HPLC法测定蒲黄中总黄酮的含量.docx
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HPLC法测定蒲黄中总黄酮的含量
而应是更重视传统、从实际出发。
[3]本实验分别采取多种当地药农习用采集方法及标准,比较研究各方法下采集得到的药材中绿原酸的含量变化,证明了以药材形态采收的传统采集标准的科学性。
从本实验中也可看出不同采收期的药材中绿原酸含量相差较大,足见采收方法及采收标准对药材中绿原酸的影响非常大,有时甚至成为影响药材质量的主要因素。
可见,对灰毡毛忍冬药材花不同采摘方法及标准进行深入研究,对于药材合理采收
含量的影响,、地区有限,三组样品采集地点海拔分别相差100m,但经数据统计未见显著性差异。
同样,是否熏硫和加工方法对绿原酸含量的影响也未能发现明显差异。
参考文献
[1] 国家中医药管理局.中华本草[M].上海:
上海科学技术出版社.1999.6558.
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化学工业出版社
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11213.
].若干金银花中绿原酸含量的比较研究[J].复旦大学学报(自然科学版,1987(11:
44.
收稿日期:
2006203230HPLC法测定蒲黄中总黄酮的含量
文红梅,王业盈,彭国平,李 伟
(南京中医药大学,江苏南京210029
摘要:
目的 建立蒲黄中总黄酮含量的HPLC测定法。
方法 蒲黄药材的甲醇提取物经盐酸水解后,用
HPLC法测定三种苷元,并计算出总黄酮的含量。
结果 异鼠李素、山柰酚、槲皮素均呈良好的线性关系,三
者的加样回收率分别为98.4%、102.8%、102.1%。
结论 与比色法测定结果基本一致,该法可作为蒲黄中
总黄酮含量测定的方法。
关键词:
蒲黄;总黄酮;HPLC测定法
中图分类号:
R28411 文献标识码:
A 文章编号:
100422199(20060320041204
DeterminationofFlavonesinPollentyphaebyHPLC
WENHon2mei,WANGYe2ying,PENGGuo2ping,LIWei
(NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210029,China
Abstract:
Objective ToestablishthemethodtodeterminethecontentsofflavonesinPollentyphae.Methods ThemethanolextractsofP.typhae.werehydrolyzedwithhydrogenchlorideandcontentsofflavoneswerecalculatedfromtheresultsofthreeglycosidesgeninedeterminedbyHPLC.Results Therewerehadagoodlinerrelationshipofisorhamnetin,kaempferol,andquecertinwiththeaveragerecoveryof98.4%,102.8%,102.1%,respectively.Conclusion Comparingwiththeresultofcolorimetrymethod,thismethodwassuitablefordeterminationofflavonesinPollentyphae.
Keywords:
Pollentyphae;flavones;HPLC
中药蒲黄为香蒲科植物水烛香蒲Typhaan2gustifoliaL.、东方香蒲TyphaorientalisPresl、或同属植物的干燥花粉。
夏季采收蒲棒上部的黄色雄花序,晒干后碾轧,筛取花粉。
蒲黄有止血、化瘀、通淋的功效。
用于吐血,衄血,呵血,崩漏,外伤出血,经闭通经,脘腹刺痛,跌扑肿痛,血淋涩痛[1]。
蒲黄—14—
现代中药研究与实践2006年第20卷第3期
的化学成分主要为黄酮醇类及其苷类:
如以异鼠李素为苷元的苷类有香蒲新苷、异鼠李素232O2新橙皮苷,还有以山柰酚、槲皮素等为苷元的苷类。
药理研究表明蒲黄总黄酮是蒲黄活血化淤的主要活性成分之一。
目前,蒲黄的总黄酮的测定方法主要有分光光
度测定法(显色方法主要有三氯化铝显色、非水解HPLC法。
刘斌[2]
等人就曾采用紫外可见分光光度法测蒲黄总黄酮,典》2000
HPLC测定蒲黄总黄酮的方法,定。
蒲黄在酸性条件下可水解
主要得到三种苷元,经实验研究发现水解后得到的主要苷元是异鼠李素,另外还有少量的槲皮素和山奈素。
结果表明该方法可作为蒲黄总黄酮的测定方法。
