胶原蛋白的提取.docx
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胶原蛋白的提取
目录
英文缩写对照表………………………………………………………………………1
中文摘要………………………………………………………………………………2
英文摘要………………………………………………………………………………4
1前言…………………………………………………………………………………6
2材料…………………………………………………………………………………6
2.1主要仪器设备……………………………………………………………………6
2.2实验动物…………………………………………………………………………7
2.3样品与试剂………………………………………………………………………8
2.4常用工作液………………………………………………………………………8
3方法…………………………………………………………………………………9
3.1CPⅠ的制备………………………………………………………………………9
3.1.1粗提法…………………………………………………………………………9
3.1.2高效液相色谱分离纯化……………………………………………………10
3.2CPⅠ的理化性质鉴定…………………………………………………………10
3.2.137OC凝结试验………………………………………………………………11
3.2.2紫外吸收值测定……………………………………………………………11
3.2.3氨基酸组成和含量分析……………………………………………………11
3.2.4蛋白质浓度测定……………………………………………………………11
3.2.5SDS-PAGE凝胶电泳…………………………………………………………12
3.2.6RP-HPLC分析CPⅠ…………………………………………………………12
3.2.7生物安全性实验……………………………………………………………13
3.3CPⅠ防止UVA氧化损伤实验…………………………………………………14
3.3.1L929细胞的培养、冻存与复苏………………………………………………14
3.3.2UVA对L929细胞活性的影响………………………………………………14
3.3.3CPⅠ对细胞UVA氧化损伤的保护作用……………………………………14
4结果………………………………………………………………………………16
4.1CPⅠ的制备……………………………………………………………………16
4.2CPⅠ的理化性质鉴定…………………………………………………………16
4.2.137OC凝结试验………………………………………………………………16
4.2.2紫外吸收值测定……………………………………………………………16
4.2.3CPⅠ氨基酸组成和含量分析………………………………………………17
4.2.4蛋白质浓度测定……………………………………………………………18
4.2.5SDS-PAGE凝胶电泳…………………………………………………………19
4.2.6RP-HPLC分析CPⅠ…………………………………………………………19
4.2.7生物安全性试验……………………………………………………………20
4.3CPⅠ防止UVA氧化损伤实验…………………………………………………22
4.3.1UVA对L929细胞活性的影响………………………………………………22
4.3.2CPⅠ对细胞UVA氧化损伤的保护作用……………………………………22
5、讨论………………………………………………………………………………25
5.1CPⅠ的制备……………………………………………………………………25
5.1.1提高CPⅠ得率的因素………………………………………………………25
5.1.2提高CPⅠ纯度的因素………………………………………………………26
5.1.3高效液相色谱是分离纯化CPⅠ的有效途径………………………………27
5.2CPⅠ的理化性质鉴定…………………………………………………………27
5.2.1CPⅠ在223nm处有紫外最大吸收值………………………………………27
5.2.2CPⅠ氨基酸组成及含量分析………………………………………………27
5.2.3SDS-PAGE鉴定………………………………………………………………28
5.2.4RP-HPLC分析CPⅠ…………………………………………………………28
5.2.5CPⅠ具有生物安全性………………………………………………………28
5.3CPⅠ防止UVA氧化损伤研究…………………………………………………29
5.3.1UVA对成纤维细胞有活性有抑制作用……………………………………29
5.3.2CPⅠ能够降低UVA氧化损伤的细胞MDA活性…………………………30
