甜叶菊糖甙的提取纯化及分离检测方法研究.docx
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甜叶菊糖甙的提取纯化及分离检测方法研究
甜叶菊(Steviarebaudiana)糖甙的提取纯
化及分离检测方法的研究
滕祥金
摘要:
随着人民生活水平的提高,现在吃得更营养,吃得更健康逐渐成为消费者关心的重点。
甜叶菊糖甙的生产不但能补充我国食糖的不足,更可替代糖精等不利于人体的化学合成甜味剂,因此,低热量的甜味剂甜叶菊糖营也随之热起来,长期食用甜叶菊糖普不会使人发胖,特别适宜肥胖病、糖尿病、高血压、动脉硬化、龋齿病患者使用,而且物理、化学性能稳定、无发酵性。
本论文以本实验室栽种甜叶菊叶片为原料,研究并探讨了甜叶菊糖甙的提取、纯化、分离、检测的方法。
蒸煮浸提法的最佳条件:
以水为溶剂、温度100℃、时间6h、料液比1:
10,浸提物中甜叶菊糖甙含量为9.28%。
甜叶菊糖甙的提纯通过比较选择了沉淀效果比较好的FeSO4;和Ca(0H)2,加入条件为80℃恒温水浴40min,静止4h抽滤,在通过大孔吸附树脂和阴阳离子
交换吸附精制甜叶菊糖甙,冷冻干燥后得到甜叶菊糖甙结晶粉末。
甜叶菊糖甙组分的分离方法主要有重结晶法、层析法。
重结晶法利用甜叶菊糖甙各主要组分在乙醇溶液中溶解度的不同进行结晶将主要组分分离;层析法是利用甜叶菊糖甙主要组分在装有硅胶的层析柱中被吸附和解吸速度的不同将甜叶菊糖普主要组分分离。
检测甜叶菊糖甙含量的主要方法有重量测定法、液相色谱法、薄板层析法、分光光度法(蒽酮为显色剂)、分光光度法(DNS试剂为显色剂)、化学发光法等。
采用硅胶G薄板层析法,展开体系:
正丁醇:
乙酸:
乙醚:
水(9:
6:
3:
l),能十分清晰将甜叶菊糖甙、葡萄糖、麦芽糖分开,可以定性检测甜叶菊糖甙的两种主要单体组分。
分光光度法(蒽酮为显色剂)和分光光度法(DNs试剂为显色剂)都可以测定甜叶菊糖甙的主要组分,方法简便,对实验设备要求不高,但准确度不高、误差大。
流动注射化学发光法测定甜叶菊糖甙是我们最近研究出来的一种新的测定方法,能够准确测定出甜叶菊糖甙的含量,与其他测定甜叶菊糖甙的测定方法相比,其准确度、灵敏度都很高,这一测定方法在国内外尚属空白。
具有一定的理论意义和实际应用价值。
关键词:
甜叶菊糖甙;提取;纯化;测定
1前言
1.1研究的目的与意义
甜叶菊原产于巴拉圭的Amambay及Mbaxacayu山脉,土壤条件是古代水成岩及火成岩的风化土壤。
呈现出明显的局部特异性土壤分布,多含沙壤土和腐殖质土,肥力较差。
气候条件因地势及地形的原因,降雨量较多,温差较大,且有霜降现象,可认为近似温带气候,整个生长期温度都在20℃以上。
甜叶菊具有喜温性,种子萌发的最适温度为20一25℃,营养生长期温度也要求22℃以上,开花的最适温度为18一22℃。
甜叶菊属感光性强的短日照植物,临界夜长大于12h。
长日照反应期分别在现蕾前13一14d和开花前26~30d,此阶段为花芽形成诱导期。
此时期需具备少于12h的短日照才能正常开花,所以短日照是甜叶菊由营养生长转到生殖生长的关键(鲍志华,1999)。
甜叶菊作为糖料植物,早在第二次世界大战时就曾引起过国际重视。
1970年日本从巴西引进甜叶菊,开始驯化、栽培、制昔,同时进行毒理、食品检测等试验,并首先开发利用甜叶菊产品一甜叶菊糖甙。
我国于1976年从日本引种试种,并获成功。
