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细胞培养的应用
第十三章细胞培养的应用
第一节细胞培养在分子生物学中应用
分子生物学是在生物化学、遗传学、免疫学、微生物学、细胞生物学、生物物理学等学科结合的基础上,经过相互杂交、相互渗透融合发展起来的一门新兴学科,它从分子水平上研究生命现象的本质以及活动规律,以达到造福人类的目的,主要侧重于研究基因的结构和功能、分子间信号传递和调控。
基因在细胞中的表达在时间和空间上具有高度的特异性;细胞的运动、迁徙、粘着、分化的控制机制需要从分子水平上阐明;肿瘤的发生和发展的机制有待于深入研究;人类基因组计划已于2000年6月完成人类基因组草图,科学家发现人类基因数目约为3万个左右,仅比果蝇多2万个,远少于原先10万个基因的估计。
2003年4月14日,国际人类基因组测序组织正式对外宣布:
美、英、日、法、德和中国科学家经过13年努力共同绘制完成了人类基因组序列图,人类基因组计划的所有目标均已实现。
目前基因功能比较清楚的有10000条左右,还有大量的基因功能不明;基因的功能需要以细胞为载体,细胞为这些研究提供了研究的对象和材料。
鄂征等将以研究体外培养的细胞为主要研究对象的分子生物学技术,称为分子细胞学技
术。
细胞是由多种生物大分子如核酸、蛋白质、类脂等组成并由它们行使各种功能活动,只有通过对它们的研究,才能了解细胞的基本活动规律。
对其的研究技术可以分为三类,一是分离提取研究;二是基因导入研究;三是原位检测研究。
一、分离提取研究
根据分离物质的种类分为DNA提取、RNA提取、蛋白质提取。
1.DNA提取在分子生物学研究中,DNA是这些技术应用的主要对象,所以从真核细胞中分离DNA是分子生物学研究中很重要的基本技术,DNA样品的质量直接关系到实验成功与否。
真核细胞95%的DNA存在于细胞核中,DNA与蛋白质结合在一起,构成染色质的高级结构,另有5%存在于细胞器(线粒体)中。
提取DNA的方法比较多,但基本原理是一样的,即去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类生物大分子,去除其他不必要的核酸分子,沉淀DNA,去除盐类、有机溶剂等杂质,最后纯化核酸。
方法一:
酚抽提法
【材料】
磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4),DNA抽提缓冲液,10mmol/LTris-Cl(pH8.0),0.1mol/LED-TA(pH8.0),20μg/mlRNaseA,0.5%SDS,蛋白酶K20mg/ml,酚(Tris-C1pH8.0,饱和),NH4Ac10mol/L,TE(10mmol/Tris-Cl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)),无水乙醇。
【操作过程】
(1)收集细胞,对于悬浮培养的细胞可以直接经1500g离心,用PBS洗涤一次,再次离心去上清;对于贴壁培养的细胞,用胰酶消化后再离心收集,用PBS液洗涤一次后,再次离心,弃上清,收集细胞。
(2)在有细胞沉淀的离心管中加入DNA抽提缓冲液l0ml,37℃1小时。
(3)加入50μl20mg/ml的蛋白酶K,50℃保温3小时。
(4)加入等体积的酚,上下颠倒混匀,直至水相与酚相混匀成乳状液。
(5)室温,5000g离心15分钟,将水相转移到另一离心管中,重复酚抽提二次。
(6)转移水相,加入0.2倍体积的10mol/LNH4Ac,2倍体积的无水乙醇混匀,可立即看到乳白色丝状沉淀,弃去上清,立刻用70%乙醇漂洗沉淀。
(7)室温,5000g离心5分钟,弃上清,室温让乙醇挥发干净。
溶于适量的TE中。
(8)测定DNA的含量和纯度。
【注意事项】
(1)此法可以用于提取5×107个细胞,可得产量为200μg。
(2)高分子量DNA提取过程中,取上层DNA,往往会牵动水相与酚相的界面蛋白质层,可以将Tip头剪去一段,这样尖端的口径增大,缓慢吸取水相。
