药学 柴胡疏肝散对四氯化碳所致急性肝损伤保护作用的研究.docx
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药学柴胡疏肝散对四氯化碳所致急性肝损伤保护作用的研究
NO.
论文题目:
柴胡疏肝散对四氯化碳所致急性肝损伤保护作用的研究
二
中文摘要……………………………………………………1
英文摘要……………………………………………………2
研究论文……………………………………………………3引言……………………………………………………3
材料与方法……………………………………………........4
结果………………………………………………........7
讨论……………………………………………………8
结论…………………………………………………....9
参考文献................................................................................10
附图………………………………………………........11
综述…………………………...………………………12
致谢……………………………………………………17
个人简历……………………………………………………18
柴胡疏肝散对四氯化碳所致急性肝损伤保护作用的研究
摘要
目的:
观察柴胡疏肝散(CSGS)对四氯化碳(CCl4)引起的小鼠急性肝损伤的保护作用。
方法:
将小鼠分为正常组,模型组,给药组,采用四氯化碳建立损伤模型,给药组采用柴胡疏肝散(CSGS)进行给药干预,计算肝脏指数并观察肝组织HE染色结果。
结果:
与正常组比较,四氯化碳组的肝组织HE染色切片的病理变化说明模型制作成功。
与四氯化碳组比较,给药组的肝组织染色切片表明给药组小鼠肝损伤情况减轻。
结论:
柴胡疏肝散对四氯化碳所致的急性肝损伤有显著的保护作用。
关键词:
四氯化碳;急性肝损伤;柴胡疏肝散
STUDYONTHEPROTEEFFECTOFCHAIHUSHUGANSANONACUTELIVERINJURYINDUCEDBYCARBONTETRACHLORIDE
y
Abstract
Objective:
StudyofChaihuShuGanSan(CSGS)onacuteliverinjuryinducedbycarbontetrachloride(CCl4).Methods:
Themiceweredividedintofourgroups:
normol,model,anddruggroups.Bygivingcarbontetrachloridecausesacuteliverinjurymodelinmice,thedruggroupwaspretratedbyCSGS.Afterthemiceweresacrificed,thehepaticindiceswerecaclulated,histopathologicalchangesoflivertissueslicesstainedbyHEstainingwereobservedunderlightmicroscope.Results:
Comparedtonormolgroup,thehistopathologicalchangesoflivertissueslicesstainedbyHEstainingofthecarbontetrachloridegrouphaveshowedthemodelwasmadesuccessfully.Conclusion:
ChaihuShuGanSanactonacuteliverinjuryinducedbycarbontetrachloridehavepreventiveandtherapeuticeffectsofobviousdamage.
Keywords:
Carbontetrachloride;Acuteliverinjury:
ChaihuShuGanSan
柴胡疏肝散对四氯化碳所致急性肝损伤保护作用的研究
引言
柴胡疏肝散是中医临床常用的方剂之一,始载于《景岳全书》具有疏肝解郁、行气止痛之功效,主要用于治疗肝气郁滞证【1】。
柴胡疏肝散组成药物种类与计量不确定,临床上通常根据病情的实际情况进行加减化裁。
柴胡疏肝散用于治疗肝郁气滞证往往有着显著的效果。
现代药理学研究证实柴胡疏肝散对大鼠急性肝损伤具有显著的防治作用,防治大鼠肝损伤的机制,可能与该方能清除自由基、保护肝细胞膜、减少酶的释放,且能抑制脂质过氧化反应等作用有关【2】。