目前除中国、日本引种和推广外,韩国、泰国、菲律宾等也有不同程度的推广栽培(T宁等2004,杨丹等2005)。
我国自1976年开始由南京中山植物园、中国农业科学院等科研单位先后从日本引进甜叶菊试种成功。
80年代初向全国各地推广种植,生产的甜叶菊干叶主要出口日本。
1982年成都化学制药厂科技人员首次研制甜叶菊糖甙生产技术成功,紧接着,天津南开大学、北京商业机械化研究所分别在江苏镇江和湖南西湖农场兴建甜叶菊厂试产成功。
1985年卫生部批准甜叶菊糖甙在饮料、糕点和糖果中使用,而且用量不受限制,1996年我国甜叶菊糖甙产销量突破千吨大关(唐志发,1999),1997年产销量达到1400吨左右,其中80%左右为出口,我国现已成为世界上最大的甜叶菊糖甙生产国和出口国。
我国的甜叶菊糖甙发展之所以如此迅速,与其生产原料充足密切相关。
甜叶菊适应性强,我国自海南到新疆,从云南到黑龙江,除高寒和无灌溉条件的地区外,均可种植,南方每年收成2一3次北方每年一收。
事实证明,发展甜菊糖对我国国民经济发展有着重要的意义。
甜叶菊糖营是由甜叶菊的叶片提取,是一种天然无热量高倍甜味剂,它在体内不参加代谢、不蓄积、无毒性,其安全性已得到国际FAO和WHO等国际组织的认可,2004年7月6日世界联合卫生组织正式通过允许甜叶菊糖甙在世界范围内通用的决议,这为甜叶菊糖甙的安全性提出了有利的证明。
因此,甜叶菊是一种安全的天然甜味剂。
我国卫生部自1985年和1990年分别批准甜叶菊糖甙为不限量使用的天然甜味剂和医药用甜味剂辅料,用其制成的食品饮料,长期食用不会使人发胖,特别适宜肥胖病、糖尿病、高血压、动脉硬化、龋齿病患者使用,而且物理、化学性能稳定、无发酵性,可延长甜叶菊糖营制品的保质期。
因而,被广泛应用在食品和药物行业中,被誉称为继蔗糖、甜菜糖之后的第三种天然糖源(李钦等1994,沈秀丽等1995),有着广泛的应用范围和宽阔的市场前景。
现在吃得更营养,吃得更健康逐渐成为消费者关心的重点。
因此,低热量低脂肪的甜味剂甜叶菊糖甙也随之热起来,国内对甜叶菊糖甙的功能开发已初具规模,年产甜叶菊糖甙700多吨,不仅满足了国内市场的一部分需要,而且少量出口到世界其他国家和地区,所以甜叶菊糖甙有着广阔的市场前景,而提高产品质量、降低生产成本、从生产实际出发、简化提取分离纯化工艺是我们面临的重要课题。
因此本文对甜叶菊糖甙的提取、纯化、分离、检测的试验方法进行研究讨论,探讨操作简便、灵敏度高、成本低的提取、纯化、分离、检测甜叶菊糖甙的方法。
1.2国内外研究动态与趋势
1.2.1国内外(日本)甜叶菊研究发展概况
1970年开始,日本首先将甜叶菊从巴西引种,并且从叶片中提取出甜菊糖的作为了甜味剂,在食品、药品等行业得到了广泛的应用。
70年代起,日本、美国、韩国、巴西等国家先后进行过动物急性毒理、亚急性毒理、长期毒理学试验。
日本药理学家明石和光桥(1978一1982年)数次反复试验,同时进行动物急毒、亚急性毒理、长期毒理学试验。
结果表明,糖甙对动物没有任何毒害作用,且对肿瘤病变有控制作用,这是三萜类抑制亚硝铵再合成的作用所致,对人体代谢功能无任何不良影响。
在对糖尿病病人的用量试验,未发现任何副作用,且对人体代谢功能无任何不良影响。
St和RA的结构未发生变化即从体内排出,对动物无急毒性,同时也证明了对动物的生殖能力、变异性、遗传均不存在慢毒性。
甜叶菊糖甙作为食品添加剂被认可的巴西和日本使用已经有30多年的历史。
截止到2004年底,日本申请产权保护的有4个品种,其中3个都己经保护期满,这些品种都不是转基因植物。