(3)在DNA抽提缓冲液中加入高浓度的RNaseA,可以省去DNA沉淀后再次用RNaseA消化残留的RNA。
(4)此方法可分离100~200kb左右的基因组DNA,适用于λ噬菌体作为载体的基因组文库的构建、脉冲场电泳、酶切分析、Southern杂交、PCR检测等实验。
方法二:
甲酰胺解聚法
【材料】
DNA抽提缓冲液:
10mmol/LTris-C1(pH8.0),0.1mol/LEDTA(pH8.0),20μg/mlRNaseA,0.5%SDS。
蛋白酶K20mg/ml。
变性缓冲液:
80%去离子甲酰胺,0.8mol/LNaCl,20mmol/Tris-C1(pH8.0)。
透析液1:
0.1mol/LNaCl,20mmol/LTris-Cl(pH8.0),l0mmol/LEDTA(pH8.0)。
透析液2:
10mmol/LNaCl,l0mmol/LTris-Cl(pH8.0),0.5mmol/LEDTA(pH8.0)。
【操作程序】
(1)细胞的收集及蛋白酶K消化同酚抽提法。
(2)当蛋白酶K消化后,将溶液冷却至0℃,加入10ml变性液缓冲液,放置15℃过夜。
(3)将液体转移至1个火棉胶袋中,先用透析液1透析,每次1L,换液4次;然后用透析液2透析,换液6次,每次700ml。
(4)直到DNA溶液中A260/280的值稍大于1.75,若低于1.75则需继续透析。
(5)根据0D260计算DNA的含量,用脉冲场电泳分析DNA分子量的大小。
【注意事项】
(1)此法是裂解细胞和消化蛋白后,利用高浓度的甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合,然后透析处理DNA样品,由于提取过程中操作步骤少,对DNA的机械损伤比较小,DNA分子量可达200kb左右。
其用途同酚抽提法。
(2)对于5×107个细胞,使用本法,最后的溶液体积为20ml,浓度为5~10μg/ml,在此浓度下,其溶液仍然很粘稠,说明DNA的分子量比较大。
方法三:
Trlzol法
此法利用DNA和RNA在溶液中的分布不同将其分开,RNA分布在水相中,而DNA分布在有机相中,用乙醇将DNA沉淀下来。
【材料】
Trizol试剂,含0.1mol/L柠檬酸钠的10%乙醇,无水乙醇,8mmol/LNaOH。
【操作程序】
(1)收获细胞5×106个,方法同前。
(2)在含有细胞团的Eppendorf管中加入1mlTrizol试剂,振荡混匀,室温放置5分钟。
(3)加氯仿0.2ml,振荡混匀,室温放置2分钟。
(4)4℃,12000g离心15分钟,小心吸取上层水相,移人另一Eppendorf管中(用于RNA提取)。
(5)在有机相中加入0.3ml的无水乙醇,混匀,室温放置2~3分钟。
(6)4℃,10000g离心5分钟。
(7)吸去上清(用于蛋白质的提取),用1ml含0.1mol/L柠檬酸钠的10%乙醇漂洗DNA。
沉淀2次。
在每次漂洗过程中,使DNA沉淀在溶液中保持30分钟,其间不断用手指振荡。
最后4℃,10000g离心5分钟收集DNA沉淀。
(8)用75%乙醇洗涤沉淀1次。
(9)空气中干燥DNA沉淀(不要作真空干燥,也不要过度干燥,否则很难溶),用600μl8mmol/LNaOH溶解DNA沉淀。
(10)此时,DNA沉淀中可能含有一些胶状不溶物,可以将其在4℃,12000g以上离心10分钟,取上清。
2.RNA提取在研究基因表达及其调控、cDNA合成、cDNA文库的构建过程中,RNA的提取是必不可缺少的一步。
在哺乳动物细胞中,平均每个细胞含有10-5μgRNA。
对于培养的细胞而言,lg细胞相当于lml压积的细胞,大约108个左右。
在细胞质总RNA中,rRNA占80%~85%,mRNA占1%~5%,余下的为tRNA和核内小分子RNA。
其中mRNA分子种类繁多,分于量大小不一,在细胞内含量少,它是蛋白质合成的直接模板,是分子生物学中基因表达研究的主要对象。
绝大多数mRNA分子(除血红蛋白、干扰素和有些组蛋白mRNA以外)的3’端存在着20~250个多聚腺苷酸(PolyA)。
