BMP4在视网膜与视神经中的分布及对少突胶质前体细胞分化的影响.docx

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BMP4在视网膜与视神经中的分布及对少突胶质前体细胞分化的影响

BMP4在视网膜与视神经中的分布及对少突胶质前体细胞分化的影响

复旦大学硕士学位论文中文摘要

I．中文摘要

BMP．4在视网膜与视神经中的分布及对少突胶质前体细胞分化的影响

在视觉系统发育过程中，来源于脑的少突胶质前体细胞汇集于视交叉处，并继续沿着视神经向视网膜方向迁移。

这些细胞在胚胎后期至生后早期分化为少突胶质细胞，并包裹节细胞轴突形成有髓神经纤维。

然而，大多数哺乳动物的视神经纤维进入筛板后，其髓鞘即消失。

究其原因，一般认为可能与筛板处存在抑制少突胶质前体细胞迁移的特殊屏障有关，但具体机制仍有待深入研究。

目的通过研究BMP．4在视神经及视网膜中的表达情况，并通过体外实验研究Bm-4对少突胶质前体细胞分化的影响，及BMP-4与Oli92的相互关系，为视网膜及视神经乳头不形成髓鞘的机制提供实验依据，为相关髓鞘疾病的治疗

提供新的思路。

方法用免疫组织化学染色检测BMP-4在视网膜及视神经乳头中的表达及分布情况。

采用恒温振荡法和差速贴壁法分离纯化少突胶质前体细胞，并研究BMP-4对少突胶质前体细胞分化发育的影响。

用WesternBlot研究BMP-4与

Oli92的相互关系。

结果在发育阶段中，BMP-4仅选择性表达在视神经乳头处。

成功纯化少突胶质前体细胞，当将培养液中的促细胞增殖因子撤除后，少突胶质前体细胞自发向少突胶质细胞分化和成熟，而加入BMP．4后，少突胶质前体细胞的分化方向发生变化，高浓度的BMP-4使少突胶质前体细胞最终分化为II型星形胶质细胞。

随着BMP-4浓度的增高，蛋白Oli92的表达量也逐渐降低。

结论在视神经乳头处高浓度表达的BMP．4蛋白有可能作用于迁移至筛板处的少突胶质前体细胞。

BMP一4在体外可抑制少突胶质前体细胞向少突胶质细胞的分化，并促使其向星形胶质细胞分化。

通过激活少突胶质前体细胞内的相关信号途径，下调少突胶质前体细胞内Oli92蛋白的表达水平，从而抑制少突胶质

复旦大学硕士学位论文中文摘要

前体细胞向少突胶质细胞方向分化，并促进其向星形胶质细胞方向分化。

关键词BMP一4；少突胶质前体细胞；Oli92；视神经乳头；筛板；无髓鞘

形成

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复旦大学硕士学位论文英文摘要

ThedistributionofBMP--4inratretinaandoptic

nerveanditseffectsonthedifferentiationof

oligodendrocyteprecursorsAbstract

Duingvisualsystemdevelopment，oligodendrocyteprecursorsoriginatedfrombraintogetherinopticchiasmandmigratealongtheopticnel'vetowardstheretinabeforedifferentiatingintooligodendroeytesandmyelinatingtheaxonsoftheretinalganglioncellsfromlateemb巧omctoearlypostnatalperiods．However,inmany

mammalianspecies，myelinationoftheretinalganglioncellaxonsstopsatthelaminaeribrosa．Toexplainthepattemofmyelinationintheopticsystemofmanymammals，aspecializedregionexistedinlaminacribrosawhichblocksthemigrationintotheretinaofoligodendrocyteprecursorsisgenerallyrelated．Butitsmechanismneedsfurtherinvestigation．

obiectiveByresearchingtheexpressionofBMP-4inopticnerveandretina,theeffectsofBMP-4tothedifferentiationofoligodendrocytepmcursomandtheinterrelaionshipbetweenBMP-4andOli92，wewouldprovideexperimentalevidencestothelackofmyelininretinaandopticnerveheadandnewideastothempyofrelatedmyelindiseases．