甜叶菊的植物生物化学、栽培方法、病害等也进行了大量的研究。
几十年的农业生产表明:
在日本农业生产成本比较高。
因此,目前的干燥甜叶菊叶片或粗糖甙产品儿乎来自于中国的黑龙江省、山东省、安徽省。
日本甜叶菊糖甙的研究主要集中在北海道的东北大学农学部等7个单位;甜叶菊工业协会有10个公司参加。
35年来,出版书籍近十部;发表论文近200篇;专利近20个。
相对国外的甜叶菊糖甙的研究,我国起步较晚,研究进展缓慢,近期,郝再彬、胡献丽等学者先后对甜叶菊及其糖甙的研究、发展、利用进行了大量的综述,表明了中国发展速度缓慢,各方面有待深入研究。
在许多方面取得了一定的成绩,如:
糖营提取方法及工艺研究;
栽培技术及病害防治;离体培养及工厂化生产;糖甙的可见光检测、紫外线检测、化学发光检测;基因分析等。
但是国内水平与国际相比差距很大。
1.2.2甜叶菊的结构分布与理化性
1.2.2.1甜叶菊糖甙的结构
甜叶菊糖甙是从干燥后的甜叶菊叶片中提取出来的一类具甜味的萜烯类配糖体。
目前为止,己从甜叶菊中分离得到8种不同甜度的糖甙。
其中Stevioside是主要成分,占60%一70%,甜度为蔗糖的300倍;其次是RebaudiosideA,占15%一20%,甜度为蔗糖的450倍,且甜味最接近蔗糖,其他组分含量都较少(舒世珍等1998)。
甜叶菊叶片中含的甜味成分主要有八种(赵瑜藏等2000):
(l)甜叶菊糖甙(stevioside)
(2)甜叶菊醇双糖甙(steriolbioside)
(3)莱包迪甙A恤baudiosideA)(RA)
(4)莱包迪甙B(rebandiosideB)(RB)
(5)莱包迪甙e(rebaudiosideC)(RC)
(6)莱包迪甙D(rebaudiosideD)(RD)
(7)莱包迪甙E(rebaudiosideE)(RE)
(8)杜尔可甙A(duleosioleA)(Dul-A)
这些配糖体中含量高、且有经济价RA,不论从甜度和味质上均受到好(totalstevfoside)表示甜叶菊总甙是表示
莱包迪甙A结构式如图1:
研究合适的纯化方法,分离去除其中的杂质(包括蛋白质、糖类、无机盐等)显得尤为必要。
目前天然产物的纯化方法较多,主要有沉淀法、萃取法、酸碱法、吸附法、层析法和超临界C02流体萃取法等。
本文采用沉淀法、吸附法研究了甜叶菊糖甙的纯化方法(刘宗林等2002)。
沉淀法是加入一种沉淀剂和混合物中的杂质反应生成沉淀,过滤沉淀。
因此采用沉淀法可以初步纯化甜叶菊糖甙(刘永宁,1993)。
树脂吸附法是一种具有多孔立体结构的聚合物吸附剂,它是依靠其与被吸附分子之间的范德华引力,通过其巨大的比表面积进行物理吸附过程。
1.2.5甜叶菊糖甙的分离方法
1.2.5.1层析法
利用吸附剂对不同物质吸附能力的不同进行分离。
由于甜叶菊糖甙各主要成份的极性存在细微差异,因此在层析柱中扩散的速度不同,利用这一点将各组分分开(沈秀丽等1995,陈天红等1998)。
1.2.5.2重结晶法
通过研究甜叶菊糖甙在甲醇一水混合液中溶解度的差异,采用较为简单的工艺技术将甜叶菊糖甙提取液经提取、脱色、吸附等处理后,再在一定配比的甲醇一水体系中重结晶,得到了RA含量高于60%的甜味剂产品,从根本上改进了甜叶菊糖的味质(张杨1998,刘宗林
2002)。
1.2.6甜叶菊糖甙的检测方法
1.2.6.1薄板层析法
薄板层析法是利用吸附剂对不同物质吸附能力的不同进行分离。
由于甜叶菊糖甙各主要成份的极性存在细微差异,在薄层上展开时,极性较强的糖甙如RA展开速度要慢一些,而极性弱的物质相对展开较快。