近年来研究还表明柴胡疏肝散对实验性大鼠肝郁证有明显的对抗作用【3】。
柴胡疏肝散临床加减可用于治疗慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎、睡眠障碍等多种疾病【4】。
而且柴胡疏肝散具有明显的抗肝纤维化作用【5】,故本次试验研究了该方的抗肝损伤作用。
本课题采用四氯化碳制造小鼠急性肝损伤模型,然后对肝组织进行石蜡切片作HE染色观察柴胡舒肝散对四氯化碳造成急性肝损伤的作用情况。
材料与方法
1.仪器、试药及动物
EG1150C冷台(徕卡显微系统上海有限公司),EG1150H石蜡包埋机(徕卡显微系统上海有限公司),组织脱水机(徕卡显微系统上海有限公司),RM2245切片机(徕卡显微系统上海有限公司),KDP摊片机(金华市科迪仪器设备有限公司),DHG9140AS电热恒温鼓风干燥箱(宁波江南仪器厂)。
无水乙醇(天津市风船化学试剂有限公司)、多聚甲醛、NaCl、Na2HPO4、KH2PO4、中性树胶、苏木精及伊红染色液以上试剂均为分析纯。
柴胡疏肝散(购于河北北方学院校医院)。
雌性小鼠(30g左右),由河北北方学院动物中心提供。
2.实验方法
2.1溶液配制
PBS的配制
取NaCl8g,Na2HPO4·12H2O1.536g,和KH2PO42g,KCL2g。
将上述溶质加入到900ml双蒸水中搅拌加速溶解,待完全溶解定后容到1000ml,调整其PH为7.4,4℃保存备用。
4%多聚甲醛的配制
取20g多聚甲醛加入到400ml1×PBS液中,在恒温40℃情况下搅拌加速溶解,待完全溶解后定容到500ml,4℃保存定容备用。
柴胡疏肝散浓缩液的制备
取陈皮(醋炒)6g,柴胡6g,川芎5g,香附5g,枳壳(麸炒)5g,白芍5g,甘草3g,放于烧杯中浸渍30min,加双蒸水500ml,加热至沸腾后再煎煮40min取煎出液抽滤3次,取滤出液250ml浓缩至100ml,放凉后4℃保存备用。
四氯化碳稀释液的制备
取四氯化碳溶液5ul,加入到1ml食用植物油中充分混匀,得到浓度为0.5%的四氯化碳稀释液,常温保存备用。
2.2实验分组
昆明种小鼠15只,体重30±5g。
将小鼠随机分为3组:
正常组(CON)5只、四氯化碳组(CCl4)5只、四氯化碳+柴胡疏肝散组(CCl4+CSGS)5只。
2.3小鼠急性肝损伤模型的制备【6】
四氯化碳组小鼠上午以0.05ml/10g灌胃生理盐水,经过12h后再以0.05ml/10g灌胃给药四氯化碳(0.5%)稀释液,每天1次,持续给药5天。
四氯化碳+柴胡疏肝散组小鼠上午以0.05ml/10g灌胃给药CSGS,经过12h后再以0.05ml/10g灌胃给药四氯化碳稀释液,每天1次,持续给药5天。
正常组小鼠上午以0.05ml/10g灌胃给药生理盐水,经过12h后再以0.05ml/10g灌胃给药生理盐水,每天1次,持续给药5天。
2.4干比重的计算
所有小鼠在最后一次给药12h后处死,迅速取出肝脏,于生理盐水漂洗,除去血液,滤纸拭干,称定质量并计算干重比。
干重比=肝脏质量/体质量
2.5肝脏组织石蜡切片制备及HE染色
2.5.1肝组织石蜡切片制备
各组小鼠造模成功后处死,取适量肝组织用冷生理盐水洗净后放于包埋盒中在4%多聚甲醛溶液中浸泡固定24h,取出包埋盒放于组织脱水机中用80%乙醇、85%乙醇、90%乙醇、95%乙醇以及100%乙醇I、100%乙醇Ⅱ分别脱水1h;二甲苯I、二甲苯Ⅱ分别透明30min,将脱好水的组织用石蜡包埋机进行包埋。
用石蜡切片机进行切片(6um),之后将制好的切片放入恒温干燥箱中进行烤片2h。
2.5.2肝组织HE染色
一、脱蜡
二甲苯Ⅰ5-10min
二甲苯Ⅱ5-10min
二、分化
100%乙醇3-5min
95%乙醇3-5min
90%乙醇3-5min
80%乙醇3-5min
自开水冲洗1-3min
直来水冲洗1-3min
三、染色
苏木素染色5-8min
自来水冲洗5-10s
盐酸乙醇分化2-5s
自来水冲洗20-30s
反蓝液20-40s
自来水冲洗30-60s
伊红染色3-5min
自来水冲洗1-5s
80%乙醇10-20s
90%乙醇10-20s
95%乙醇Ⅰ1-2min
95%乙醇Ⅱ1-2min
100%乙醇Ⅰ2-3min
100%乙醇Ⅱ2-3min
二甲苯Ⅰ2-3min
二甲苯Ⅱ2-3min
二甲苯Ⅲ2-3min
四、封片
用中性树脂封片
五、将染好色的切片置于光学显微镜下观察。
结果
1、干比重结果
见附表。
