构建点突变质粒步骤.docx
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构建点突变质粒步骤.docx
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构建点突变质粒步骤
构建点突变质粒步骤
基因定点突变
一、定点突变的目的
把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理
通过设计引物,并利用PCR将模板扩增出来,然后去掉模板,剩下来的就是我们的PCR产物,在PCR产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆,再测序确定就行了。
三、引物设计原则
引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则:
(1)通常引物长度为25~45bp,我们建议引物长度为30~35bp。
一般都是以要突变的碱基为中心,加上两边的一段序列,两边长度至少为11-12bp。
若两边引物太短了,很可能会造成突变实验失败,因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上,而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上,所以两边最好各设至少12个bp,并且合成多一条反向互补的引物。
(2)如果设定的引物长度为30bp,接下来需要计算引物的Tm值,看是否达到78℃(GC含量应大于40%)。
(3)如果Tm值低于78℃,则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃(GC含量应大于40%)。
(4)设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
(5)最好使用经过纯化的引物。
Tm值计算公式:
Tm=0.41×(%ofGC)–675/L+81.5
注:
L:
引物碱基数;%ofGC:
引物GC含量。
四、引物设计实例
以GCG→ACG为例:
5’-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3’
(1)首先设计30bp长的上下游引物,并将A(T)设计在引物的中央位置。
Primer#1:
5’-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’
Primer#2:
5’-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3’
(2)引物GC含量为40%,L为30,将这两个数值带入Tm值计算公式,得到其Tm=75.5(Tm=0.41×40-675/30+81.5)。
通过计算可以看出其Tm低于78℃,这样的引物是不合适的,所以必须调整引物长度。
(3)重新调整引物长度。
Primer#1:
5’-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3’
Primer#2:
5’-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3’
在引物两端加5mer(斜体下划线处),这样引物的GC含量为45.7%,L值为35,将这两个数值带入Tm值计算公式,得到其Tm为80.952(Tm=0.41×47.5-675/35+81.5),这样的引物就可以用于突变实验了。
五、突变所用聚合酶及Buffer
引物和质粒都准备好后,当然就是做PCR喽,不过对于PCR的酶和buffer,不能用平时的,我们做PCR把整个质粒扩出来,延伸长度达到几个K,所以要用那些GCbuffer或扩增长片段的buffer,另外,要用保真性能较好的PFU酶来扩增,防止引进新的突变。
除了使用基因定点突变试剂盒,如Stratagene和塞百盛的试剂盒,但价格昂贵。
可以使用高保真的聚合酶,如博大泰克的金牌快速taq酶、Takara的PrimeSTARTMHSDNApolymerase。
六、如何去掉PCR产物
最简单的方法就是用DpnI酶,DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切,我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒,从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来(除非你用的是甲基化缺陷型的菌株),而PCR产物都是没有甲基化的,所以DpnI酶能够特异性地切割模板(质粒)而不会影响PCR产物,从而去掉模板留下PCR产物,所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。
DpnI处理的时间最好长一点,最少一个小时吧,最好能有两三个小时,因为如果模板处理得不干净,哪怕只有那么一点点,模板直接在平板上长出来,就会导致实验失败。
七、如何拿到质粒
直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了,然后再筛选出阳性克隆,并提出质粒,拿去测序,验证突变结果。
八、图示
九、定点突变操作步骤
[A]诱导突变基因(PCR反应)以待突变的质粒为模板,用设计的引物及Muta-direct™酶进行PCR扩增反应,诱导目的基因突变。
1.设计点突变引物。
[注]参考引物设计指导
2.准备模板质粒DNA
[注]用dam+型菌株(例如DH5α菌株)作为宿主菌。
在end+型菌株中常有克隆数低的现象,但是对突变效率没有影响。
提取质粒DNA时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒。
3.[选项]对照反应体系(50μl反应体系)
10×ReactionBuffer
5μl
pUC18controlplasmid(10ng/μl,total20ng)
2μl
Controlprimermix(20pmol/μl)
2μl
dNTPmixture(each2.5mM)
2μl
dH2O
38μl
Muta-direct™Enzyme
1μl
4.样品反应体系(50μl反应体系)
10×ReactionBuffer
5μl
Sampleplasmid(10ng/μl,total20ng)
2μl
Sampleprimer(F)(10pmol/μl)
1μl
Sampleprimer(R)(10pmol/μl)
1μl
dNTPmixture(each2.5mM)
2μl
dH2O
38μl
Muta-direct™Enzyme
1μl
5.PCR反应条件
[注]按如下参数设置PCR扩增条件。
Cycles
Temperature
ReactionTime
1cycle
95℃
30sec
15cycle
95℃
30sec
55℃
1min
72℃
1minperplasmidKb
6.PCR扩增反应完成后冰育5分钟,然后置于室温(避免反复冻融)。
[注]按下列提供的PCR条件进行扩增,控制PCR循环数。
注意当突变点位点超过4个时会发生突变率降低的现象。
Mutation
Cycles
1~2Nucleotide
15cycles
3Nucleotides
18cycles
[B]突变质粒选择
PCR反应结束后使用Mutazyme™酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA。
1.准备PCR反应产物
2.加入1μl(10U/μl)Mutazyme™酶37℃温育1小时。
[注]当质粒DNA用量过多时Mutazyme™酶可能发生与样品反应不完全的现象。
因此我们建议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作。
如果突变率低,可以适当延长反应时间或增加Mutazyme™酶用量。
[C]转化
反应完毕后在质粒DNA上会产生缺口,当把这个质粒DNA转入E.coli中时请选择dam+型菌株,例如DH5α。
1.将10μl样品加到50μl感受态细胞里,然后放置在冰上30分钟。
2.接下来可以参照一般的转化步骤进行。
序列分析
通常当LB平板上出白色菌落则表明发生了突变。
为了证实这一结果,我们建议对白色单菌落进行测序分析。
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