试剂盒临床方案.docx

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试剂盒临床方案

氧化低密度脂蛋白ELISA检测试剂盒

申报单位：

资料保密

1.前言  1

2.目的  2

3.试验设计概况与流程图  2

4.受试人群  3

5.试验的实施  4

6.实验数据库的建立  6

7.资料的统计分析  6

8.进度安排  7

1.前言

研究早已证实，低密度脂蛋白（lowdensitylipoprotein）向氧化低密度脂蛋白（OxidizedLDL,OxLDL）的转变是始动和促进动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）发生、发展的关键步骤。

近年，大量研究表明，OxLDL与冠状动脉粥样硬化性心脏病（以下简称冠心病）密切相关。

Holvoet及其同事最早清晰地证明患有冠心病的病人具有显著升高的血浆OxLDL水平，证实稳定型心绞痛患者（Stableanginapectoris，SAP）、非稳定性心绞痛（Unstableanginapectoris，UAP）患者及急性心肌梗塞（Acutemyocardialinfarction，AMI）患者的血浆Ox-LDL水平明显高于同年龄的健康人群，并认为OxLDL是比年龄、高血压、糖尿病、吸烟等更为强的冠心病独立危险因素。

最近，美国圣迭戈加利福尼亚大学的Tsimikas及其同事对502例经冠脉造影证实有冠脉病变的患者血浆OxLDL含量进行了分析，结果发现这些患者血浆OxLDL水平不仅显著高于正常对照，而且与其冠脉病变的严重程度呈明显的线性相关关系。

这些研究结果提示，冠心病患者具有显著升高的血浆OxLDL水平，且OxLDL水平与其疾病的严重程度有明显的相关性。

因此，检测血浆OxLDL水平对临床预测冠心病的危险性、诊断冠心病及判断病变的严重程度具有十分重要的意义。

国内外研究者最常用于检测血浆OxLDL含量的方法是酶联免疫法（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA）。

目前国外已有瑞士Mercodia公司生产OxLDLELISA检测试剂盒，国内则未见有同类产品生产和销售。

Mercodia公司的OxLDLELISA检测试剂盒采用双抗体夹心直接ELISA法检测血浆OxLDL含量，即用抗OxLDL单克隆抗体mAb-4E6包被微孔板，加入血浆样品使血浆中的OxLDL与mAb-4E6反应后，再加入酶标记的抗载脂蛋白B（ApolipoproteinB，apoB）抗体，进行酶底物显色后，根据在同一微孔板内反应的标准品制作的标准曲线，计算样品中的OxLDL含量。

本公司研制的OxLDLELISA检测试剂盒亦采用双抗体夹心直接ELISA法检测血浆OxLDL含量，即用抗OxLDL单克隆抗体MabHS1预包被微孔板，加入血浆样品使血浆中的OxLDL与固相化在微孔板上的抗OxLDL单克隆抗体反应，将未反应的血浆组分洗脱后，再加入酶标记的抗apoB抗体，进行酶底物显色后，在450nm波长下测定光吸收值。

最后根据在同一微孔板内反应的标准品制作的标准曲线，求得样品中OxLDL的量。

2.目的

2．1主要目的

说明OxLDLELISA检测试剂盒对冠心病诊断的有效性；

对比华神OxLDLELISA检测试剂盒与瑞士Mercodia公司OxLDL酶联免疫检测试剂盒在检测冠心病的准确性；

确定华神OxLDLELISA检测试剂盒的诊断标准。

2．2次要目的

在稳定的实验系统中检测正常人群血浆Ox-LDL水平，以明确应用本试剂盒进行检测的血浆Ox-LDL正常参考值范围；

Ox-LDL指标比较4个血脂指标而言其诊断性能的比较，是否优于其他4个指标。

3.试验设计概况与流程图

3．1金标准的选择

所有对象经冠状动脉造影，以冠状动脉造影作为金标准。

3．2样本例数及试验设计

在体检人群中筛选研究对象1000例，男女比例在6：

4左右，按年龄分为三个亚组：

18岁~35岁组，纳入400例；36岁~55岁组，纳入300例；55岁~70岁组，纳入300例。

经病史询问、体格检查、实验室检查和心电图检查完全正常的纳入健康受试组，其余入选者纳入其他组。

冠心病组入选研究对象为经冠状动脉造影确诊的冠心病患者。

3．3试验评估

分别用本公司研制的OxLDLELISA检测试剂盒与瑞士Mercodia公司OxLDLELISA检测试剂盒检测所有入选研究对象血浆OxLDL含量，分析、比较两个试剂盒检测对诊断冠心病的有效性。

根据正常人群组中四个亚组的正常人群血浆Ox-LDL含量的测定结果，分析血浆Ox-LDL与年龄的关系，统计血浆OxLDL在不同年龄的正常人群中的分布范围。

比较正常人群与临床确诊的冠心病患者在血浆Ox-LDL这一指标上有无统计学差异。

分析血浆OX-LDL含量与冠心病严重程度的相关性。

3．4流程图

正常（纳入健康受试组）

在体检人群中筛选

异常（纳入其他组）         检测OX-LDL

在冠脉造影病人中筛选冠心病（纳入冠心病组）

4.受试人群

4．1对象的分配

计划在体检人群中纳入研究对象1000例，分别由四川大学华西医院、四川省人民医院、成都市第三人民医院三家单位完成，每家医院至少完成每一亚组30例，只要符合试验要求的所有自愿受试者均可纳入，一旦达到所需的病例总数，录入工作即停止。

