微生物的培养与生长.docx

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微生物的培养与生长

第四章微生物的培养与生长

所有生物为了生存都必须不断地从外界环境中吸收所需的各种物质从中获得原料和能量以便合成新的细胞物质，生物所需的这些物质称之为营养物质。

生物吸收利用营养物质的过程一般称为营养。

营养物质是生物进行一切生命活动的物质基础，失去这个基础，一切生物都无法生存，微生物也不例外。

可见，营养对微生物的重要性。

第一节微生物的营养

一、微生物细胞的化学组成

分析微生物细胞化学组成是了解微生物营养物质的基础。

主要成分：

C、H、N、O和无机成分。

其中主要是水分、蛋白质、碳水化合物、脂肪、核酸和无机盐。

水分占90-97，其余占3-10%。

二、营养物质及其生理功能

微生物所需的营养物质，主要包括碳素化合物、氮素化合物、水分、无机盐类和生长素。

这些物质对微生物的生命活动主要有三方面的作用：

（1）、供给微生物合成细胞物质的原料；

（2）、合成代谢和生命活动所需的能量；

（3）、调节新陈代谢。

（一）、碳源

碳源主要用来供给菌体生命活动所需的能量，构成军菌体细胞及代谢产物。

常用的碳源有：

糖类、脂肪和某些有机酸、部分醇类。

在某些特殊情况（如碳源贫乏），蛋白质水解产物或氨基酸等也可以被某些菌种作为碳源使用。

由于菌种所含煤系统并不完全相同，所以，各种菌能利用的碳源亦不相同。

葡萄糖、麦芽糖、乳糖等单糖和双糖是绝大部分细菌、酵母菌、放线菌及霉菌可利用的碳源，大多数霉菌、放线菌和部分细菌可直接利用糊精和淀粉作为碳源。

（二）、氮源

氮源主要用来构成菌体细胞物质（如氨基酸、核酸、蛋白质）和含氮代谢产物。

常用的氮源可分为两类：

有机氮源和无机氮源。

黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、鱼粉等属于有机氮源；氨水、硫酸铵、尿素、硝酸钠、硝酸铵和磷酸氢二铵等为无机氮源。

（三）、水

水是微生物体内外的溶媒，只有通过水，微生物所需要的营养物质才能进入细胞，也只有通过水其代谢产物才能排出体外。

另外，水也可以直接参加代谢作用，如蛋白质、碳水化合物和脂肪的水解作用都是在水参与下才能进行的。

（四）、无机盐

无机盐也是微生物生长所必不可少的营养物，其中又可分为主要元素和微量元素两大类。

主要元素微生物需要量大，有P、S、Mg、K、Ca、Na等，它们参与细胞结构物质的组成，有调节细胞质pH值和氧化还原电位的作用，有能量转移、控制原生质胶体和细胞透性的作用。

微量元素有Fe、Cu、Zn、Mn、Co等，它们的需要量虽然极微，但往往强烈地刺激微生物的生命活动。

它们或是酶活性基的组成成分或酶的激活剂。

（五）、生长因子

有些微生物在含有碳源、氮源、无机盐的培养基中仍不能正常生长，如在培养基中加入某种组织（或细胞）提取液时，则微生物生长良好，说明这种组织中含有某些微生物生长所需的生长因子。

凡是微生物生长所不可缺少的微量有机物都称为生长因子。

包括维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶及其衍生物。

这些物质之所以称之为生长因子，是由于某些微生物自己不能合成之，必须由外界提供。

它不是一切微生物所必需的。

第一类是不需要外源供给的微生物，像自养型细菌和广泛分布的一些腐生性细菌和霉菌，它们自己可以合成这些物质，以满足自身的需要。

第二类是缺乏自制一种或两种能力的微生物，如金黄色葡萄球菌需要硫胺素，根瘤菌需要生物素。

这类微生物中有些种类，当外界供给所需要的前体物质，亦能满足需要。

第三类为对多种维生素、氨基酸、碱基都缺乏合成能力的微生物，在培养基中提供水解蛋白质和织物组织液才能生长（如麦芽汁、酵母汁）。

维生素作为酶的活性基团起催化作用。

氨基酸是组成蛋白质的结构物质，嘌呤、嘧啶是合成核苷酸的主要物质。

三、微生物的营养类型

由于各种微生物的生活环境和对物质的利用能力不同，它们对营养的需要和代谢方式也不尽相同，根据微生物所需要的营养和能量的不同，尤其是碳素营养来源的不同，可把它们分成自养微生物和异养微生物两大类。

