋白表达与7异位修复的RhoGDI2表达在侵入T24变种减少转移由尾静脉肺肿瘤在小鼠体内定植。
最后,免疫组织化学(IHC)分析发现51例膀胱肿瘤,RhoGDI2过度表达与较短的时间内针对特定疾病的死亡。
8
一种肿瘤促进作用RhoGDI2过度相反的结果与膀胱癌,胃癌在一项研究中。
RhoGDI2蛋白表达被发现胃癌肿瘤组织中高,较正常胃组织的表达水平的RhoGDI2与淋巴结转移相关的蛋白质。
9异位过表达RhoGDI2在光线侵入胃癌细胞显着增加基底膜体外侵袭。
相反,枯竭内源性RhoGDI2在过表达RhoGDI2的胃癌细胞抑制体外侵袭。
这些细胞系中表达RhoGDI2强制增加在小鼠的肿瘤生长,血管生成和肺转移。
因此,在对比的膀胱癌细胞,RhoGDI2过表达促进而不是抑制侵袭和转移的乳腺癌和胃肿瘤细胞株。
已经描述了更复杂的,有时是相对的,表达的变化和角色在乳腺癌组织中的RhoGDIs。
一项研究发现膀胱癌相似,表达的RhoGDI1RhoGDI3减少,但不RhoGDI2在乳腺肿瘤组织与正常时的表现,而该亏损与淋巴结和远处转移,预后较差。
11相比之下,第二项研究中,使用免疫组织化学染色71肿瘤病人中发现了双相模式增加RhoGDI2表达与乳腺增生,但进展及淋巴结转移的表达减少12在第三项研究,表达RhoGDI2的是不相关的两个大乳房要么无病或总生存期癌症的同伙,但他们发现,RNAi抑制增强RhoGDI2表达的MDA-MB-231乳腺癌细胞体外侵袭。
10最后,第四个研究发现,高RhoGDI2在肿瘤中的表达,但不是良性的乳腺肿瘤细胞株,并击倒RhoGDI2MDA-MB-231细胞活力下降,基底膜体外侵袭导致, 13这些对比观察,防止建立一个清晰的格局RhoGDI2表达变化在肿瘤进展和为RhoGDI2在乳腺癌恶性生长的功能作用。
已经描述了只有有限的RhoGDI在卵巢癌中的表达和功能的评价。
在一项研究中,被认定通过三个侵入卵巢肿瘤中过度表达的蛋白质组分析RhoGDI1蛋白表达,相比三低潜在恶性卵巢肿瘤, 14符合促进侵袭和转移中的作用RhoGDI1。
在基因芯片研究的六个的浆液cystadenocarcoma和一个囊腺瘤,上调RHOGDI2转录相关的癌相比,良性腺瘤组织。
15然而,没有蛋白表达的分析。
此外,在芯片技术的研究,以确定16浆液性卵巢癌组织中的免疫组织化学分析发现,RhoGDI2蛋白的过度表达是不接受紫杉醇为基础的化疗的患者与卵巢癌紫杉醇耐药相关基因表达的变化,RhoGDI2过度表达与阻力。
阶段或组织学分级密切相关,但更常出现无应答者(四五例)比应答者(16例)。
他们的结论是RhoGDI2的表达可能是预测标记的紫杉醇不仅在紫杉醇耐药细胞株的电阻,而且患者样品中。
目前,只有有限的RhoGDI1和RhoGDI2蛋白在卵巢癌中的表达和功能的分析已经完成。
在目前的研究中,我们发现,RhoGDI2,但不RhoGDI1蛋白质表达差异很大面板卵巢癌的细胞株和卵巢肿瘤,此外,在Ras转化的人类卵巢表面上皮细胞升高,提示,RhoGDI2过度表达可能促进肿瘤生长。
RhoGDI2明显过度表达在高档比低档卵巢癌的。
然而,RhoGDI2水平没有与卵巢癌的阶段,并表示在两个癌和良性囊肿。
令人惊讶的是干扰RNA抑制RhoGDI2,增加基底膜的HeyA8卵巢癌细胞株侵袭和增加肺癌定植在一个尾静脉肺转移实验。
我们的研究结果支持RhoGD2的侵袭和转移抑制的作用。
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结果
可变的RhoGDI2蛋白在卵巢癌的细胞系和肿瘤组织中的表达。
虽然以前的研究认为,RhoGDI2蛋白的过度表达与卵巢肿瘤的进展, 15只计算这些分析基因的转录并没有卵巢肿瘤生长的功能贡献分析解决。