1 仪器和试剂
Waters515泵,Waters2487紫外2可见检测器,Rheodyne进样器,中科院大连化学物理所WDL295
色谱工作站。
甲醇为色谱纯(淮阴精细化工研究院所,水为亚沸蒸馏水,其余试剂均为分析纯。
2 对照品来源及纯度检查异鼠李素对照品、槲皮素对照品、山柰酚对照品,均购于中国药品生物制品检定所,为供含量测定用,经HPLC测定纯度大于98%。
蒲黄药材1#、2#购于安徽亳州药材市场,产地为山东。
蒲黄药材3#购于南京市药材公司。
经本校中药鉴定教研室吴启南教授鉴定,均符合现行药典的标准。
3 色谱条件的选择
色谱柱:
KromasilC18柱(4.6mm×250mm,5μm中科院大连化学物理所。
流动相:
采用中国药典2000年版"银杏叶"含量测定项下的流动相甲醇20.4%磷酸液(50∶50进行色谱分析,经试验研究表明,在此流动相下异鼠李素、山柰酚、槲皮素色谱峰间分离度达到1.5以上,峰形较对称,故选用流动相为甲醇20.4%磷酸液(50∶50。
测定波长:
参照药典,蒲黄的测定波长选定为360nm。
在上述条件下,样品的HPLC色谱图见图1~图4。
以异鼠李素、山柰酚、槲皮素计算柱效,几个测试的色谱峰,其理论塔板数在3000~4000。
图1 槲皮素对照品色谱图
Fig.1 HPLCChromatogramsofquecertin
图2 山柰酚对照品色谱图
Fig.2 HPLCChromatogramsofkaempferol
图3 异鼠李素对照品色谱图
Fig.3 HPLCChromatogramsofisorhamnetin
12槲皮素 22山柰素 32异鼠李素12quecertin 22kaempferol 32isorhamnetin
图4 蒲黄药材样品色谱图
Fig.4 HPLCchromatogramsofPollentyphae
4 供试品溶液的制备
取蒲黄粉末1.0g,精密称定,置250mL三角
烧瓶中,加甲醇100mL超声提取40min,放冷过
—
24—现代中药研究与实践2006年第20卷第3期
滤,取滤液,提取液蒸干,残渣加甲醇225%盐酸(4∶1混合液25mL,回流45min,放冷,转移至50mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,取适量离心。
5 线性关系的考察
分别精密称取经五氧化二磷干燥过夜的槲皮素、山柰酚、异鼠李素对照品适量,各加甲醇制成每1mL含0.04mg、0.02mg、0.1mg的溶液,作为对照品溶液。
再逐级稀释分别配成一系列对照品溶液,分别吸取上述溶液20μL,注入5μL定量管的液相色谱仪进样器,测定,以峰面积为纵坐标(Y,对照品浓度(μg/mL为横坐标(X,绘制标准曲线,,见表1。
表1槲皮素、山柰酚、
Tab11 Thelinearityrelativityofk,isorh
序号
槲皮素的标准曲线异鼠李素的标准曲线槲皮素/μg/mL/μ异鼠李素/μg/mL峰面积平均值
11.5.500×1046.652.008×1052002.1052.501.149×10513.14.174×105304.759×1055.002.326×10526.28.605×105499.524×10510.04.858×10552.51.764×106539.82.065×10620.09.672×106105.03.647×106回归方程Y=(5.298×107X+(-61028.410Y=(4.792×107X+(0.000Y=(3.505×107X+(-47889.773相关系数r=0.9996r=1.000r=0.9997
线性范围2.50~40μg/mL1.25~20μg/mL6.65~105μg/mL
6 稳定性试验
同一样品(蒲黄药材2#供试液,隔2h测一次,共测5次,测定结果见下表。
结果表明,供试液中槲皮素、山柰酚、异鼠李素在8h内稳定。
其稳定性RSD分别为2.05%、0.70%和1.49%。
结果见表2。
表2 蒲黄样品的稳定性考察结果
Tab.2 Resultsofstabilitytest
RSD/%2.050.701.49
7 精密度试验
同一供试液(蒲黄2,依法测定,连续进样5次,测定峰面积。
结果表明,供试液中槲皮素、山柰酚、异鼠李素的精密度RSD分别为1.54%、1.22%和1.10%。
结果见表3。
8 重复性试验
同一批号(蒲黄药材2#制剂,精密称取样品5份各1.0g,按“供试品溶液制备”项下操作,结果见表4。
9 回收率试验
取含量已测定的制剂(蒲黄药材2#,进行加
表3 蒲黄样品的精密度考察结果
Tab.3 Resultsofprecisiontest
表4 样品重复性考察结果
Tab.4 Resultsofrepeatabilitytest
No.