利用此特征,可很方便地从总RNA中,用寡聚(dT)亲合层析柱分离出mRNA。
RNA的分离关键因素是尽量减少RNA酶的污染。
RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶,除细胞内RNase以外,环境中的灰尘、各种实验器皿和试剂、人体的汗液以及唾液中均存在RNase。
这类酶耐热、耐酸、耐碱,蛋白质变性可使之暂时性失活,但在变性剂去除后,又可恢复活性。
所以在实验操作的过程中,应尽量减少RNase污染的机会。
在整个操作中,在一个洁净的环境中,带手套和口罩,所用的器皿、水和试剂需用DEPC(焦碳酸二乙酯,是很强的RNase抑制剂)处理过。
玻璃器皿的处理。
在常规洗净后,应用0.1%DEPC浸泡2小时以上,再用双蒸水漂洗几次,高压消毒去除DEPC,然后250℃烘烤4小时以上。
塑料器材应用一次性、新的,如Eppendoff管、Tip头等,在使用前高压消毒,严格一些可以用0.1%DEPC浸泡过液,高压消毒。
所用试剂应加DEPC至0.05%~0.1%,室温过液,然后高压处理。
但要注意,DEPC易与Tris反应,所以在配制Tris时,应用DEPC处理过的水配制,最后再一次高压消毒。
方法一:
异硫氰酸胍、酚、氯仿一步法
此方法将已知最强的RNase抑制型异硫氰酸胍、9-巯基乙醇和去污剂N-十二烷基肌氨酸钠联合使用,抑制RNA的降解,增强了对核蛋白体复合物的解离,提高了RNA的产率。
RNA选择性地进入无DNA和无蛋白质的水相,容易被异丙醇沉淀浓缩,比较适合于大量或少量的细胞RNA提取。
用此种方法提取的RNA可用于Northern杂交、cDNA的合成、体外翻译、RT-PCR等。
【材料】
(1)DEPC处理水。
(2)0.75mol/L柠檬酸钠:
称取柠檬酸钠(Na3C6H7·2H2O)22g,溶于70ml水中,以浓HCl调pH至7.0至100ml,高压灭菌。
(3)10%十二烷基肌氨酸钠(sodiumlaurylsarcosine):
称取10g十二烷基肌氨酸钠,溶于90ml水中,65℃助溶,定容至100ml。
(4)GSS缓冲液:
用293ml水溶解250g异硫氰酸胍,加入17.6ml0.75mol/L柠檬酸钠,26.4ml10%十二烷基肌氨酸钠,滤过除菌。
(5)变性缓冲液:
在用时miGSS缓冲液加入100社琉基乙醇
(6)酚(水饱和);在100ml重蒸酚中,加入30mlDEPC处理水,磁珠搅拌混匀,直至酚相与水相形成明显的界面。
(7)2mol/LNaAc(pH4.0)。
(8)氯仿:
异戊醇(49:
1)。
(9)PBS缓冲液(DEPC处理水配制)。
【操作程序】
(1)收集细胞5×106个,方法同DNA提取。
(2)在含有细胞团的Eppendoff管中加入0.5ml变性缓冲液,振荡混匀。
(3)加入50μl2mol/LNaAc,混匀后,加入0.5ml水饱和酚,再加入100μl氯仿/异戊醇,振荡混匀后置于冰上15分钟。
(4)4℃12000g离心15分钟。
(5)小心吸取上清,转移至另一Eppendoff管中,加等体积的异丙醇,混匀后,置于-20℃至少一小时。
在吸取上清时,不能接触水相与酚相的界面,此界面为蛋白质层,酚相中主要为DNA。
(6)4℃,12000g离心15分钟,弃上清,加入150μl变性液,振荡溶解沉淀(沉淀中含有RNA)。
加入150μl异丙醇,置于-20℃,1小时。
(7)4℃,12000g离心15分钟,弃上清(如不立即用,可以将此置于-70℃,长期保存)。
(8)冰浴冷的75%乙醇漂洗沉淀;4℃,12000g离心5分钟,弃上清(小心不要将沉淀倒掉)。
(9)真空干燥.去除样品中的乙醇(但不宜完全干燥,否则沉淀难以溶解)。
(10)用适量的DEPC处理水溶解沉淀,测定OD260、280、230,计算RNA的含量和纯度,同时取大约150ng总RNA电泳检测完整性。
可以用非变性的琼脂糖凝胶,EB染色后,可以见到有3条明显RNA带,分子量大的两个分别为28S和18S,带的亮度比为2︰1,如果小于此值,说明RNA存在着降解;如用甲醛变性胶电泳,则需要比较大的上样量。