因此,我们首先进行了蛋白质凝胶印迹分析,评估人类卵巢癌细胞株的面板和另外配对的永生化人类卵巢表面上皮细胞(T29)和转化突变激活的RasectopicallyexpressedRhoGDI2蛋白质的表达(T29,T29H-ras基因K-RAS)( 图1A )。
非常低或无法RhoGDI2的表达被认为在未转化的T29细胞,以及三个卵巢肿瘤细胞系(A2780,OVCAR-8和SKOV-3)。
与此相反,我们发现高RhoGDI2四个卵巢癌细胞系(OVCAR-3,HeyA8,OVCAR-4和OVCAR-5)的水平。
我们还发现,在两个T29H-Ras和T29的K-ras基因细胞的升高RhoGDI2表达,提示的作用RhoGDI2转型。
与此相反,RhoGDI1表达水平分别相当于对所有细胞系。
没有RhoGDI2过度表达与细胞的侵袭能力通过基底膜或锚地独立增长的软琼脂(数据未显示)。
这些数据表明,可伴有RhoGDI2的过度表达与卵巢癌的细胞转化和致瘤性的生长。
图1
变量水平的RhoGDI2,但不RhoGDI1蛋白表达在人卵巢癌细胞系。
(A)蛋白质印迹分析RhoGDI1RhoGDI2蛋白的表达。
细胞溶胞产物进行免疫印迹分析,利用特异的抗体RhoGDI1,...
要确定是否过度表达RhoGDI2可以与具体的病理表型在patientderived卵巢癌组织中,我们评估了先前描述和验证388例手术切除的人卵巢癌组织中含有已知的临床病史的卵巢组织芯片RhoGDI2蛋白表达。
17-我们使用福尔马林固定,石蜡包埋的细胞系抗体IHC首次验证了RhoGDI2的。
在与我们的蛋白质凝胶印迹数据( 图1A ),我们发现,抗-RhoGDI2抗体染色阴性A2780细胞和积极在HeyA8细胞( 图1B )。
RhoGDI2染色主要见于卵巢肿瘤细胞的细胞质中,在细胞核中也观察到染色。
RhoGDI2显着高表达中高档(344例)相比,低度恶性卵巢癌(43例),虽然表达不与卵巢癌的阶段( 图1B和表1 )。
表达RhoGDI2和组织学亚型之间的关联有统计学意义( 表1 )。
此外,癌70例,良性囊肿32例( 表1 )之间无显着差异表达。
透明细胞癌低表达RhoGDI2比例更加频繁相比,浆液性和移行细胞癌,粘液浆液性,低分化,恶性苗勒管混合瘤(肉瘤),混合型癌相比,子宫内膜浆液性和混合型癌相比( 表2 )。
虽然没有统计学意义,但有一个趋势卵巢癌患者,高水平的RhoGDI2有一个总体生存率下降( 图1C )。
表1
分级,分期和肿瘤的诗句表达的RhoGDI2和组织学亚型之间的相关性,非肿瘤性卵巢癌患者组织
表2
p值两两协会之间不同的组织学亚型
抑制RhoGDI2表达增强HeyA8卵巢肿瘤细胞在体外和体内的生长特性。
为了确定如果RhoGDI2过度表达导致卵巢癌细胞的生长和侵入型,我们选择研究HeyA8细胞,表现出非常高的水平RhoGDI2蛋白表达( 图1A )。
我们专注于的HeyA8细胞株的理由是基于最初是从一个女人与先进,治疗难治性卵巢癌,此行乃代表的极端增长见于临床疾病的事实。
最后,HeyA8的细胞在小鼠尾静脉肺定植转移实验常用,因为通过血管侵入细胞的能力,附加并和肺菌落形成。
20 , 21 HeyA8细胞稳定地感染逆转录病毒载体表达任一控制目标shRNA的(GFP)针对RhoGDI2(指定RhoGDI2我和第二RhoGDI),或两个独立的shRNA。
感染三天后,细胞嘌呤选择建立大规模人口稳定感染细胞,并进行印迹分析验证表达RhoGDI2的抑制。
的GFPshRNA的offtarget的的控制结构有没有影响,,而两个RhoGDI2我和RhoGDI2II对RhoGDI2表达shRNA的表达细胞显示〜90%稳态蛋白表达水平下降( 图2A )。
此外,RhoGDI1表达水平没有改变击倒RhoGDI2后,表示没有代偿性增加
图2
稳定抑制RhoGDI2在HeyA8细胞增加基底膜侵袭,锚地独立生长在软琼脂和肺部定植尾静脉肺转移鼠标实验。
(A)稳定地shRNA的抑制RhoGDI2蛋白表达。
HeyA8细胞 ...