MethodsTodefineinmoredetailthespatialandtemporaldistributionofBMP-4inretinaandopticnerve，frozensectionsofopticnerveandretinawherelabeled、析mantibodiestoBMP-4．Usingthemodifiedmixedglialcultureanddifferent—attachmentmethod，weharvestedoligodendrocyteprecursorsandresearchedthetheinductionofBMP-4tothedifferentiationofoligodendrocyteprecursors．we

alsoresearchedtherelationshipbetweenBMP一4andOli92bywesternblot．

ResultsStrongexpressionofBMP-4wasdetectedintheregionoftheoptic

。

nervehead．TheculturedoligodendrocyteprecursorsautomaticallydifferentiatedintomatureoligodendroeytesafterPDGFandbFGFwithdrawn．Exposedtohi【gllconcentrationofBMP-4couldpromotethedifferentiationoftype2astrocytes．With

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复旦大学硕士学位论文英文摘要

thegraduallyincreasedconcentrationofBMP-4，theexpressionofOli92decreased．ConclusionTheexpressionofBMP一4intheopticnerveheadinhibitthe

differentiationintooligodendroeytesofoligodendrocyteprecursorsthatsucceedinmigratingthroughthelaminacribrosaattheopticnerve／retinajunctiontherebyensuringalackofretinalmyelination．Invitroexperiment，BMP-4suppressoligodendrocyteprecursorsdifferentiationintooligodendrocyteandpromotethe

astroglialdifferentiation．Andthiseffectcouldbecompletedbyactivatingsome

relatedsignalpathwayanddownregulatingtheexpressionoli92．

KeywordsBMP4；oligodendrocyteprecursors；Oli92；opticnervehead；

laminacribrosa；amyelination

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复旦大学硕士学位论文英文缩略词表

英文缩略词表（Abbreviation）

AIMAstroglia-inducingmolecule星形胶质诱导分子

bFGFBasicfibroblastgrowthfactor碱性成纤维细胞生长因子

BMPsBonemorphogeneticproteins骨形态发生蛋白

CNTFCiliaryneurotrophicfactor睫状神经营养因子

DAB3．3．diaminobenzidine3．3．二氨基联苯胺DMEM／F12Dulbeeeo’sModifiedEagleMedium／F12杜氏改良F一12培养基FBSFetalbovineserum胎牛血清

GCGalactocerebroside半乳糖脑苷脂

GDNFGlial—derivedneurotrophicfactor胶质源性神经营养因子GFAPGlialfibrillaryacidicprotein胶质原纤维酸性蛋白ID4InhibitorofDNAbindingDNA结合抑制因子4

IGF··1Insulin·-likegrowthfactor-1胰岛素样生长因子．1

LIFLeukemiainhibitoryfactor白血病抑制因子

MBPMyelinbasicprotein髓磷脂相关糖蛋白

NGFNeurongrowthfactor神经生长因子

OLOligodendrocyte少突胶质细胞OPCsOligodendrocyteprecursorcells少突胶质前体细胞P300Transcriptionalcoactivator转录共激活因子

PDGFPlatelet-derivedgrowthfactor血小板源性生长因子

PLLPoly-L-lysine多聚赖氨酸

PSA-NCAMPolysialicacidneuralcelladhesion多唾液酸．神经粘附分子

molecule

SHHSonichedgehog音猥因子

STATSingaltransducerandactivatorof信号转导物和转录激活剂

transcription

T1AType1astrocyteI型星形胶质细胞

T2AType2astrocyteII型星形胶质细胞

1

复旦大学硕士学位论文英文缩略词表

TGF-BTransforminggrowthfactor-[I转化生长因子-B

THThroidhormone甲状腺激素

Trysin-EDTATrysin—ethylenediaminotetraaceticacid胰蛋白酶一EDTA消化液

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III．前言

少突胶质细胞（OligodendrocyteOL）具有形成中枢有髓神经纤维髓鞘的功能I¨。

在视觉系统发育过程中，视神经中的少突胶质前体细胞（OligodendrocyteprecursorcellsOPCs）起源于第三脑室底板[21，汇集于视交叉处并沿着视神经向视网膜方向迁移，在胚胎后期和生后早期分化为少突胶质细胞并形成髓鞘【3】。