【注意事项】
(1)RNA的含量计算:
X(μg/μl)=OD260×40×稀释倍数/1000,OD260加为波长260nm时吸光度值。
(2)通常纯的RNA,OD260/OD280=2.0,由于所用的标本不同,此数值在1.7~2.0范围内波动。
若低于此值说明有蛋白质污染,此样本应再经酚/氯仿/异戊醇抽提一次。
有时样本此值大于2.0,如重复测定无误,并不表明纯度有问题。
RNA样品OD260/OD230常大于2.0,低于此值表示有异硫氰酸胍污染,此时样品需经异丙醇沉淀,以除去小分子胍类的污染。
方法二:
Trizol试剂提取
Trizol试剂提取RNA的方法是由Invitrogen公司推出的新产品,其操作简单、方便,在1小时即可完成,所制备的RNA可以用于Northern杂交和cDNA的合成。
此种方法,还有一个优点,它可以同时分离DNA、RNA和蛋白质。
如果对一个很少的标本要进行这三种物质分析,Trizol试剂是最佳的选择。
【材料】
Trizol试剂,氯仿,异丙醇,75%的乙醇,DEPC处理水,PBS缓冲液。
【操作程序】
(1)收获细胞5×106个,方法同DNA提取。
(2)在含有细胞团的Eppendorf管中加入1m1Trizol试剂,振荡混匀,室温放置5分钟(为了获得好的结果,可在15℃水浴中进行)。
(3)加氯仿0.2ml,振荡混匀,室温放置2分钟。
(4)4℃,12000g离心15分钟,小心吸取上层水相,移人另一Eppendorf管中(不可触及中间层的蛋白质界面)。
(5)加入等体积的异丙醇,置室温10分钟。
(6)4℃,12000g离心15分钟,弃上清。
(7)冰浴冷的75%乙醇漂洗沉淀;4℃,12000g离心5分钟,弃上清。
(8)真空干燥,去除样品中的乙醇,用适量的DEPC处理水溶解沉淀,测定OD260、280,计算RNA的含量和纯度,同时取大约150ng总RNA电泳检测完整性。
【注意事项】
此两种方法是目前常用且比较简单的RNA提取方法,在提取的时候,最好是先计算细胞的数目,决定变性液或Trizol试剂的用量,如果细胞数目过多,常出现在RNA中有蛋白质和DNA的污染。
不论采用何种方法,都很难保证没有DNA污染,在做RT-PCR时将出现非特异性扩增和杂带,所以推荐在RNA提取后,用DNAseI(无RNase活性)消化DNA,获得高纯度的RNA。
如果从转染有质粒或病毒的细胞,则必须用DNAseI消化。
3.蛋白质提取蛋白质是基因的最终产物,是功能的执行者。
在研究中需从细胞中提取蛋白质进行酶的活性分析和产物鉴定。
下面介绍同和种常用的方法。
方法一:
SDS-超声
此种方法利用SDS裂解细胞,再用超声的方法断裂DNA,所获得蛋白质溶液可以用于SDS-PAGE分析和Westernblot。
【材料】
1×SDS加样缓冲液:
50mmol/LTris-Cl(pH6.8),100mmol/LDTT(二硫苏糖醇),2%SDS,0.1%溴酚兰,10%甘油。
PBS缓冲液。
【操作程序】
(1)弃细胞培养基,用PBS洗涤细胞2次。
(2)用橡胶刮下细胞(不要用胰蛋白酶消化),加入适量的PBS缓冲液,离心收获细胞。
(3)在含有细胞团的离心管中加入150μl1×SDS加样缓冲液,此时溶液比较粘稠,是由于大量基因组的DNA的释放。
(4)将上述溶液煮沸5~10分钟。
(5)用超声波打碎染色体DNA,直到溶液不粘稠为止。
(6)室温下10000g离心10分钟,取上清到另一个离心管中。
(7)测定蛋白质浓度。
所得溶液可以用SDS-PAGE分析和Westernblot。
方法二:
Trizol法
Trizol试剂除了可以分离DNA和RNA外,还可用于蛋白质的提取。
【材料】
含0.3mol/L盐酸胍的95%乙醇。
【操作程序】
(1)在Trizol法DNA提取过程中⑦的上清(酚和乙醇相)中,加入1.5ml的异丙醇,室温10分钟。
(2)4℃,12000g离心10分钟。
(3)弃上清,用含0.3mol/L盐酸胍的95%乙醇溶液洗涤沉淀3次。
在每次洗涤过程中,沉淀在溶液中保持20分钟。