稳定抑制RhoGDI2表达并没有引起细胞形态,还是在体外的生长速率(数据未示出)中的可检测的改变。
然而,当细胞通过基质胶侵袭进行了评价的,令人惊讶的是,显示HeyA8RhoGDI2敲除细胞浸润增加约2倍相比,与对照细胞( 图2B )。
此外,RhoGDI2抑制显着增加所测得,与对照细胞( 图2C和D)相比时,在软琼脂中集落形成频率anchorageindependentHeyA8增长。
因此,出乎意料的是,虽然RhoGDI2在HeyA8细胞中表达升高,这些结果支持抑制肿瘤和侵袭,而不是一个原癌基因在卵巢肿瘤细胞功能RhoGDI2。
要确定是否下调RhoGDI2改变转移性生长特性的HeyA8细胞,细胞静脉注射到裸鼠的尾静脉和肺定植和肿瘤形成进行了测量。
在此实验性转移测定中,我们观察到在小鼠肺结节的数量与对照细胞( 图2E和表3 )相比,注入敲除细胞与HeyA8RhoGDI2的一个显着增加。
在小鼠体内的其他器官中未观察到转移结节。
这些结果表明,有针对性地破坏RhoGDI2增加了实验性转移活动的HeyA8细胞在裸鼠体内。
表3
尾静脉肺转移实验RhoGDI2击倒和控制GFP细胞的肿瘤定植能力比较
RhoGDI2功能与Rac活性的调控和信号。
接下来,我们评估了一种机制,可以控制RhoGDI2入侵。
由于最佳特色活动RhoGDI2来调节RhoGTP酶的活性,我们确定的Rho的GTP酶联营公司与RhoGDI2在HeyA8细胞的的。
要么重组谷胱甘肽-S-转移酶(GST)单独或古典研究RhoGTP酶GST融合蛋白含有全长RhoGDI2或RhoGDI1,SDS-PAGE和解决,然后进行蛋白质凝胶印迹分析探测孵育从HeyA8细胞的全细胞提取物与Rac1,Cdc42和RhoA蛋白/C 在与以前的研究在乳腺癌, 22我们发现,所有这三个RhoGTP酶均与RhoGDI1,。
相比之下,我们只检测Rac1的与RhoGDI2。
接下来,确定,如果稳定击倒RhoGDI2表达改变的活动级别RAC1,Cdc42的RhoA蛋白/C,细胞裂解液拉下分析,结合GTP的活化细胞的GTP酶的高低来衡量。
从控制GFP和RhoGDI2的沉默的细胞的细胞裂解液培养与GST融合蛋白含有的RhoGTP结合域(RBD)RhoA蛋白/C效应Rhotekin(RBDRhotekin)或Rac1/Cdc42效应PAK1(GST-PAK-RBD),或控制单独的GST-珠和进行蛋白凝胶印迹分析检测Rac1的Cdc42和RhoA蛋白/C( 图3A )进行SDS-PAGE。
不料,Rac1的GTP表达水平下降,而不是增加后击倒RhoGDI2,而GTP结合的RhoA/C或Cdc42的水平并没有改变( 图3B )。
共有Rac1的RhoA和Cdc42的表达水平没有改变之间的控制和RhoGDI2敲除细胞( 图3C )。
因此,抑制RhoGDI2表达与Rac1的活性降低而不是增加。
图3
RhoGDI2结合和调控Rac1的活性化,本地化和下游信号HeyA8细胞。
(A)HeyA8细胞裂解液孵育要么单独的GST,GST-GDI1或GST-GDI2的珠子,然后进行探测RhoA蛋白/C,蛋白质凝胶印迹分析 ...