5.3.3CPⅠ能够提高UVA氧化损伤细胞的GSH-px活性………………………30
小结…………………………………………………………………………………31
参考文献……………………………………………………………………………32
文献综述胶原蛋白的研究进展…………………………………………………37
致谢…………………………………………………………………………………46
英文缩写对照表
英文缩写
英文名称
中文名称
CPⅠ
CollagenproteinⅠ
Ⅰ型胶原蛋白
A
Absorbance
吸光值
BPB
Bromophenolblue
溴酚蓝
ddH2O
Doubledistilledwater
双蒸水
PBS
Phosphatebufferedsaline
磷酸盐缓冲液
SDS-PAGE
SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis
聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS
Sodiumdodecylsulfate
十二烷基磺酸钠
Tris
Tris(hydroxymethyl)aminomethane
三(羟甲基)氨基甲烷
TEMED
N,N,N’N’-tetramethylethylenediamine
N,N,N’N’-四甲基乙二胺
DMSO
Dimethylsulphoxide
二甲基亚砜
CBB
CoomassieBrillantBlue
考马斯亮蓝
MTT
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5
-diphenyltetrazoliumbromide
噻唑蓝
HPLC
Highperformanceliquidchromatography
高效液相色谱
UVA
UltravioletradiationA
长波紫外线
MDA
Malondialdehyde
丙二醛
GSH-px
Glutathioneperoxidase
谷胱甘肽过氧化物酶
Ⅰ型胶原蛋白的制备、鉴定及其
抗UVA氧化损伤作用的初步研究
学科专业:
动物学研究方向:
生化制药指导教师:
魏泓教授研究生:
王琳(2001345)
内容摘要
本文围绕Ⅰ型胶原蛋白(CPⅠ)的制备及其理化性质进行研究,同时在其防止长波紫外线(UVA)对细胞的氧化损伤方面进行了初步探索,为CPⅠ的进一步研发提供理论基础和科学依据。
以猪皮为材料,比较酸溶法、酶解法、中性盐溶液法三种粗提方法,选择得率和纯度都较高的酶解法为最佳粗提法,结合高效液相色谱进行CPⅠ的分离纯化。
CPⅠ理化性质鉴定结果表明:
样品在223nm处有紫外最大吸收值;含有十八种氨基酸,氨基酸总量在90%以上;样品的蛋白质浓度为1.03mg/ml;SDS-PAGE测定CPⅠ由α、β、γ三条链组成;色谱分析纯度约为100%。
通过小鼠急性毒性试验、豚鼠致敏试验、细胞毒性试验对自制CPⅠ进行整体水平和细胞水平的生物安全性评价,观察期内,小鼠未见异常毒性反应;豚鼠注射点无红斑及水肿情况;细胞毒性小于Ⅰ级,结果证明本方法制备的CPⅠ无毒副作用。
评价CPⅠ对UVA氧化损伤的L929细胞的保护作用。
结果表明:
随着UVA照射时间的延长,细胞的活性明显降低,说明UVA对细胞的氧化损伤是明显的,其中表现为MDA的含量升高、GSH-px的含量降低。
加入不同浓度的CPⅠ后照射同样的时间,MDA的含量有所下降、GSH-px的含量有所升高,其中50%CPⅠ组的效果极为显著(P﹤0.01)。
提示该物质有防止UVA氧化损伤的作用。
综上所述,利用酶解和高效液相色谱制备相结合的方法可以从猪皮中分离纯化CPⅠ,该方法具有高效性,高选择性和易放大性;理化性质鉴定及生物安全性试验表明,该物质为纯活性胶原蛋白,无毒副作用;同时对体外细胞的UVA氧化损伤具有较好的保护作用。
关键词:
Ⅰ型胶原蛋白;高效液相色谱;制备;鉴定;氧化损伤
Studiesonthepreparation,identificationofCPⅠanditsprotectiveeffectoncellsdamagedbyUVA
Major:
BiologySpeciality:
Zoology
Tutor:
Prof.WeiHongAuthor:
WangLin(2001345)
Abstract
Inthispaper,howtoprepareCPⅠandidentifyphysico-chemicalpropertyhadbeenstudied,andUVAoxidativedamageL929wasperliminarydiscussed.Thesedatasprovidedtheoreticfoundationandscientificproofforfurtherresearchanddevelopmentofthisproduct.