(4)4℃,10000g离心5分钟。
(5)用2ml的无水乙醇洗涤沉淀1次,4℃,10000g离心5分钟。
(6)吸去上清,真空干燥,用1%SDS溶解蛋白质沉淀。
(7)4℃,12,000g离心10分钟除去非需物质,转移上清(即含蛋白质的溶液)。
【材料】
细胞裂解液:
Tris-Cl(PH8.0)50mmol/L,NaCl150mmol/L,0.02%Na3N,PMSF100μg/ml,1%TritonX-100,PBS缓冲液。
【操作程序】
(1)离心收获对数期生长细胞,用PBS洗涤细胞2次。
(2)向细胞沉淀加入800μl细胞裂解液,4℃放置30分钟(为了进一步破碎细胞,可用超声破碎机粉碎)。
(3)4℃、12000g离心30分钟,吸上清,即为蛋白质液。
【注意事项】
此种方法用了蛋白酶抑制剂PMSF(苯甲酰磺酰氟),没有应用蛋白质变性剂,所以此法所得的蛋白质液可以用于酶的活性分析,但其和Na3N有剧毒,实验操作要小心,实验过程中要带手套谨慎操作。
二、基因导入
当一个基因被克隆后,研究者总是希望将其转染到真核细胞中进行研究其功能、表达调控、分离蛋白质产物等。
所有这些目的,都必须具有将DNA有效地导入细胞的能力。
目前基因导入技术已经广泛地用于基因结构与功能分析,基因表达与调控、基因治疗与转基因动物研究,已经成为分子生物学研究的一种常用的手段。
这里介绍几种常用的细胞基因转染的方法。
方法一:
脂质体转染
转染用试剂脂质体Lipofeetin和Lipofectamine是由Invitrogen公司推出的第一代产品和第二代产品。
Lipofectamine与Lipofectln相比,毒性更小,转染效率更高,特别适合于一些转染的细胞,如HeLa、COS-7、NIH3T3、PC12D等。
脂质体是一种特制的阳离子脂质试剂,其与靶DNA的磷酸骨架结合而成的复合物,具有能轻易通过细胞膜从而完成转染过程的特性。
可转染DNA、RNA和寡核苷酸至各种细胞,并将DNA导入植物原生质体。
目前在研究基因功能方面,出现一个新的技术是RNA干扰试验(RNAinterference),在操作过程中,是将21~25nt寡核糖核酸双链分子转染细胞,从而稳定、特异性去除某一个基因的表达,然后从细胞的表现中推测未知基因的功能。
所用的转染试剂就是Lipofectamine。
脂质体适用于各种类型的贴壁生长和悬浮培养的细胞,其介导的转染效率是磷酸钙沉淀法德5~100倍。
1.贴壁细胞转染方法
【材料】
脂质体,不完全培养基(RPMI1640),完全培养基(含15%胎牛血清)。
【操作程序】
(1)质粒的制备:
由于用于转染的质粒量比较大,所需的纯度也较高,而且质粒的构型最好是共价闭环的。
所以推荐采用质粒DNA大量制备,而且在操作过程中要轻柔。
提取的质粒需进行纯化,如用氯化铯密度离心法、聚乙二醇沉淀法。
目前市上所售的一些质粒提取和纯化的试剂盒可以达到基因转染的要求,并且操作比较简单、快捷。
在质粒纯化的最后一步质粒沉淀时,应是无菌操作,70%的乙醇漂洗,无菌超净台内吹干,溶于无菌水中。
(2)收获细胞:
将(1~2)×105个细胞重悬于2ml完全培养基中,转种于35mm培养皿中或6孔培养板中。
(3)37℃,5%CO2培养箱培养18~24小时,使细胞达50%~80%的融合。
(4)在Eppendorf管中,制备下列溶液:
A溶液:
将2~20μg质粒DNA溶于100μlRPMI1640培养基中。
B溶液:
Lipofectin[Lipofectin(μl):
DNA(μg)约为2.5:
1]稀释于RPMIl640培养基中,至终体积100μl。
(5)合并A溶液和B溶液,轻轻混匀,置于室温15分钟。
(6)弃去培养皿或培养板中的细胞培养液,并用无血清培养基洗涤细胞一次。
(7)加0.8ml无血清培养基至Lipofectin-DNA混和物中,混匀后,小心滴在细胞上,轻轻混匀。
(8)37℃,5%CO2培养箱培养5~24小时(这个时间要根据细胞耐受无血清培养时间而定)。
(9)弃去转染液,加入2ml完全培养基,继续培养.