再选用适宜的显色剂显色,定性鉴别甜叶菊糖甙〔〔FujinmaK1986,黄海水等1990)。
1.2.6.2高效液相色谱法
高效液相色谱法作为一种高效、高灵敏度的检测手段己被广泛用于甜叶菊糖各组份的分离、测定研究。
色谱固定相的成份与淋洗液极性的搭配是分离效果的关键(黄晓兰1989,李敬慈1997)。
美国人Robert等人通过改变萃取剂组份比以及使用含氧有机固定相,通过硅
原子以共价键连在无机载体上做为色谱填料,用HPLC将甜叶菊提取液中八种糖甙组份实现了一次分离。
MakaPugay等人选用氨基固定相Zorbax一NHZ为色谱柱,乙睛一水作流动相,用线性梯度洗脱法在十儿分钟内将八种组份分离。
特别值得一提的是,MakaPugay等人还对包括中国在内的几个国家和地区的甜叶菊干叶组份含量进行了对比测定(Manrip,19%)。
1.2.6.3分光光度法(蒽酮为显色剂)
甜叶菊的甙元是四环二萜类化合物,在C一4位的梭基上连接着一个葡萄糖基,在C-13位上以槐糖形式连接两个葡萄糖基,构成甜叶菊糖甙。
在酸性溶液中,甜叶菊糖甙易水解脱去基团上的葡萄糖基,剩下的甙元(异甜叶菊醇)不溶于水,可过滤分离。
在相同的条件
下水解,脱落葡萄糖的数量是相同的,它与蒽酮试剂反应生成稳定的绿色溶液。
在波长620nm处有一个最大的吸收峰,浓度在0一80ppm之间,其吸光度A的大小与溶液甜叶菊糖甙浓度C呈直线相关关系,符合贝尔定律(项秀珠等,1996)。
1.2.6.4分光光度法(ONS为显色剂)
专利申请号:
(200510010277.3).
1.2.6.5液滴逆流分配层析法
液滴逆流分配层析是以一种液体作固定相,另一种液体作流动相。
固定相充满一组彼此相连的细管,流动相以微滴的形式穿过固定相,从而使样品在流动相与固定相之间进行分配,分离量可以从几毫克到几克。
Kinghom等人用DCCC法进行了甜叶菊提取液的纯化和分离,以氯仿一甲醇一异丙醇一水(11:
9:
4:
8)为固定相,成功地分离甜叶菊糖甙(KinghomAD,1982)。
1.2.6.6甜叶菊糖甙质盘控制的微生物检测方法
该部分正在申请专利,专利申请号:
(200510010277.3)。
1.2.6.7其他
此外分离甜叶菊搪甙的方法还有超临界萃取法、毛细管电泳法和重量法(周可成,1995)。
1.2.7甜叶菊糖甙的应用
1.2.7.1甜菊糖甙在食品中的应用
甜叶菊糖甙甜度高且热量低,作为一种新型天然的甜味剂可广泛应用于各类食品、饮料中(黄应森等1980)。
广义上讲,凡用糖产品几乎都可用甜叶菊糖甙代替部分蔗糖和全部糖精。
甜叶菊中含有14种微量元素、32种营养成分,因此它既是极好的糖源,又是很好的营养来源。
在饮料生产中,用甜菊糖甙代替15%~35%蔗糖,既符合国家标准GBIO791一89要求,又不会降低产品质量,且具有如下优点:
(1)可改善饮料口感,使之具有清凉爽口的甜味,可改变砂糖浓厚甜腻感。
(2)实现饮料低糖化,符合饮料发展方向。
(3)甜叶菊糖甙较蔗糖物理、化学性能稳定,不易成为微生物营养源,延长产品保质期。
甜叶菊糖甙用于冷食品中可代替10%一25%蔗糖。
除具备用于饮料中的优点外,还具有增加甜味的效果,深受喜爱甜食人的欢迎和好评。
同时甜叶菊糖甙还可用于罐头、水产类、蜜饯、果脯、糕点等生产,使之
实现低糖、低热量,满足人们的需求。
此外甜菊搪甙还可用于调味品、酒类制品中,改变其粘稠度,增加清凉感。
