浅论仙人掌对体外培养成纤维细胞生长增殖的影响.docx
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浅论仙人掌对体外培养成纤维细胞生长增殖的影响
浅论仙人掌对体外培养成纤维细胞生长增殖的影响
【摘要】目的:
观察仙人掌对体外培养成纤维细胞增殖的影响及其量-效关系。
方法:
以小鼠成纤维细胞株(NIH3T3)为研究对象,采用四氮唑盐(MTT)比色法测定仙人掌对成纤维细胞增生的影响(以OD值反映细胞活性),采用免疫细胞化学染色法检测成纤维细胞的增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。
结果:
在一定浓度范围内(~mg/mL),仙人掌能明显促进体外培养的成纤维细胞生长增殖,同时促进PCNA蛋白的表达,并随着仙人掌浓度的增加,成纤维细胞数量和PCNA蛋白的表达均不断增加,在mg/mL浓度时达到高峰,呈现明显的剂量-效应关系(r分别为,;P均)。
结论:
在一定浓度范围内,仙人掌具有促进体外培养成纤维细胞增殖的作用,并表现为明显的量-效关系。
【关键词】仙人掌;成纤维细胞;增殖
Abstract:
Objective:
ToexploretheeffectsofOpuntiaonfibroblastproliferationinvitroanditsconcentration-effectrelationship.Methods:
TheeffectsofOpuntiaonproliferationoffibroblastweremeasuredwithMTTcolorimetricassay,andPCNAproductionswereexaminedwithimmunocytechemistry.Results:
OpuntiacouldprovokefibroblastproliferationandincreasePCNAproteinexpressioninconcentrationrange~mg/mL.Furthermore,theeffectsexhibitedasignificantconcentration-dependentrelationship(r=,respectively,P).Conclusion:
Opuntiacanprovokefibroblastproliferationwithinacertainconcentrationrange,whichexhibitsasignificantconcentration-effectrelationship.
Keywords:
Opuntia;fibroblast;proliferation
仙人掌(Opuntia),又名神仙掌、老鸦舌、观音掌等,已经被用来治疗糖尿病、溃疡等症[1-2]。
仙人掌治疗胃溃疡的机制可能与成纤维细胞的增殖有关。
近几年来,虽然仙人掌的药理作用已成为医学热门研究方向,但有关仙人掌对体外培养的成纤维细胞增殖的影响未见报道。
本研究以体外培养成纤维细胞为实验对象,观察仙人掌对成纤维细胞生长增殖的影响及其量-效关系。
1材料和方法
材料小鼠成纤维细胞株(NIH3T3)购自上海肯强仪器有限公司,鼠抗人PCNA单克隆抗体及其他试剂均购自武汉博士德生物有限公司。
仙人掌干粉为鲜茎片80℃烘干制成,由福州日冕科技开发有限公司生产提供。
方法
药物处理:
将仙人掌粉溶于80℃左右蒸馏水中,制成不同浓度溶液,经1500r/min离心5min,取上清液,调节pH值为~,高压蒸汽灭菌20min,冰箱中(-18℃)保存备用。
采用四氮唑盐(MTT)比色法测定仙人掌对成纤维细胞增殖的影响:
取NIH3T3对数生长期细胞常规消化,调整细胞为5×104个/mL,以每孔104个细胞密度接种于96孔培养板中,37℃、5%CO2条件下培养。
细胞贴壁后随机分成6组,第1组只加入无血清DMEM50μL作为空白对照组;2~6组加入等量的用无血清DMEM配制的仙人掌干粉液,浓度分别为:
、、、、1mg/mL。
37℃5%CO2条件下培养48h,吸出培养液,各孔加入20μL的MTT液(以不含血清的DMEM高糖培养基配置,浓度为5mg/mL),继续培养4h,小心吸弃培养液,加入150μL二甲基亚砜(DMSO),振荡10min,使结晶物充分溶解。
应用酶标仪490nm处测定各孔的吸光值(OD值)。