活化的Rac1的已被证明是刺激活化的p38和JNK丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联23,因为我们发现,改变RhoGDI2抑制Rac1的活性,我们确定如果改变消旋相关的信令。
进行Western印迹分析监测水平的磷酸化和激活MKK3/MKK6,上游的p38或JNK活化剂( 图3D )。
我们发现,击倒RhoGDI2磷酸化MKK3/6,磷酸化JNK和磷酸化p38水平下降。
此活动减少是一致的RhoGDI2Rac1的活性抑制相关损失。
讨论
已经被记录在案虽然RhoGDI2表达各种人类癌症中被改变,不同的结论已与肿瘤进展和功能意义。
4 , 5RhoGDI2表达下降,晚期膀胱癌,展出的侵袭和转移的抑制活性。
, 8 , 24相比之下,RhoGDI2表达升高在胃癌中表现出肿瘤促进活动。
9日,有分析RhoGDI2蛋白在卵巢癌中的表达和没有功能的相关性的研究已经非常有限。
15 , 16 , 25 RhoGDI2的shRNA抑制在HeyA8卵巢癌细胞株的研究表明,是与抑制RhoGDI2表达的增加anchorageindependent增长,基底膜侵袭和肺殖民地转移性肿瘤的形成。
然而,我们的免疫组化分析发现,RhoGDI2明显过度表达在高档比低档卵巢癌,那RhoGDI2表达与肿瘤的组织学亚型,协会的生存和无统计学意义。
总之,我们的机理研究表明,RhoGDI2在HeyA8卵巢癌的细胞作为肿瘤抑制功能,表达RhoGDI2是在更晚期卵巢癌患者的组织中高。
改变RhoGDI2表达而言,已经发现了多种类型的癌症,包括卵巢癌。
一些研究表明,卵巢癌,RhoGDI2的过度表达与肿瘤进展相关,癌组织中的表达增加。
卵巢肿瘤细胞系的面板在我们的分析,我们发现有广泛可变的水平,具有非常高的水平,在细胞系中的一个子集。
因为我们发现Ras转化的永生化人类卵巢表面上皮细胞表达水平增加RhoGDI2,我们推测,可能RhoGDI2卵巢肿瘤细胞的生长起到积极的调解人。
因此,我们感到惊讶,当我们发现的shRNA抑制增强增长RhoGDI2的表达,侵袭和转移,过表达RhoGDI2HeyA8肿瘤细胞线。
这样,类似于膀胱癌, 7 RhoGDI2可以作为侵袭和转移抑制功能。
将需要与其它细胞系的进一步研究,以确定是否可以推广到其他的卵巢肿瘤细胞这个RhoGDI2功能。
我们分析388例卵巢肿瘤,这种癌症RhoGDI2蛋白表达代表了最全面的评价。
当我们发现RhoGDI2蛋白表达强相比,中高档卵巢癌患者组织与低档病人组织,无统计学显着的相关性被认为与整体生存。
因此,在膀胱癌和胃癌, 7日 , 9类似的分析对比,我们不能得出这样的结论RhoGDI2表达提供了一个明确的预后或卵巢癌的诊断标志物。
然而,因为有证据表明,RhoGDI2表达可影响紫杉醇和其它化疗药物的敏感性,它仍然能够,RhoGDI2表达仍然可以提供对药物的反应的标记信息,。
最知名的功能RhoGDI2RhoGTP酶功能的负调节,不像RhoGDI1,出现RhoGDI2优先调控Rac1和RhoA和Cdc42的6 RhoGTP酶的选择性与此一致,我们发现RhoGDI2Rac1的相关优先Rac1的下降,但导致的表达RhoGDI2HeyA8卵巢肿瘤细胞,持续抑制RhoA的,也不Cdc42活性,并与JNK和p38MAPK的RAC相关的信号转导通路的活性下降。
由于p38和JNK激活先前已被证明抑制卵巢癌的转移, 23这表明,减少这些消旋相关的信号转导途径的活性增强的生长性能的贫RhoGDI2HeyA8细胞。
我们的观察与制造对比度MDA-MB-231乳腺癌细胞,其中拦截RhoGDI2导致Rac1的激活,JNK及p38的激活,减少了致瘤性和转移性的增长22与此相反,在膀胱癌中的RhoGDI2功能的研究结果癌症是与我们的观察一致。
施瓦茨和他的同事们发现,RhoGDI2优先约束和Rac1的激活,和Rac1的激活拮抗转移。
24在我们的研究中,他们还报告说,是与抑制RhoGDI2表达亚细胞定位改变和减少RAC-GTP水平。
,由于RhoGDIs可以调节RhoGTP酶相互作用RhoGEFs和RhoGAPs的,也许在卵巢癌以及膀胱肿瘤细胞,可激活RhoGDI2RAC通过改变调节GDP/GTP单车的。