Pigskinwasusedasmaterial.Accordingtothecomparationamongthethreekindsofcrudeextractionmethodsincludingaciddissolve,enzymolysisandneutralsaltsolution.ThemethodofenzymolysiscombinedwithHPLCwaschosentoprepareCPⅠ.
Thephysico-chemicalpropertyofCPⅠwasidentified.Theresultsshowedthat:
CPⅠshowedcharacterabsorptionpeakat223nm;CPⅠhad18kindsofaminoacids,totalcountofaminoacidwasmorethan90%;theconcentrationofproteinwas1.03mg/ml;CPⅠwascomposedofαchain,βchainandγchainbySDS-PAGE;OnepurepeakwithHPLCwasfoundedanditspuritywas100%.ThesecurityofCPⅠaccordingtotheexperimentsofmiceaccutetoxicitywasevaluated,Guineapigsensitizationandcytotoxicityexperimentinintegerlevelandcelllevel.Itwasshowedthat:
themicehadnotoxicreaction;theGuineapig’spointsofinjectionhadnoerythemaanddropsy;thecytotoxicitywaslowerthanⅠclass.TheresultsprovedthatCPⅠhadnopoisonsideeffects.
CPⅠpreventedUVAfromoxidativedamagingL929wasstudied.Theactivityofcellsbecameweakerandweakerwithexposuretime.ItwasconspicuousthatUVAdamagedtheactivityofcells.ThecontentsofMDAupgradedandthecontentsofGSH-pxdegraded.WhenaddingdifferentconcentrationofCPⅠ,thecontentsofMDAdecreasedandthatofGSH-pxincreased.Theeffectof50%concentrationgroupwasextremelyremarkable(P<0.01).ItshowedthatCPⅠcancounteractoxidativedamagefromUVA.
Inconclusion,themethodofenzymolysiscombinedwithHPLCtoextractCPⅠfrompigskinwasproposed.Thismethodshowedtheadventagesofhighperformance,highselectivityandeasilyamplification.Acoordingtotheexperimentsofidentifyingthephysico-chemicalpropertyandthebiosafetyofCPⅠ,itwasconcludedthatCPⅠhadhighbioactivityandnotoxicityeffect,andthatCPⅠhadtheabilitytoprotectcellsfromoxidativedamnification.
.
Keywords:
CPⅠ,highperformanceliquidchromatography,physico-chemicalproperty,identification,oxidativedamnification
1前言