免疫细胞化学技术测定仙人掌对成纤维细胞表达增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)的影响:
将NIH3T3细胞接种于含玻片的12孔板中培养24h,细胞贴壁后第1组只加无血清DMEM作为空白对照组;第2~第6组加入等量的用无血清DMEM配制的仙人掌干粉液,浓度分别为、、、、1mg/mL。
培养48h后撤药,加入含体积分数20%胎牛血清的DMEM液继续培养24h,取出长有细胞的玻片固定,用鼠抗人细胞PCNA单克隆抗体作第一抗体,SABC法行免疫细胞化学染色。
显微镜(×400)下计数100个细胞数,计算阳性细胞(棕黄色染色)数占细胞总数的比率。
具体操作过程严格按试剂盒说明书进行。
同时设空白对照试验:
用PBS代替一抗,余步骤同上。
统计学处理方法组间比较用One-WayANOVA分析后,采用Student-Newman-Keuls检验。
相关分析采用Bivariate过程的Pearson相关分析法。
2结果
仙人掌对成纤维细胞增殖的影响在一定浓度范围内(~mg/mL),仙人掌能明显促进体外培养的成纤维细胞生长增殖,在mg/mL浓度时达到高峰,并随着仙人掌浓度的增加,成纤维细胞数量也不断增加,表现为明显的剂量-效应关系(r为,P)。
但是当仙人掌浓度达到1mg/mL时,不影响成纤维细胞生长增殖,见表1。
免疫细胞化学技术测定仙人掌对成纤维细胞表达PCNA的影响一定浓度范围内(~mg/mL)的仙人掌能明显促进体外培养的成纤维细胞PCNA蛋白的表达,在mg/mL浓度时达到高峰,并表现为明显的剂量-效应关系,即随着仙人掌浓度的增加,其表达量不断增加(r为,P)。
但是当仙人掌浓度达到1mg/mL时,不影响PCNA蛋白的表达,见表2。
3讨论
仙人掌作为天然中草药,具有作用范围广、副作用小等优点,其化学成分复杂,含有有机酸类、甾醇类、黄酮类、生物碱类、糖类和萜类。
其中的黄酮含量较高,且主要以芦丁和槲皮素为主,干物质中总量达到了%,其中芦丁含量达%,槲皮素含量达%。
芦丁、槲皮素具有维持毛细血管通透性,防止血细胞凝集,降血脂,抗氧化等多种生物活性;仙人掌还富含钾、钙、铜、铁、锰、锌等营养元素及果胶。
仙人掌的药用价值最先记载于清代赵学敏所着的《本草纲目拾遗》中,其功能有行气活血、清热解毒、消肿止痛、健脾止泻、安神利尿,可内服、外用治疗多种疾病。
近几十年国内外的研究表明,仙人掌提取液具有抑菌、降血糖、降血压、抗肿瘤、提高免疫机能等多种药理作用。
成纤维细胞是创伤修复最主要的细胞。
创伤后,成纤维细胞发生增殖、迁移,并合成、分泌胶原蛋白和细胞外基质(蛋白质和蛋白多糖)成分,参与肉芽组织形成、创口收缩及组织重建的过程,其数量变化会对创伤愈合产生巨大影响。
本研究表明,在一定浓度范围内(~mg/mL),仙人掌能明显促进体外培养的成纤维细胞生长增殖,并表现为明显的量-效关系,即随着仙人掌浓度的增加,成纤维细胞数量也不断增加,在mg/mL时达到高峰。
增殖细胞核抗原(PCNA)亦名细胞周期蛋白,是与细胞周期相关的核蛋白,它被认为是真核细胞内DNA聚合酶δ的一种辅助蛋白。
PCNA直接参与DNA的合成,在静止期细胞内含量很低,自G1晚期逐渐增加,到S期其量达到高峰。
PCNA的免疫定位已成为检测细胞增殖活性最有效的标志之一[8-9]。
在本实验中,一定浓度范围内(~mg/mL)的仙人掌能明显促进体外培养的成纤维细胞PCNA蛋白的表达量,并表现为成纤维细胞增殖一致的量-效关系,在mg/mL浓度时亦达到高峰,表明仙人掌在一定浓度范围内可以促进机体合成PCNA,加快细胞的增殖。
但有研究报道,在活体实验中,仙人掌提取物具有降低兔耳腹侧增生性瘢痕组织块中Ⅰ型胶原蛋白表达,促进Ⅲ型胶原蛋白表达;同时使基质金属蛋白酶-1(MMP-1)表达升高,加速Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的降解,从而减轻瘢痕增生,促使已形成的增生性瘢痕组织块软化、吸收[10]。
我们在本研究中也发现,当仙人掌浓度达到1mg/mL时,将不影响成纤维细胞生长增殖和PCNA蛋白的表达,但未发现其抑制作用。
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[10]方荃,马少林,董祥林.仙人掌提取物对兔耳增生性瘢痕组织
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