样品量
/g
现代中药研究与实践2006年第20卷第3期
果见表5。
表5 蒲黄样品的加样回收试验结果
Tab.5 Resultsofrecoverytestofisorhamnetin,kaempferol,and
quecertin
被测成分No.峰面
积样品量/mg加标量/mg实测值/mg回收率/%平均回收率/%RSD
/%异鼠李素
10.50011.4
1.7901.283.01795.83
98.4
20.49961.5431.7891.563.32598.5030.50031.6761.7911.883.61296.8440.49951.6871.7881.863.63599.3150.49882.0761.7862.684.4743060.49951.8951.80
山萘酚10.2.1674225490.97.6230.0.2090.3950104.7240.2.9720.17580.2090.3951104.9350.49883.2740.17560.2510.4353103.4760.49953.2840.17580.2510.4366103.90
槲皮素10.50011.4710.13450.08320.2207103.51102.020.49961.4430.13440.08320.216598.6330.50031.60.13460.10410.2400101.2640.49951.6150.13440.10410.2423103.6350.49881.7460.13420.1250.2619102.1860.49951.7540.13440.1250.2631102.98
12 样品测定
三批号(蒲黄药材1#、蒲黄药材2#
、蒲黄药材
3#制剂样品,如法测定。
样品测定结果见表6。
表6蒲黄药材中总黄酮的含量测定
Tab.6 Determinationoftotalflavonesofsamples
药材
No.槲皮素
含量/%
山柰酚含量/%
异鼠李素含量/%总黄酮/%
平均值
/%110.01890.02520.1720.5560.55420.01640.02490.1740.552230.02080.03310.2670.8250.82840.02070.03410.2680.8303
50.03210.02840.3140.9620.961
6
0.0316
0.0287
0.313
0.959
注:
总黄酮的含量=(槲皮素含量+山奈酚含量+异鼠李素含量×2.57.其中2.57为苷元含量转换为苷的转换系数。
13 计算公式的由来
该计算方法是参照文献[3]的计算方法。
香蒲新
苷为黄酮中的主要黄酮苷,其分子量为770,另外异鼠李素分子量为316.27,槲皮素分子量为302.2,山柰酚分子量为286.24。
以香蒲新苷为参照,转换系数为:
(770/316.27+770/302.2+770/286.24/3=2.57
2.57为苷元含量转换为苷的转换系数。
14 与比色法测定结果的比较
参照文献[2]采用比色法对三批蒲黄药材中总黄
酮类成分进行含量测定,比色法与HPLC的测定结果比较如表7。
表7比色法测定结果及与Tab. CompofeencolorimetryandHPLC
HPLC法
总黄酮/%均值/%总黄酮/%
偏差/%
11.0320.0970.5650.563
0.554
1.54
21.0190.0950.56031.0580.099
0.5632
41.0750.1470.8330.873
0.837
1.05
51.0930.1490.83161.0140.1410.846371.0130.1620.9770.97
0.961
0.97
81.0720.1690.96491.0450.166
0.971
15 讨论
15.1 曾对蒲黄样品的提取条件(超声时间、溶剂用
量进行了考察,结果表明:
以超声40min,溶剂用量为100mL为最佳。
15.2 曾对蒲黄样品的水解条件(水解时间、水解液用量进行了考察,结果表明:
以水解45min,水解液用量25mL最佳。
15.3 由于受异鼠李素在甲醇中溶解度的影响,加上样品中异鼠李素的含量较高,因此用异鼠李素的固体标准品代替异鼠李素溶液做加样回收实验。
15.4 蒲黄主要含有香蒲新苷,异鼠李素32O新橙皮苷等成分,均含有邻甲氧基苯酚的母核,能够与三氯化铝显色[2],于550nm波长下比色,可测定蒲黄中总黄酮的含量。
结果表明:
HPLC法与比色法测定结果基本一致,比色法略高于HPLC法,但偏差均小于2%。
故HPLC法可用作蒲黄中总黄酮含量测定,该方法结果可靠,具有适用性。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中国药典(一部[S]1北京:
化学工业出版
社,20001290,257.
[2] 刘 斌,石任兵,王 伟.蒲黄总黄酮含量测定方法研究[J]..
北京中医药大学学报,2001,24(4:
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41248.
—
44—现代中药研究与实践2006年第20卷第3期
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