实验结果显示,各组小鼠体质量并无显著差异,CCl4模型组较正常组干重比显著增加,表明CCl4能够引起小鼠肝脏明显肿大。
与四氯化碳模型组比较,四氯化碳+柴胡疏肝散组的干重比显著降低,且各给药组干重比与正常组比较无显著差异。
2、HE染色结果
各组小鼠肝组织HE染色,光镜下观察,见附图。
正常组小鼠的肝组织中肝细胞核大小基本相同,排列规则,肝小叶清晰,细胞形态正常
模型组(CCl4损伤组)肝小叶破坏,细胞发生变形且边界不清,核大小不等以及排列极不规则,细胞索解离,可见较多的点状、片状坏死灶,且大多分布于肝血窦周围。
伴有淋巴细胞、单核细胞广泛浸润排列紊乱。
四氯化碳+柴胡疏肝散组小鼠肝细胞与四氯化碳组相比,肝小叶结构基本完整,细胞排列状况有明显的改善,特别是肝血窦周围,肝细胞的肿胀与坏死状况明显减轻,有少量的炎症细胞浸润,提示柴胡疏肝散能够使小鼠的急肝损伤起到一定的保护作用。
讨论
近年来,关于药物性肝损伤的研究日趋深入。
肝损伤研究常用的动物模型大致可以分为三类,即化学性肝损伤模型(四氯化碳肝性损伤、D-氨基半乳糖性肝损伤和醋氨酚性肝损伤)、免疫性肝损伤模型(卡介菌加脂多糖诱导法、丙酸杆菌加脂多糖诱导法、刀豆蛋白A诱导法)和酒精性肝损伤模型(白酒或乙醇灌胃法【7】。
实验证明以0.5%四氯化碳油溶液建立损伤模型损伤效果最好。
本实验以四氯化碳建立小鼠肝损伤模型,观察柴胡疏肝散对急性肝损伤的作用,以期找到对急性肝损伤有治疗作用的药物。
由肝组织HE染色切片图可知四氯化碳肝细胞形态与正常组比较,形态紊乱、数量减少,提示肝细胞以得到严重损伤。
四氯化碳+柴胡疏肝散组细胞形态与四氯化碳组比较,形态的稳定性有了明显的改善,细胞数目增多,提示柴胡疏肝散有保护肝细胞的作用。
本次实验采用柴胡疏肝散与四氯化碳在同一天内给予,给药间隔不大,对于柴胡疏肝散的提前给予是否更具疗效未做证实,今后可试将柴胡疏肝散提前给药以求尽可能的减少四氯化碳对肝脏造成的损伤。
柴胡疏肝散中的柴胡能疏肝气、养肝阴,具有抗脂质过氧化作用,对保护肝细胞和恢复肝脏的某些功能有一定的保护作用,白芍养阴柔肝,对自由基有清除作用【8】。
药物造成的肝损伤发病机制涉及细胞器损伤、细胞凋亡、细胞坏死、离子平衡破坏及一系列免疫反应激活过程,各种机制不是独立存在的,相互之间有着密切的联系【9】。
在未来的研究中,需要对柴胡疏肝散肝保护作用的机制作进一步的研究
结论
本实验结果表明,柴胡疏肝散(CSGS)对四氯化碳所致小鼠的急性肝损伤有一定的保护作用。
参考文献
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附图
图1各组小鼠肝脏HE染色结果。
CON为正常对照组,CCl4为肝损伤模型组,CCl4+CSGS为肝损伤加柴胡疏肝散组。
附表
组别
肝脏指数/%
体质量/g
正常组
3.72+0.05
24.69
模型组
4.19+0.05
24.53
给药组
3.88+0.05
23.84
综述
肝损伤治疗药物的研究进展
【摘要】:
肝脏疾病有一个共有的特点,那就是肝损伤,肝病治疗过程中的重要部分就是肝损伤的治疗。
近年来有关
治疗的研究越来越多,成为肝病治疗的重要关注点。
本文从
微量元素等几方面简单概括了
药的
分析肝损伤治疗的
,
。
肝损伤治疗
十分广大,值得进一步探讨与研究。
【关键词】:
1.中药类
1.1糖类
研究发现,黄芪多糖是黄芪的有效成分之一,具有抗氧化作用,可提升SOD水平,减轻四氯化碳所导致的小鼠急性肝损伤[1]。
此外,丹参多糖能明显降低ALT、AST、TNF-α、NO及IL-1β的水平,对急性免疫肝损伤具有保护的效果[2]。
仙人掌多糖,蒲公英多糖同半枝莲多糖[3]一样,可使ALT、AST活性降低,使MDA含量降低,对四氯化碳引起的肝损伤具有保护作用。
1.2黄酮类化合物
研究表明,不同剂量的鸡血藤总黄酮能够不同程度地抑制肝系数和转氨酶的升高及SOD,GSH-Px活性的降低和MDA含量的升高,且能使小鼠肝组织的损伤程度得到改善,对肝脏细胞受到伤害的小鼠具有修复作用[4]。
曲克芦丁具有较好的消除自由基,减轻自由基对肝细胞的损害。
对由化学物质因素所造成的肝细胞受损有非常好的保护和修复作用[5]。
另外,木棉花总黄酮对免疫性肝损伤有较好的保护作用[6],泡桐花总黄酮[7],蜂胶黄酮[8]等也有较好的保肝作用。
1.3苷类
近年来大量研究表明白芍总苷很好的抗氧化作用和免疫调节作用,能明显降低肝损伤小鼠血清中ALT、AST、MDA水平,使过低的SOD、GSH-Px活性恢复正常,还能使得血清中NO水平和TNF-α水平显著降低,对肝损伤具有非常好的保护的疗效。