Ⅰ型胶原蛋白(CollagenProteinⅠ)是一组由多种糖蛋白组成的大家族,不仅具有合成高分子不可比拟的生物相容性、生物降解性和抵抗原性[1],而且具有一系列重要的生物学功能,如:
具有明显的提高人体免疫功能与改变心肌功能作用;保护胃粘膜以及抗溃疡作用;抗过敏作用;抑制血压上升作用;其中某些特殊氨基酸还具有防癌作用[2]。
因此Ⅰ型胶原蛋白在生物医学材料、美容保健、药物缓释等诸多领域具有良好的应用前景。
Ⅰ型胶原蛋白由于其结构复杂,生物学特性各异,因此从生物组织中纯化Ⅰ型胶原蛋白比较困难。
关于Ⅰ型胶原蛋白的分离纯化工作,国内相关报道不多,常见的提纯方式只是简单的利用一步柱层析进行[3],此方法存在生产周期长、分离效率低、产物纯度不高等缺点。
长的分离周期和低的分离效率不仅增加了胶原蛋白的生产成本,而且使很多资源无法得到有效的利用。
本文在此基础上对制备工艺进行改进,使用酶解和高效液相色谱相结合的方法,从猪皮中分离纯化Ⅰ型胶原蛋白。
高效液相色谱具有操作条件温和,选择性高,批处理量大和操作自动化等优点[4],是分离纯化胶原蛋白的有效方法。
本文探索了Ⅰ型胶原蛋白的提取方法,为其高效制备工艺的形成提供有力的技术依据。
近年来由于臭氧层的破坏而使长波紫外线辐射增强,长期的紫外线辐射会导致皮肤老化,黑色素瘤及多种皮肤癌等病变[5-8]。
自由基抑制剂或清除剂能防止紫外线的氧化损伤,保护皮肤,延缓皮肤衰老[9][10]。
以往的研究多是集中于天然植物提取物的抗氧化作用,而对动物活性物质抗氧化作用的研究少见报道。
本文在建立UVA氧化损伤L929细胞模型的基础上,探索Ⅰ型胶原蛋白防止UVA氧化损伤的作用和机理,为具有抗UVA氧化损伤作用的活性物质的开发开辟新的领域。
因此,本文选取Ⅰ型胶原蛋白作为研究对象,通过对Ⅰ型胶原蛋白的提取分离、理化性质及生物功能的研究,为Ⅰ型胶原蛋白产品的深入开发提供必要的技术支持。
2材料
2.1主要仪器设备
CR22G型高速冷冻离心机,日本HITACHI株式会社;
FTS系列冻干机,Dupont公司;
79型控温多用高速组织捣碎机,江苏江阴科研器械厂;
BD-462型冰柜、SC-320型冷藏箱,青岛澳柯玛股份有限公司;
LS-B501型立式圆形压力蒸汽灭菌器,上海医用核子仪器厂;
电泳仪,美国BIO-RAD公司;
QPLS-22型不锈钢绞肉机,江苏丹徒县纪庄食品机械铸件厂;
ZT-2000型圆筒式过滤器,绍兴市卫星医疗设备制造有限公司;
UV751,GD紫外/可见光分光光度计,上海分析仪器厂;
SPX250B型系列生化培养箱,上海跃进医疗器械厂;
PB310S型电子天平,北京赛乌利斯有限公司;
LAC214型电光分析天平,常熟市衡器厂;
HHS-8S电热恒温水浴锅,上海天平仪器厂;
B5060型二氧化碳培养箱,美国HERAEUS公司;
COTC型倒置显微镜,重庆光学仪器厂;
紫外线灯管(UVA),北电光源研究所;
SXK-103型超净工作台,安徽省蚌埠净化设备厂;
超声波细胞粉碎机,宁波东芝生物技术有限公司;
550型酶标仪,美国BIO-RAD公司;
HP-1100型高效液相色谱仪,Agilent公司;
ZORBAX300SB-C18半制备色谱柱(9.4mm×25cm),Agilent公司;
HypersilODSC18分析柱(4.0mm×250mm),Agilent公司;
FC203B馏分收集仪(FractionCollector),美国Gilson公司;
8453E型紫外分光光度系统,Agilent公司;
高速氨基酸自动分析仪,6300黄金系统,美国贝可曼公司;
2.2实验动物
2.2.1豚鼠
英国种封闭群,普通级,健康,雌雄均可,体重250~350g,试验前及试验后的观察期内,均应按正常饲养条件饲养,做过本试验的动物不得重复利用。
由第三军医大学实验动物中心提供。
2.2.2小鼠
昆明(KM)小鼠,普通级,健康,6~8周龄,18~22g,合格证号:
310101014,由第三军医大学实验动物中心提供。
2.3样品与试剂
市售猪皮;
NIH3T3细胞,L929细胞,由第三军医大学免疫教研室提供;
Ⅰ型胶原蛋白对照品,Sigma公司;
胃蛋白酶(1:
2500),Sigma公司;
胰蛋白酶,Sigma公司;
甲醇,Merck公司;