大多数哺乳动物的视神经髓鞘止于视神经筛板处，筛板以前的球内段视神经纤维没有髓鞘包裹，这在视觉发育中具有重要的意义14]。

视网膜上的光感受细胞

感受光信号并将光信号转换为神经冲动，神经冲动沿视神经传递至视觉中枢。

若筛板以前的球内段视神经纤维有髓鞘包裹的，则使视网膜透明度下降，从而对视力造成影响。

据Straatsma和Funnell等报导，约有l％的人口患有球内段视神经纤维髓鞘形成的疾病，其视神经髓鞘超过筛板水平，到达视网膜甚至更远端的眼底，形成乳白色的有髓鞘包裹的视神经纤维，对视力发育造成严重影响15，61。

目前，对于视网膜及球内段视神经纤维无髓鞘成因提出了多种观点。

其一，是认为球内段视神经纤维的髓鞘形成能力低于视神经其它区段，导致球内段视神经纤维无髓鞘形成。

然而，Ffrench．Constant的研究表明，在体外混合培养的大鼠视网膜细胞中，没有检测到少突胶质细胞及其前体细胞的存在，并提出少突胶

质前体细胞无法迁移进入视网膜内，是球内段视神经纤维无髓鞘包裹的原因【7J。

此外，Perry和Laeng等向幼年大鼠视网膜内移植少突胶质前体细胞后，少突胶

质前体细胞可在视网膜内分化为成熟少突胶质细胞并形成具有正常结构的髓鞘

【4，8】。

进一步证实了视网膜神经纤维层轴突具有形成结构正常髓鞘的潜能，并推翻了节细胞轴突在视神经和视网膜上成髓鞘潜能不同这一假设，同时也证明了轴突本身对髓鞘的形成和差异性分布没有影响。

Berliner则提出少突胶质细胞在视

神经上的差异性分布是由于筛板处存在的特殊屏障所导致的假设，认为该屏障能阻止少突胶质前体细胞迁移进入视网膜，从而抑制筛板处的髓鞘形成。

Small和Berliner等发现在兔子和鸟类的视网膜的神经节细胞轴突有髓鞘包裹，同时缺

乏筛板样结构，从而支持少突胶质前体细胞未能进入视网膜是由筛板处存在屏障

所导致这一假设13’引。

目前，该假设得到了一系列研究的支持。

Garcion和Morcos

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等发现Tenascin．C为星形胶质细胞来源的细胞外基质分子，能够抑制OPCs的迁移，在视神经头上高浓度表达，从而阻止OPCs进入球内段视神经纤维，抑制球内段视神经纤维的髓鞘形成‘10,11,12,13】。

Netrin．1在视神经头处高表达【14，151，对OPCs起着化学排斥作用，从而抑制OPCs的迁移【16J。

这些信号分子有一部分是由星形胶质细胞分泌的，这提示筛板处存在的特殊屏障是由细胞一分子组成的动态网络构成的，共同阻止OPCs迁移进入筛板处。

然而，目前尚无直接的体内实验来解释OPts不能迁移进入视神经筛板处的原因。

并且，筛板处特殊屏障对OPCs迁

移阻止的效率目前尚也不明确。

骨形态发生蛋白（BoneMorphogenetieProteinsBMPs）为转化生长因子13（Transforminggrowthfaetor-IBTGF-p）超家族的成员，广泛表达于胚胎发育过程中【171。