1.4生物碱类
中药苦参,山豆根,苦豆子的主要有效成分——苦参,可通过提高肝脏中的SOD、GSH-Px的活性,达到保护肝脏细胞的效果[9]。
岩黄连生物总碱能显著降低四氯化碳所致急性肝脏受损的小鼠血清中天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶水平,通过显微镜下观察肝组织切片可发现细胞的排列状况有明显改善以及肿胀和坏死情况明显减轻[10]。
1.5其他类
近年来大量研究表明,茶叶中的重要活性成分茶多酚可以通过消除自由基提高抗氧化酶的活性以及螯合金属离子等达到增强肝细胞抗氧化活性减少损伤的肝细胞数量的效果,并且与维生素C及维生素E合用时比单独使用时的效果更好[11]。
另有研究发现,白术内酯Ⅰ其对BCG联合LPS所致
具有良好的
[12]。
1.6中药复方
研究发现柴胡疏肝散能使四氯化碳导致的急性肝损伤大鼠血清中ALT、AST的水平显著变低,能有效改善肝损伤的变性坏死[13]。
2.生物药类
2.1氨基酸类
研究发现,乙酰半胱氨酸能使酒精性肝损伤大鼠中天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、丙二醛含量显著降低;使超氧化物歧化酶的活性明显提高[14]。
N-乙酰半胱氨酸作为炎症细胞因子抑制剂,在治疗BCG+LPS引起的免疫性肝损伤小鼠时,能够明显抑制肝脏中TNF-αmRNA的表达,而肝脏中脂质过氧化水平和血清中天冬氨酸转氨酶水平并未得到明显改善,且小鼠死亡率升高,其对肝损伤的作用是具有双重效应的[15]。
2.2蛋白质类
研究发现。
热休克蛋白70可在基因水平上控制肝脏中蛋白质的形成,减少炎症细胞因子的形成,调节肝脏细胞的能量代谢,能够对抗外界的突然刺激减少对肝细胞的伤害[16]。
2.3激素类
褪黑素又称松果体素,是能够调节免疫系统和能量代谢系统的一种激素研究,而且具有抗氧化的疗效[17]。
褪黑素不仅能通过消除氢氧自由基对氧化性肝损伤发生一定的保护的效果,还具有较强的免疫调节效果,能通过减少体内一氧化氮的过度生成产生对免疫性肝损伤的保护作用。
胃饥饿素
是一种胃分泌激素是由胃底部细胞分泌的一种脑肠肽,能够调节进食行为和能量的平衡,能降低血清中丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶的含量,使其维持在正常水平,从而达到保肝的疗效。
3.化学药类
本米为一种化学类药物,化学名为α-(2,4-二氯苯基)-咪唑-1-乙醇[18]。
研究发现,由可卡因所导致的小鼠急性肝损伤在给予本米后小鼠血清中天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶的含量明显降低,肝组织中还原型谷胱甘肽/氧化性谷胱甘肽的比值升高,肝脏切片显示受损细胞数量减少,表明本米对肝损伤起到保护的效果。
过氧化酶抑制剂氨基三唑能明显降低血清中转氨酶和LDH水平的升高,降低肝组织中过氧化氢及丙二醛水平,改善肝脏病理状态,下调炎症细胞因子TNF-α和IL-6的水平,对肝脏具有保护的疗效[19]。
另外,水合氯醛也有一定的保肝作用。
4.微量元素类
在人体内的存在量极少,但其最显著的疗效是与生命活力密切相关,微量元素可通过抗氧化效果达到保护肝脏的目的。
5.小结
通过对肝损伤的治疗研究,可以发现中药、化学药、
及微量元素都是通过增强免疫、提高抗
等来维护肝细胞膜,减慢肝脏中受破坏细胞的损伤速度,并且也有不同的特点。
这为今后治疗肝损伤新药的研发提供了更多方向,打下了良好的根基,也为医生用药提供了良好的根据。
随着医药科技的发展,虽然有很多治疗肝损伤药物的报道,但是许多抗肝损伤药物都具有一定的生物毒性,且靶向性不强,对生命有很大危险。
因此在今后研究中可以重点增强其靶向性,使其可以直接对肝作用,从而减少毒性作用。
参考文献
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致谢
在此特别感谢在实验过程中给予我最大指导帮助和支持的郝军荣老师,感谢她在实验中的指导帮助。
感谢药学系这些年对我的教育与帮助,感谢张聪颖导员以及所用药学系曾经教导过我的任教老师。
衷心感谢药理学实验室宋师姐、刘师姐等研究生以及老师在实验过程中的耐心指导与帮助。
同时还要感谢北方学院各位领导与老师的教育与培养。
最后,感谢大学中所有给予我帮助的老师
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