(10)转染后48~72小时,测定细胞瞬时表达情况,如用于稳定表达,可于转染48小时后更换选择培养基进行筛选。
2.悬浮细胞一过性转染方法
【材料】
同贴细胞转染方法。
【操作程序】
(1)质粒的制备同上。
(2)收获细胞,用无血清培养基洗涤细胞1次。
(3)将(2~3)×106个细胞重悬于0.8ml无血清培养基中,接种于6孔板或35mm培养皿中。
(4)参照贴壁细胞转染方法(4)、(5)进行制备Lipofectin-DNA混和物。
(5)将制备的Lipofectin-DNA混和物加入细胞悬液中,轻轻混匀,置37℃,5%CO2培养箱培养5~24小时。
(6)加4ml完全培养基继续培养。
(7)转染48~72小时后,室温200g,离心5分钟收获细胞。
测定细胞瞬时表达情况。
Lipofectamine与Lipofectin转染的方法基本相同,不同公司的产品有稍许不同,请参照其产品说明书进行,表13-1列出不同直径的培养皿的转染过程所需的试剂量。
表13-1不同培养皿所需试剂量
培养皿直径
(mm)
脂质混合物
(μl)
Lipofectamine或Lipofectin(μl)
DNA
(μg)
无血清培养基
(ml)
35
60
100
100
300
800
2-25
6-75
16-200
1-2
3-6
8-16
0.8
2.4
6.4
方法二:
磷酸钙沉淀法
此法是研究基因转染最先采用的技术,操作简单,不需昂贵的转染试剂,至今仍有研究者应用此技术。
其机制可能是DNA与磷酸钙形成沉淀物,使之粘附到培养的哺乳动物细胞表,被细胞内吞。
但此法存在着不足的地方就是转染效率比较低,有些细胞不能用此种方法进行转染。
l.贴壁细胞转染方法
【材料】
(1)2mol/l氯化钙,0.22μm滤膜过滤除菌,-20℃保存。
(2)2×HBS缓冲液:
280mmol/LNaCI,10mmol/LKCl,1.5mmol/LNa2HPO4,12mmol/L葡萄糖,50mmol/LHEPES。
将1.6gNaCI,0.074gKCl,0.027gNa2HP04·2H20,0.2g葡萄糖,1gHEPES溶于90ml水中,用0.5mol/LNaOH调节pH为7.0,然后用双蒸水定容至l00ml,0.22μm滤膜过滤除菌,分装,-20℃保存。
(3)含15%甘油的1×HBS缓冲液。
(4)PBS缓冲液(pH7.4)。
【操作程序】
(1)在转染前24小时,将对数生长期细胞用胰酶消化,将1×106个细胞接种于60mm的培养皿中,置37℃、5%CO2培养箱中继续培养。
(2)在转染前2小时,按表13-2配制DNA-磷酸钙共沉淀物
表13-2DNA-磷酸钙共沉淀物的制备
试剂
60mm培养皿
100mm培养皿
试剂
60mm培养皿
100mm培养皿
DNA(μg)
无菌水(ml)
6~12
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