自养型微生物：

能利用简单的无机物作为营养物质进行生长繁殖，能以CO2或碳酸盐为碳源，以氨或硝酸盐为氮源，在体内合成有机物，不需要外界供给有机物。

异养型微生物：

只能用现成的有机物作为碳源，如单糖、双糖、淀粉、纤维素、有机酸等，另外，根据能量来源不同，又可分为两种类型。

即光能营养型和化能营养型。

光能营养型能利用光能。

化能营养型是来自物质氧化过程释放的能量。

根据碳素来源和能量来源可分四种类型。

（1）、光能自养型：

这类微生物利用日光作为其生活所需的能源，利用CO2作为碳源，以无机物为供氢体来还原CO2,合成细胞有机物质。

如蓝细菌（光合细菌）。

（2）、光能异养型：

有少数微生物种类具有光合色素，能利用光能把CO2还原为碳水化合物，但必须以某种有机物为CO2同化中的供氢体。

如红螺菌属利用丙醇作为供氢体，积累丙酮。

（3）、化能自养型：

能利用氧化无机物时产生的能量，把CO2还原成有机碳水化合物。

如硝化细菌、铁细菌等。

（4）、化能异养型：

能源来自有机物的氧化或发酵产生的化学能，以有机物为碳源，以有机或无机氮为氮源。

这类微生物的种类最多。

四、微生物对营养物质的吸收方式

微生物对营养物质的吸收取决于细胞膜的结构和生物功能。

细胞膜是一层具有高度选择性的半透膜，控制营养物质及代谢产物的进出细胞。

细胞膜上有丰富的酶，这些酶与物质的吸收和排泄有关。

微生物对营养物质吸收的机制有四种：

1、被动扩散：

由高浓度向低浓度扩散。

2、助长扩散：

有载体蛋白参加。

3、主动运输：

从低浓度向高浓度扩散，需要能量和载体蛋白。

4、基因转移：

通过磷酸化转移。

五、培养基

微生物的生长和繁殖需要一定的营养物质，根据微生物对营养物质的需要，经过人工配制适合比同微生物生长、繁殖或积累代谢产物的营养基质就成为培养基。

培养基的主要用途为：

促使微生物生长与繁殖，用于微生物纯种分离、鉴定和制造微生物制品等。

（一）、培养基的类型

由于各种微生物所需要的营养物不同，所以培养基的种类也有很多种，估计可有数千种之多，但大致可以分为以下几类。

1、根据营养物质来分

（1）、合成培养基：

是由已知化学成分及数量的化学药品配制而成的。

这种培养基成分精确，重复性强。

但价格高，一般多用于实验室内供研究有关微生物的营养、代谢、分离和鉴定生物制品及选育菌种用。

（2）、天然培养基：

采用化学成分还不十分清楚或化学成分不恒定的天然有机物，可用组织提取液等。

如牛肉膏、酵母膏、麦芽汁、蛋白胨、牛奶、血清等。

玉米粉、马铃薯配制方便、经济，运用于实验室和生产。

（3）、半合成培养基：

在天然有机物的基础上，加入一些化学药品，以补充无机盐成分，使其更能充分满足生长需要。

该培养基是使用最多的培养基。

2、根据培养基物理性状分

（1）、固体培养基：

在液体培养基中加入2%琼脂，成为固体状，用于菌种保藏、分离、菌落特征观察、计数等。

（2）、液体培养基：

一般用于生产。

（3）、半固体培养基：

加入0.35%-0.40%琼脂。

3、根据培养基的用途来分

（1）、基础培养基：

满足一般微生物生长需要的营养物质。

（2）、加富培养基：

在培养基中加入额外的营养物质，使某些微生物在其中生长，而不适合其它微生物生长。

通常加入血、血清、动植物提取液。

（3）、选择培养基：

在培养基中加入某些化学药品以抑制不需要的微生物生长，而促进需要的微生物生长，往往加入一些抑菌剂或杀菌剂。

（4）、鉴别培养基；根据微生物能否利用培养基中的某种成分，依靠指示剂的颜色反应，借以鉴别不同种类的微生物。

（二）、培养基配制的原则

1、根据微生物的营养要求配制；

2、注意营养成分的比例；

3、培养基的pH值；

4、氧化还原电位。

第二节微生物的生长

一、微生物的生长