羟脯氨酸对照品,南京建成生物工程研究所;
DMEM培养基干粉,美国GIBCO公司;
小牛血清,兰州民海生物工程公司;
丙烯酰胺,Tianjin,H&Y.Bio,Co;Ltd;
甲叉双丙烯酰胺,Tianjin,H&Y.Bio,Co;Ltd;
TEMED,PromegaCorporation;
考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒,南京建成生物工程研究所;
MTT,Sigma公司;
DMSO,上海生工有限公司;
分子量蛋白Marker,上海生物化学研究所;
MDA活性检测试剂盒,南京建成生物工程研究所;
GSH活性检测试剂盒,南京建成生物工程研究所;
其它试剂均为国产分析纯。
2.4常用工作液
D-Hank’s溶液:
将NaCl8.0g,KCl0.4g,KH2PO40.06g,NaHCO30.35g,Na2HPO4.7H2O0.06g,酚红0.02g,加ddH2O至1000ml溶解,0.07Mpa高压灭菌15min。
双抗储备液:
将青霉素100万单位,链霉素100万单位溶于10mlddH2O,即为每毫升含青霉素10万单位,链霉素10万单位的双抗储备液,-20OC保存。
DMEM培养液:
DMEM培养基干粉10g,双抗储备液1ml,NaHCO32.0g,用三蒸水溶解,定容至1000ml。
溶液用5.6%NaHCO3调pH至7.2左右,不锈钢滤器除菌分装,此为不完全DMEM培养液,加入20%小牛血清后为完全DMEM培养液,-20OC保存。
胰蛋白酶液:
将0.25g胰蛋白酶粉末溶于100ml的PBS中,即为0.25%胰蛋白酶液。
丙烯酰胺单体贮液:
将14.55g丙烯酰胺和0.45g甲叉双丙烯酰胺溶解于40ml的ddH2O中,搅拌直到溶液变成透明,再加ddH2O至50ml,过滤,装入棕色瓶,4OC可保存一个月。
浓缩胶缓冲液贮液(1mol/LTris-HCL,pH6.8):
将6.06gTris溶解在40ml的ddH2O中,用4mol/LHCL调节pH至6.8,再加ddH2O至50ml,4OC保存。
分离胶缓冲液贮液(1.5mol/LTris-HCL,pH8.8):
将9.08gTris溶解在40ml的ddH2O中,用4mol/LHCL调节pH至8.8,再加ddH2O至50ml,4OC保存。
10%SDS溶液:
将25gSDS溶解在250mlddH2O中,室温保存。
10%过硫酸铵溶液:
将0.1g过硫酸铵溶解在1mlddH2O中,使用前新鲜配置。
10%TEMED溶液:
将0.1ml的TEMED溶解在0.9mlddH2O中,-20OC保存。
电泳缓冲液:
将3gTris、14.4g甘氨酸、1gSDS溶解在1LddH2O中,调节pH至8.3左右,室温下保存。
样品缓冲液:
将0.6ml的1mol/LTris-HCL(pH6.8)、5ml50%的甘油、2ml10%的SDS溶液、0.5ml的β-巯基乙醇和1ml的1%溴酚蓝混合,加ddH2O至10ml,4OC保存。
染色液:
0.29g考马斯亮兰R-250溶于250ml脱色液中。
脱色液:
50ml乙酸和165ml甲醇,加ddH2O至1L。
3方法
3.1Ⅰ型胶原蛋白(CPⅠ)的制备
Ⅰ型胶原在皮肤中含量丰富。
本实验选择猪皮作为提取材料,分别用酸溶法、酶解法及中性盐溶液法来粗提CPⅠ。
3.1.1粗提法
3.1.1.1酸溶法
前处理:
称取新鲜猪皮100g,用氯仿/乙醇(2:
1)溶液对其进行脱脂后切除皮下脂肪,去毛并细切。
将用蒸馏水洗涤后的组织小块放入高速组织捣碎机中捣碎成糊状(12000r/min),用含4.5mol/LNaCl的0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.5)充分洗涤以去除脂质及血清等成分,低温离心(8000r/min,30min,4OC)。
抽提:
将沉淀用含0.45mol/LNaCl的0.05mol/LTris-HCl缓冲液在4OC下反复抽提,以去除非胶原杂蛋白。
用蒸馏水反复洗涤。
然后在
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