利用甜叶菊干叶与茶配比可制成甜叶菊茶,对糖尿病、肥胖症、高血压、龋齿等有防治作用。
甜叶菊糖用于口香糖、牙膏中,即可解决产品的甜味,又可降低口
腔内细菌的增值率,减少龋齿发生,符合国务院减少糖精用量的通知精神(史作清等1993,丁宁2005)
1.2.7.2甜叶菊干叶残渣在其他方面的应用
甜叶菊叶残渣属于工业废料,却是很好的有机肥料,有机质含量极高,含Ca2十和Fe2十,可改良培肥土壤。
其次,腐熟的甜叶菊叶残渣与基础基质配制成蔬菜育苗土,最适合香瓜、西瓜、柑桔、西红柿。
可促进幼苗生长发育,增加幼苗干鲜物质重、促进早熟、增加甜度,是很好的育苗基质,且成本低廉。
第三,甜叶菊叶残渣添加到栽培菌类培养料中,既可满足食用菌对养分的需要,又可满足食用菌对各种微量元素、维生素及透气性的要求,因而发菌快、出菌早、菌质好、产量高,尤其是银耳,长得又白又大;栽培金针菇,略带甜味,风味独特。
第四,甜叶菊叶残渣可以5%比例做禽类饲料,能起到预防禽类拉稀等疾病作用,调节禽类消化功能,并能提高产蛋率。
第五,甜叶菊叶残渣可掺到饲料里,用来喂奶牛、奶羊,可增加奶甜度,提高奶质量和奶中微量元素、氨基酸等物质,对产奶量有一定促进作用(丁
宁,2005)。
1.2.8甜叶菊糖昔的市场现状和发展前景
我国是一个缺糖的国家,目前食糖消费人均(年)不到7kg,距欧美国家人均40一60kg差距很大。
甜叶菊糖甙以其高糖度的优势缓解了我国食糖紧缺的问题。
用糖甙代替部分蔗糖不会降低产品质量,而且其成本比蔗糖低50%以上。
在东北地区甜叶菊甙养生长良好,昼
夜温差大,土壤肥力较好,含糖量高,品质较好。
甜叶菊宿根有一定的耐寒力,只要表根不裸露出地面可耐一12℃低温。
甜叶菊一般亩产干叶150一200kg,亩挣收入700元以上,最高亩产在黑龙江省海林境内可达300kg,亩收入可达1200元以上。
1990年我国甜叶菊糖甙出口量已达百吨,1993年甜叶菊糖甙出口量已逾300吨。
现在我国甜叶菊糖厂(车间)有20多家,年生产能力2000吨。
甜叶菊糖甙售价由每吨15万元上升至20万元以上,由此可见甜叶菊生产大有发展前途。
1.3甜叶菊糖甙生产中存在的不足及待深入研究的问题
甜叶菊糖甙不良风味的改良,甜叶菊糖甙有轻微的类似薄荷醇的苦涩味,持续后苦味主要由三萜内酯引起,这种成分是抑制亚硝铵(致癌物质)合成的有效活性物质,无论应用粗品或精品,均不影响其安全可靠性。
溶解甜叶菊糖水温越高,除后苦味效果越好,但甜度倍数
相对降低。
与柠檬酸、苹果酸、酒子酸、乳酸、有机酸、氨基酸合用时,对甜叶菊糖的后苦味有明显消杀效果,可起矫味作用,提高甜味质量。
廖德仲2004年研究报道了甜叶菊糖甙结构和甜味关系,并通过改变连接在甜叶菊糖甙分子上不同基团,达到改善甜叶菊糖甙不良风味的目的。
环状糊糖是最常用来掩盖不良风味的物质,对改善甜叶菊搪甙的不良风味也有效,其中8一环糊精可用来掩盖甜叶菊糖甙的苦味,y一环糊精可掩盖苦涩味,带盐环糊精可改善产品的整体风味。
甜叶菊糖普与多种物质混用时有较好的协同效果,可起到增加甜度或改善风味的作用。
与甜叶菊糖甙可混用的物质有甜味剂:
果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、异构化糖、蜂蜜、甘草、阿斯巴甜、乳酮糖、AK糖、山梨糖醇;酸味剂:
乳酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸;盐类:
氯化钾、氯化钠、乳酸钾、酒石酸钠:
氨基酸类:
丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸;其他物质:
淀粉、淀粉糖浆、环状麦芽糊精。
酶法改质甜叶菊糖甙就是利用生物技术将其现有的后苦味成份转化为口感清甜的成份,从而大大提高了原甜叶菊糖甙的品质和风味。
普通甜叶菊糖甙与糖在酶的作用下,在原分子结构骨架上,有选择地连接葡萄糖基,即形成搪化甜叶菊糖甙。
糖化甜叶菊糖甙由于没有甜叶菊糖甙那样的苦味,口感大大改善(丁宁,2005)。
2材料与方法
2.1原料与试剂
甜叶菊叶片
甜叶菊糖甙样品(哈尔滨绿叶科技有限公司)
甜叶菊糖甙St和RA标准品(日本和光株式会社)
大孔吸附树脂(AB一8)为西安蓝晓科技有限公司生产
其余试剂均为国产分析纯
2.2仪器与设备
KQ一300E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)
SHZ一循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)
MPLB型多参数化学发光分析测试系统(西安瑞迈电子有限公司)
UV-1600紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)
BT124S万分之一电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)
DK-98一1型电子恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)
高效液相色谱分析系统,1100型,所用检测器为示差检测器(上海天普分析仪器有限公司)
DHG一9140A型电热恒温鼓风干燥箱(上海益恒实验仪器有限公司)
R201系列旋转蒸发器(上海申生科技有限公司)
64R冷冻离心机(BeeKmanCoulter,lne)
冷冻干燥器((BeeKmanCoulter,lne)
玻璃层析柱(d5.0×80.0cm)
SBSZl00数控计滴自动部分收集器(上海沪西分析仪器厂)
2.3实验方法
2.3.1甜叶菊糖甙的提取
甜叶菊糖甙的浸提,通过比较实验采用蒸煮法,在1000mL的烧杯中加入自来水300mL(为原料的10倍),加热至沸,慢慢加入甜叶菊干叶30g。
轻轻搅拌使干叶完全浸泡在沸水中,然后蒸煮60min。
冷却到室温,过滤,得到150mL黑褐色提取液。
滤渣再连续提取2次(每次加200mL自来水,蒸煮20min)。
过滤后将3次提取液合并,总体积约300mL。
2.3.2甜叶菊糖甙的纯化
2.3.2.1甜叶菊糖甙的提纯
在收集的滤液加入沉淀剂FeSO4和Ca(0H)2在80℃恒温水浴40min至折光率不变,用Ca(0H)2调节溶液PH为10并继续搅拌20min,静止4h。
待静止后的浸提液冷却后抽滤得亮黄色滤液。
2.3.2.2甜叶菊糖甙的精制
将滤液通过装有大孔型吸附树脂(AB一8)的层析柱,甜叶菊糖甙几乎全部被树脂所吸附,不含有甜叶菊糖甙,弃掉滤液。
用70%的乙醇洗脱树脂(AB一8)所吸附的甜叶菊糖甙,到树脂由黄色变成白色为止,收集洗脱液吕将洗脱液通过阳离子交换树脂(001×14.5)进行脱盐,收集脱盐后的滤液。
将脱盐后的滤液通过阴离子交换树脂(D—280)进行脱色收集脱色后的滤液(刘石林等1995)。
2.3.2.3甜叶菊糖甙的浓缩
经脱色后的滤液近似无色,将其浓缩为原体积的l/3,得到较粘稠的液体,即为甜叶菊糖甙浓缩液。