微生物在适宜的环境中，按照自己的代谢方式，不断地吸收营养物质，进行新陈代谢，即进行同化作用和异化作用。

如果同化作用大于异化作用，细胞会增大，细胞的体积逐渐增加，这就是生长。

细胞的生长有一定限度的，当增到一定限度时，细胞就开始分裂，形成两个基本相似的子细胞，子细胞又可重复进行生长和分裂。

细胞分裂形成子细胞，使个体数目增加，这就是分裂。

从生长到繁殖的过程也就是由量变到质变的发展过程，这一质变过程叫发育。

微生物在比较合适的条件下，能正常生长和繁殖。

当环境发生某些变化，此变化超过了微生物能适应忍受的程度时，微生物的生命活动就会受到抑制而发生变异，甚至死亡。

细菌的生长的标志：

以群体数目的增加作为生长标志。

因为很难将生长与繁殖分开。

放线菌和霉菌：

是以菌丝的伸长和分枝表现为生长的。

对于微生物的应用，不论是在食品和其他方面的应用，主要是利用它的菌体，及其产生的代谢产物和酶类，而这与微生物的生长是密切相关的。

所以了解和掌握微生物的生长特性是很有必要的。

二、微生物的纯培养

目的是从混杂状态中纯化分离细菌，是研究利用微生物的基础，通常采用以下方法：

1、稀释平板法；

2、划线法；

3、单细胞分离法；

4、选择培养基分离法。

此部分试验指导中也有，在此简单介绍。

三、微生物生长的测定

（一）、单细胞的微生物是指细菌和酵母菌等，它们的生长量不是测定细胞大小，而是测定群体增长量。

方法如下：

1、全数测定

所谓全数测定，即是培养一定时间后测定细胞的总数。

其数量既包括活的细胞，也包括死的细胞。

（1）、计数器法：

采用血球计数板。

（2）、染色涂片计数法：

取定量菌液将其涂布于1cm2的面积内，染色、镜检、计数。

（3）、比浊法：

是测定菌液中细胞数的快速方法，原理是菌液中细胞量越多，浊度越大。

用未知细胞数的菌液和已知细胞数的菌液相比，来求出未知细胞数菌液中的细胞数。

2、活菌计数法：

测定活菌数。

（1）稀释平板法：

取待测的细胞悬液作一系列的稀释，稀释级数越高，稀释液中含细胞数愈少，也就越易在培养皿上显出单个菌落。

（2）、液体稀释培养法：

采用统计学原理进行测定，如大肠菌群的测定，采用此方法。

（二）、多细胞微生物生长的测定

以菌丝生长的长度或菌丝增加的重量作为生长指标。

最简单的方法是将酶菌接种在培养皿内固体培养基中央，在一定时间内测定菌落的直径或面积。

对生长速度快的霉菌，可每24h测量一次。

可求出菌丝的平均生长速度。

（三）、细胞物质的测定

测量活菌或死菌。

1、干重法：

过滤或离心，烘干称重。

2、含氮量法：

细胞的蛋白质含量比较稳定。

而氮又是蛋白质的重要组成。

因此，测定微生物细胞的含氮量来表示其生长情况。

四、生长曲线

是指细菌等单细胞微生物，以细胞增长数的对数值为纵坐标，以培养时间为横坐标作图时，可以绘出一个曲线，此曲线称为生长曲线。

细菌纯培养的生长曲线：

由于细菌各个时期生长繁殖速度不同，所以，生长曲线又可分为延迟期、对数期、稳定期和衰亡期。

（一）、延迟期

少量的细菌接种到新鲜培养基后，开始时，细胞一般不立即进行繁殖。

因此，它们的细菌数几乎不增加，甚至还有减少。

生长曲线中的这一段时间称为延迟期。

处于延迟期的细菌体积增长较快，特别是在此期的末期。

延迟期的出现可能是因为细胞在新的环境中，需要合成新的必需的酶、辅酶或某些中间代谢产物，或者为了适应新环境而出现的调整代谢的时间。

延迟期的长短与菌种的遗传性、菌龄及移种到新鲜培养基前后所处的环境条件是否相同等因素有关。

。

繁殖速度较快的菌种接种时，其延迟期也较短，甚至检查不到延迟期；接种到同样组成的培养基比接种到组成不同的培养基中，其延迟期要短些；增大接种量可缩短甚至消除延迟期。

由于延迟期的长短能影响微生物的正常生长周期，在发酵工业生产中延长生产周期，会降低设备的利用率。

所以，生产实践中总是设法缩短延迟期。