最后,,RAC活化可以对抗肿瘤的侵袭和转移也是与其他研究一致。
例如,被视为损失的Tiam1蛋白Rac的特定的RhoGEF,以提高皮肤癌的形成26
总之,我们的观察支持在卵巢癌的侵袭和转移抑制的作用RhoGDI2。
显然,看似对比功能的RhoGDI2报道在其他癌症揭示的RhoGDI2功能,它可以激活或灭活RAC功能差异蜂窝设置的复杂性。
在癌症的功能RhoGDI2也可能涉及独立RhoGTP酶调节的功能。
一个卵巢癌细胞系中,我们的研究的局限性之一是我们的分析机制。
显然,进一步的分析,将需要额外的卵巢癌细胞株和卵巢癌的小鼠模型的功能RhoGDI2的RhoGDI2作为诊断或治疗的用于癌症治疗的目标的意义和重要性,以更好地阐明。
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材料与方法
细胞系。
OVCAR-3,OVCAR-4,OVCAR-5,OVCAR-8和SKOV-3卵巢癌的细胞最初是从美国典型培养物保藏中心获得。
A2780卵巢癌细胞株由的T.Fojo博士癌症治疗科在NCI建立和特点。
建立和特点的HeyA8卵巢癌细胞株G.米尔斯博士在MD安德森癌症中心。
人类卵巢表面上皮细胞永生化SV40T/T抗原端粒酶催化端粒酶亚基的表达(T29),T29细胞稳定表达H-ras基因突变激活(12V)(T29H-RAS)或K-RAS(12V)(T29K表-RAS)建立和特点是我们先前所描述的参考27 。
所有细胞系获得了直接从少于6个月,建立了细胞株传代细胞库或实验室。
蛋白质表达和活化分析。
MLC和p38抗体特异性磷酸化和总JNK,MKK3/6,自CellSignaling公司获得。
ERK1/2RhoGDI1,RhoGDI2[:
LY-GDI(C20)],从圣克鲁斯生物技术和RhoA/C(119)。
Rac1的抗体州北部和Cdc42抗体购自BD转。
所有的抗体用于蛋白质凝胶印迹分析,因为我们先前在参考文献28中所描述的。
免疫组化染色进行债券Autostainer自动(徕卡Microsystems公司)。
简单地说,幻灯片脱蜡债券脱蜡解决方案和水合债券洗涤液。
抗原修复进行了30分钟,在100°C表位债券检索解决方案1,pH值6.0。
玻片温育1小时,用初级抗体(1:
700)。
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染色,脱水,封片。
20倍数字扫描彩色幻灯片使用:
,Aperio的ScanScopeCS(Aperio的技术),扫描的图像进行分析与ImageScope(Aperio的技术)为阳性细胞定量。
我们拿下了每个核心的肿瘤细胞染色强度在4点量表(0-3),1为弱阳性,3强染色。
肿瘤细胞的百分比,被污染,还注意到。
分数只算染色时是存在于肿瘤细胞,而不是背景基质。
Fisher精确检验或卡方检验,进行适当评估协会RhoGDI2表达与临床因素。
双尾p值Fisher精确检验报告。
采用Kaplan-Meier法估计概率的整体存活率。
比较“低”和“高”RhoGDI2表达式进行对数秩检验患者的总生存期。
被定义为“低”和“高”表达RhoGDI2强度*百分比≤20和强度*%>20,73和315个患者样本被发现。
结果被认为是统计学意义P<0.05。
所有的统计分析进行了使用R包( www.r-project.org )。
质粒和创造稳定的细胞系。
感染性逆转录病毒所产生的是绿色荧光蛋白(GFP;脱靶控制)或RhoGDI2序列5'-GCGAGG的CACGTACCACA-3'(指定RhoGDI2我针对的pSUPER复古普罗shRNA质粒共转染)和5'-GGCCTGAAATACGTTCAGC-3'(指定RhoGDI2二)与PCL-10A1的包装质粒。
感染性病毒的上清液用于稳定感染的HeyA8卵巢癌的细胞,其次通过选择puromycinresistant细胞,多种药物抗性集落,然后汇集起来建立质量种群的稳定感染的细胞与稳定的RhoGDI2表达抑制,验证蛋白质凝胶印迹分析。
尾静脉肺定植转移检测。
母无胸腺裸鼠(4-6周龄),通过尾静脉
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