2.3.2.4甜叶菊精甙的干燥与重结晶
将浓缩后的甜叶菊搪甙溶液放入不锈钢托盘中,在冷冻干燥器中进行冷冻干燥(4×10一2Pa,8h)得到淡黄色的甜叶菊糖甙。
采用不同的溶剂甲醇、乙醇、正丁醇将冷冻干燥后的淡黄色的甜叶菊糖甙进行溶解,并通过无水Na2SO4进行抽滤,将滤液倒入托盘中放在通风
橱中进行自然状态冷却结晶。
2.3.2.5甜叶菊糖甙的提取与结晶的工艺流程
甜叶菊干叶→水提取→过滤→沉淀剂处理→过滤→离子交换树脂→浓缩→有机溶剂溶解→过滤→结晶
2.3.3甜叶菊糖甙的分离
2.3.3.1重结晶法
称取甜叶菊糖甙提取后的结晶粉末0.1g,加入不同浓度的甲醇的水溶液,在70℃水浴加热溶解,4℃冷却48h,析出白色晶体,过滤得到黄色母液,测定晶体和母液含量和成分。
分别将母液和晶体溶解后的溶液继续加入不同浓度的甲醇水溶液重结晶,提纯样品。
2.3.3.2树脂法
将提取结晶的粉末0.1g加水溶解,配成1%(mg/ml)浓度的溶液,经过Al2O3层析柱层析,用70%的乙醇溶液洗脱,加热收集后的洗脱液去除乙醇,加水溶解,过硅胶层析柱层析后用等70%乙醇溶液洗脱,下边用数控计滴收集器收集。
2.3.4甜叶菊糖甙的检测
2.3.4.1薄层层析法(定性鉴别)
将甜叶菊糖甙样品点样于薄层板上,通过对展开条件的选择进行展层,显色或在紫外灯下观测。
2.3.4.2重量测定法
将甜叶菊糖甙样品在酸性溶液中与2,4一二硝基苯肼反应,生成沉淀,计算甜叶菊糖甙的含量。
2.3.4.3分光光度法(蒽酮为显色剂)
①、吸取经提取纯化后的样液2ml放入冷水浴中的比色管里,沿管壁缓缓加入10ml蒽酮试剂(暂不要摇匀,每批样品都要同时做空白参比样)。
②、待所有试液加完蒽酮试剂后,再逐一摇匀。
然后将比色管放入沸水浴中加热12分钟。
③、取出迅速用流动冷水冷却至约25℃。
④、以空白试样为参比将溶液在波长620nm处进行比色测定。
2.3.4.4分光光度法(ONS试剂为显色剂)
①、将0.1g甜叶菊叶片或粗甙溶于20而水中。
②、称6个空试管重,一个为空白,空白中不加样品,5个平行样。
③、向5个管内注400微升溶液,再加500微升DNS显色液。
④、70℃水浴15min
(糖具有还原性,DNS显色液为亮黄棕色具有氧化性,两者在水浴中反应,DNS变为深黄棕色)
⑤、拿出后,冷却。
⑥、再称重。
加水,使每个管重4g。
⑦、测吸光值。
2.3.4.5化学发光法
NaOH碱性介质中,K3Fe(CN)6和KMnO4氧化甜叶菊糖甙产生强的化学发光,以浓度和峰面积分别为横和纵坐标,绘制标准曲线。
线性范围为5.0、10-5一1.0×10-2g/ml,其回归方程为y(峰面积)360.8x(mg/mL-1)+286.3,r=0.9941,根据标准曲线方程计算甜叶菊糖甙样品含量。
2.3.5.甜叶菊糖甙的微生物研究
2.3.5.1甜叶菊糖甙的质量控制微生物检测方法
(l)培养基的制备
均是牛肉膏蛋白陈培养基(液体)
牛肉膏0.5g蛋白陈1.0g
氯化钠0.59蒸馏水100ml
培养条件:
37℃24h
(2)母液制备:
将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别按最佳培养基条件制备成菌母液。
①、在分析对象样品中提取甜叶菊糖甙,并制备成母液。
②、将甜叶菊糖甙溶液按倍数稀释于试管中,分别取同样体积的金黄色
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