为此，采取的措施有：

（1）、增加接种量；

（2）、用对数生长期的菌种；

（3）、用健壮的菌种；

（4）、在种子培养基中加入发酵培养基中的某些成分；

（5）、采用最适种龄等。

（二）、对数期

在延迟期末，细胞开始出现较大量的分裂，培养基中的菌数急剧增加，进入了对数期。

在此期内，如用菌数的对数与培养时间作图时，则该线呈一条直线，此期为对数期。

对数期的菌数按几何级数增加。

即1个细菌繁殖几代，产生2n个细胞。

对数生长期的菌体代谢活跃，消耗营养多，生长速率高，个体数目显著增多。

另外，群体中的细胞化学组成与形态、生理特征等比较一致，这一时期的菌种很健壮，因此，在生产上常用它作为接种的种子。

实验室也多用对数期的细胞作为试验材料。

通常对数期维持的时间较长，但它也受营养及环境条件所左右。

（三）、稳定期

在一定的培养液中，细菌不可能按对数期的高速率无限地生长繁殖，这是由于对数期中细菌的活跃生长已经消耗了大量的营养物质，所以，在对数期末，细菌生长速率逐渐下降，死亡率大量增加，以致使新增值的细胞数与死亡的细胞数趋于平衡，因此活菌数保持相对的稳定，成为稳定期。

处于这个期的细胞生活力逐渐减弱，开始大量储存代谢产物。

同时，也积累了许多不利于微生物活动的代谢产物。

由于微生物的生长改变了它自己的生活条件，出现了不利于细菌生长的因素，如pH值、氧化还原电位等，致使大都数芽孢杆菌在这个生长阶段形成芽孢。

由于稳定期有大量代谢产物积累，人们要获得其代谢物质，可在这一时期提取。

在此稳定期内，活菌数达到最高水平。

如要得到大量菌体，也应在此期开始收获。

稳定期持续时间长短取决于菌种的繁殖与衰亡的数量之比。

环境条件对稳定期的长短也有影响。

（四）、衰亡期

稳定期后，如再继续培养，细菌死亡率逐渐增加，以致使死亡数大大超过新生数，总的活菌数明显下降，即死亡期。

其中，有一阶段活菌数以几何数下降。

因此，也称为对数衰亡期。

这个时期，细菌菌体常出现多种形态，包括畸形和衰退型，因此，此期的菌种不宜作种子。

微生物中单细胞生长曲线，反映了一种微生物在某种生活环境中（试管、摇瓶、发酵罐）的生长、繁殖和死亡的规律。

研究生长曲线既可为研究营养和环境条件提供理论依据，又可用来调控微生物的生长发育。

霉菌的生长也有延迟期、稳定期和衰亡期。

由于它们不是单细胞微生物，所以它们的繁殖不按几何级数增加，故而没有对数生长阶段。

五、连续培养

1、分批培养：

在培养微生物时。

将微生物置于一定容积的定量培养基中培养，称为定量培养。

2、连续培养：

是在微生物的培养过程中，不断地供给营养物质，并排除老菌液，让培养的微生物相对地维持较长时间的对数生长期，以利于提供较多的对数生长细胞。

在发酵工业上，可提高发酵率和自动化水平，减少动力消耗并提高产品质量。

有三种方法：

（1）、恒浊连续培养法；

（2）、恒化连续培养法。

连续培养法在工业生产上称为连续发酵。

我国在丙酮、丁醇、酒精的生产以及柠檬酸的发酵上已采取了连续发酵法，缩短了发酵周期，效果良好。

连续发酵的最大优点是取消了分批发酵中各批之间的间断时间，缩短发酵周期，提高设备利用率。

再者，连续发酵便于工业生产，自动化控制，产物均一，产量高。

但是在工业化生产中连续发酵容易发生杂菌污染及菌种退化等问题。

第三节环境条件对微生物的影响

外界环境对微生物的作用有三种情况：

（1）、外界环境条件适宜时，微生物生长旺盛，代谢作用加速；

（2）、外界环境条件不太适宜时，微生物生长缓慢，代谢作用受到一定程度的抑制；

（3）、外界环境不适宜的情况达到微生物难以忍受的程度，这时，微生物生命活动受到严重的影响，可能发生变异或死亡。

人们控制和调节微生物所处的环境条件的目的是要促进某些有益微生物的生长，发挥它们的有益作用；抑制和杀死那些不利于人类的微生物，并清除它们的有害作用，如防止食品的腐败变质等。