在神经系统的不同发育阶段，BMPs参与决定细胞命运、细胞增殖和细

胞分化等多个方面的调控【18】。

Schluesener等发现BMP-4和BMP．6广泛表达于啮齿类动物早期胚胎脑中[t91，若BMP2和BMP4缺失，则会发生胚胎早期致死现纠201。

此外，在发育中枢神经系统的脊髓区域，BMPs表达于脊髓背侧并调控背部细胞的分化【211。

最初OPCs起源于发育中枢神经的脊髓腹侧区域，并受腹侧调

控因子如音猥因子（SonichedgehogShh）和背侧调控因子如BMPs的双重调控作用瞄l。

OPCs属于双潜能干细胞，具有向少突胶质细胞和II型星形胶质细胞（Type2astrocyteT2A）分化的双向潜能。

在发育过程中，位于第三脑室底板区的OPCs迁移至视交叉，沿视神经向视网膜方向迁移，并分化为少突胶质细胞形成髓鞘pJ。

然而，BMPs并不局限分布于发育中枢神经系统的脊髓背侧区域，其在视觉系统的发育分化中亦起着重要的调控作用。

BMPs可诱导晶状体的发生【231，促进视网膜的分化[241，影响睫状体的形成【251。

FurutaY等发现在胚胎小鼠晶状体和视神经乳头的分化形成中，BMP．4起着重要的调控作用【2州。

ChangB等提出BMP．4在眼的发育中起重要作用，缺失BMP-4小鼠的眼前节和眼后节发育不全，导致眼压增高拉¨。

本课题将以在视觉发育中具有重要作用的调控蛋白BMP．4为研究对象，对

BMP-4在视神经上的表达情况及BMP-4对OPCs分化的作用途径进行研究，来

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复旦大学硕士学位论文

探讨筛板局部的BMP-4抑制OPCs向少突胶质细胞的分化，并促使其向星形胶质细胞分化的特性，在体外模拟了BMP-4对视神经上OPCs分化的影响，并初步验证筛板处OPCs向OL方向分化受到抑制的设想，为视网膜及视神经乳头不形成髓鞘的机制提供实验依据，为相关髓鞘疾病的治疗提供新的思路。

复旦大学硕士学位论文材料与方法

IV．材料与方法

一、实验动物

实验用新生Sprague—Dawley（S-D）大鼠，由复旦大学上海医学院实验动物中心

提供。

二、主要试剂

N2（Gibieo）PLL（Sigma）

DAPI（Sigma）bFGF（Invitrogen）PDGF．AA（R&D）

BMP4（Peprotech）

FBS（Hyelone公司）DMEM／F一12（Gibieo）

Trysin-EDTA（Sigma）

MousemonoclonalBMP-4（Chemieon）

RabbitpolyclonalOli92（Millipore）MousemonoclonalA285（R&D）

MousemonoelonalGFAP（Sigma）

RabbitpolyclonalGC（Chemicon）FITC．1abeledantibodiestomouseIgM（Sigma）

FITC．1abeledantibodiestomouseIgG（Sigma）FITC．1abeledantibodiestorabbitIgG（Sigma）

AlexaFluor488goatanti—mouseIgG2b（Y2b）（MolecularProbes）

HRP标记的羊抗小鼠IgG（博士德）13-actin抗体（碧云天）HRP标记的羊抗兔IgG（博士德）DAPI（Sigma）ECL发光剂（碧云天）BCA蛋白定量测定试剂盒（碧云天）

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复旦大学硕士学位论文材料与方法

PVDF膜（上海生工）

DTT（上海华美）

三、主要实验器材和仪器CMl900冰冻切片机（Leica）IX7倒置1荧光显微镜（Olympus）DP70数码照像机（Olympus）

解剖显微镜（Nikon）

低温高速离心机（ThermoIEC）水平离心机（Eppendorf）稳压电泳仪（FR-250，复日科技）

生物电泳图像分析系统（FR．200，复日科技）垂直电泳槽，转膜电泳仪（BIO．RADMiniprotein）分光光度计（Gene）

脱色摇床（DTD．1型）

空气恒温振荡器（Hz-961Ik）电热恒温水浴箱（上海医疗器械七厂）C02恒温培养箱（PrecisionScientific）培养瓶、培养板、培养皿、6孔板（Corining）超净工作台（上海汇龙仪表电子有限责任公司）