4．2入选标准

4．2．1健康受试组

满足以下所有条件者方可纳入：

①年龄18-70岁，男女不限；

②体重指数在20-24范围内；

③无动脉粥样硬化相关疾病病史；

④体格检查未见异常；

⑤血脂及脂蛋白（甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白）检查正常；

⑥肝功、肾功及空腹血糖检查正常；

⑦心电图检查正常

4．2．2其他组

以上七项中任一项或一项以上不符者入选。

4．2．3冠心病组

冠状动脉造影结果显示主要冠状动脉（左前降支、左回旋支、右冠状动脉及左主干）至少有一支冠状动脉病变（狭窄≥50%）。

4．3排除标准

年龄在18岁以下或70岁以上者。

5.试验的实施

5．1受试者检查

5．1．1按观察表要求询问病史及进行体检，并逐项填写。

5．1．2实验室检查：

凡纳入者均于纳入后进行以下检查一次。

血脂及脂蛋白（甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白）

肝功（AST、ALT）、肾功（BUN、Cr）检查

血糖

5．1．3心电图（凡纳入者均于纳入后检查一次）。

5．1．4纳入冠心病组的受试者进行冠状动脉照影检查。

5．2试验用标本的采集与处理

5．2．1采样

受试者于采样前三天禁酒、禁食高脂饮食，采样前12小时禁食禁饮料，但可饮水；

采样日晨空腹肘静脉采血2ml，EDTA抗凝，立即混匀，室温静置；

采血后1小时内分离血浆（室温下3000g离心15min）；

转移血浆于灭菌EP管中，保存于2~8℃冰箱备测；

血样于7天内进行OxLDL测定。

5．2．2注意事项

应向受试者强调必须空腹采样；

样品管应清楚标记；

采样时应避免溶血，溶血标本不能使用。

5．3试剂盒检测原理

用抗OxLDL单克隆抗体预包被微孔板，加入血浆样品使血浆中的OxLDL与固相化在微孔板上的抗OxLDL单克隆抗体反应，将未反应的血浆组分洗脱后，再加入酶标记的抗apoB抗体，进行酶底物显色后，在450nm波长下测定光吸收值。

最后根据在同一微孔板内反应的标准品制作的标准曲线，求得样品中OxLDL的量。

5．4OxLDLELISA检测试剂盒使用方法

5．4．1试剂盒组成

（1）抗OxLDL单克隆抗体预包被的微孔板（40tests）。

（2）OxLDL标准品（0，1，2，4，8，16U/ml）。

（3）酶标记抗apoB抗体。

（4）底物液A、B。

（5）终止液。

（6）样品反应液。

（7）稀释液。

（8）浓缩洗涤液。

（9）质控样品。

5．4．2试剂配制及样品稀释：

（1）用蒸馏水将浓缩洗涤液稀释成洗涤工作液。

（2）用蒸馏水将OxLDL标准品及质控样品溶解。

（3）用稀释液将酶标记抗apoB抗体稀释至工作浓度。

（4）用稀释液将待测血浆样品作1：

5稀释。

5．4．3操作步骤：

（1）将25μlOxLDL标准品、待测血浆样品及质控样品分别加入微孔板（均作复孔），然后每孔加入100μl样品反应液，以不加样品的孔为空白对照孔。

。

用封板胶纸封板，37℃孵育60分钟。

（2）洗板5次。

（3）每孔加入100μl酶标记抗apoB抗体工作液，37℃孵育60分钟。

（4）洗板5次。

（5）每孔加入100ul显色剂，室温（20~25℃）下避光反应20分钟。

（6）每孔加入50μl终止液终止反应后，用微孔酶标仪在450nm波长下测定各孔OD值。

5．4．4结果计算：

手工计算：

①每个标准品和样品的OD值应减去空白对照孔的OD值。

②以标准品浓度对数为X轴，OD值对数为Y轴，绘制OxLDL浓度-OD值双对数标准曲线。

③根据测定样品的OD值从标准曲线上查出稀释样品的浓度。

④样品最终浓度等于稀释样品的浓度乘以稀释倍数。

计算机计算：

自动绘制OxLDL浓度-OD值双对数标准曲线，自动读取稀释样品的浓度，样品最终浓度等于稀释样品的浓度乘以稀释倍数。

6.实验数据库的建立

经临床各单位将所有已完成检验的CRF表进行认真核查并确认完整无误后交华西公共卫生学院生物统计师进行数据处理，根据CRF表建立数据库并用epidata进行双输录入，经逻辑检查和反复核对确认无误后由统计师根据研究目的和资料的性质选用恰当的统计方法进行统计分析。

7.资料的统计分析

7．1对所得资料进行正态性检验，了解其分布类型必要时作变量转换尽可能用正态分布进行处理，根据正态分布原理求得参考值范围。

7．2用ROC进行全面评价和分析，并制定相应的诊断标准。

7．3对两种方法的测得值进行一致性分析,相关密切程度分析,若非正态资料还应进行变量代换。

3．4利用正常人和冠心病人的测得值进行分析比较得出最终的参考值范围，和可疑值范围。

7．5用假设检验比较正常人群组与冠心病组血浆OxLDL含量的差异有无统计学意义。

8.进度安排

2003年11月25日召开第一次临床协作会；

力争2003年12月20日完成样品采集及测定；

力争2003年12月30日前完成资料审核及统计分析；

力争2004年1月10日前完成总结。