四、研究内容与方法，

（一）BMP-4在视网膜与视神经中的表达及分布研究免疫荧光组织化学染色法

（1）将SD大鼠（P7）断头，迅速摘除带有视神经的眼球，放入OCT包埋液

中，然后迅速将其放入液氮罐中3rain；用恒低温冰冻切片机切片，厚度为14“m；切片贴于预先涂有多聚赖氨酸的玻片上，在室温下干燥2h。

（2）切片入4"C丙酮中10min，晾干；将切片浸入0．01tool／LPBS清洗5rainx3。

（3）置于0．3％Triton．100溶液中，室温下破膜10min；浸入0．01mol／LPBS

清洗5minx3。

（4）用10％羊血清室温下封闭lh，弃去正常羊血清。

复旦大学硕士学位论文材料与方法

（5）滴加一抗于4℃孵育过夜，一抗为小鼠抗BMP-4单克隆抗体IgG（1：

10

Chemieon）；0．01tool／LPBS洗5minx3。

（6）滴加AlexaFluor488二抗羊抗小IgG2b（1：

500MolecularProbes），

室温下避光孵育1h，0．01mol／LPBS清洗5minx3。

（7）滴]JI]DAPI（1：

5000Sigma）衬染核，避光孵育5mira浸入0．01mol／L

PBS清洗5minx3。

（8）磷酸甘油封片，荧光显微镜下观察，拍照记录。

阴性对照采用0．01mol／LPBS代替一抗。

（二）BMP．4对体外培养OPCs分化的影响

1．OPCs的分离纯化与培养

（1）取材：

取新生（P0．P1）SD大鼠，置于．20℃冰箱内低温麻醉5min，剪断颈总动脉放血，以尽量减少血细胞污染。

将新生大鼠浸入75％乙醇中消毒后断头，在无菌条件下浸于D．Hanks液中，剪开头部皮肤与颅骨，取出脑组织，切除脑干及小脑，在解剖显微镜下仔细剥除脑膜和血管，分离双侧大脑皮层。

（2）获取单细胞悬液：

将分离的大脑皮层组织放入D．Hanks液中清洗2次后，浸入一定体积的0．25％Trysin—EDTA（Sigma）中消化，在37*（2水浴箱内放置10．15min，加入等体积含血清的培养液终止消化，用火焰抛光的巴斯德吸管吹打制成单细胞悬液，以120目筛网（孔径约70pxn）过滤细胞悬液，离心（1400rpm，5mill），用完全培养液（90％DMEM／F12（1：

1）和10％胎牛血清，2mmol／L谷氨酰胺，青霉素100U／ml，链霉素100gg／m1）将沉淀重悬，进行细胞计数。

（3）接种与培养：

调整细胞密度，以1x106／em2细胞密度接种于预先涂有Poly-L—Lysine（O．1mg／m1）（Sigma）的75cm2培养瓶中，置于37"（2，5％C02培养箱（PrecisionScientific）中培养，每隔2．3天换液1次，培养至9．1ld时，进行

OPCs的分离纯化。

（4）OPCs的震荡分离：

将上述原代培养的混合胶质细胞在37℃空气恒温振

荡器（Hz．961lk）上振荡（200rpm，lh），使混合培养胶质细胞上层的小胶质细胞脱壁。

吸出培养液液，用D．Hanks液洗2次后，加入新鲜的完全培养液，在37"C，5％C02培养箱中孵育2h，再在37℃空气恒温振荡器上继续振荡（250rpm，

18．20h）。

复旦大学硕士学位论文材料与方法

（5）OPCs的纯化培养：

吸出振荡后的细胞上清液，置于未经过处理的10cm皮氏培养皿中，在37"C，5％C02培养箱中孵育30．60min后吸出细胞悬液，促使混杂的小胶质细胞和星形胶质细胞贴壁。

将细胞悬液收集入10ml离心管，离心（1400rp