了解以下常用的几个概念；

（1）、防腐（Antisepsis）：

又叫抑菌，是防止或抑制微生物的生长繁殖。

（2）、消毒（Disinfection）：

是指杀死病原微生物的措施。

（3）、灭菌（Sterilization）：

杀灭物体上所有的微生物，包括病原微生物及非病原微生物。

（4）、商业灭菌：

是从商品的需要出发对食品进行的灭菌，指食品经过杀菌处理后，按一定的检验方法检不出活的微生物或者仅能检出极少数的非病原微生物，而且，它们在一定的保存期内不至于引起食品变质腐败。

（5）、无菌（Asepsis）：

即无活的微生物存在。

如无菌操作。

（6）、死亡（dead）：

是指微生物不可逆的丧失了生长繁殖的能力，即使再放到合适的环境中也不再繁殖。

环境因素包括：

物理条件、化学条件和生物条件

一、温度

温度是影响生物机体的最重要的因素之一。

温度的变化影响着微生物的细胞中生化反应速度。

热力致死时间（ThermalDeathTimeTDT）：

是指在特定的条件和特定的温度下，杀死一定数量微生物所需要的时间。

D值（Decimalreductiontime）在一定温度下加热，活菌数减少一个对数周期（即90％的活菌被杀死）时，所需要的时间（min）。

Z值：

如果在加热至死曲线中，时间降低一个对数周期（即缩短90％的加热时间）所需要升高的温度（oC）。

F值：

在一定的基质中，其温度为121.1oC，加热杀死一定数量微生物所需要的时间（min）。

高温灭菌分为干热灭菌和湿热灭菌。

（一）、干热灭菌（diyheatsterilization）

主要用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。

1、火焰灭菌：

直接利用火焰燃烧杀灭微生物。

该方法灭菌迅速、彻底。

2、加热空气灭菌：

将空气加热达140-160oC，保持1-2h。

（二）、湿热灭菌（moistheatsterilization）

1、煮沸灭菌：

煮沸温度接近100oC，保持15-30min，可杀死微生物的营养体，若要杀死芽孢，则需要2-3h，此法适用于可以浸泡在水中的物品，如食品、器材、衣物等。

2、间歇灭菌（vfractionalsterillization或tyndallization）：

用蒸汽加热灭菌温度不超过100oC，每日一次，每次加热30min，连续三次。

3、巴氏消毒（pasteurization）：

有些食品或物品在高温下会受到不同程度的损害，不宜用过高的温度灭菌，可采用较低的温度进行灭菌，条件是62-63oC，30min；或72oC，15s。

适用于杀死食品中的病原菌。

4、高压蒸汽灭菌（normalautoclaving）：

1kg/cm2，121.5oC，15-30min。

5、超高温瞬时杀菌法（Ultrahightemperatureshorttime，UHT）：

灭菌温度132-150oC，3-5s，可杀死微生物的营养细胞和耐热性强的芽孢细菌，但污染严重的鲜乳在142oC以上杀菌效果才好。

二、湿度

干燥能引起微生物细胞内蛋白质变性和盐浓度增高，这是抑制微生物生长或促进其死亡的主要原因。

三、渗透压

嗜盐微生物、嗜糖微生物的概念。

除以上耐高渗微生物之外，一般来说，18%-25%的盐浓度能完全阻止微生物的生长。

由于高渗透压对微生物有抑制作用，所以，在食品工业上，广泛地利用腌制和糖渍方法来保存食品。

四、氧化还原电位

不同的微生物需要的氧化还原电位不同。

五、辐射

1、紫外线：

细胞中的核酸具有吸收紫外线的性能，紫外线的辐射能量作用于核酸时，能引起核酸的变化。

妨碍蛋白质和酶的合成。

紫外线杀菌作用常用于空气消毒和器材物体表面消毒。

2、x、γ射线：

x射线不如γ射线，γ射线被空气吸收较少，射程远，穿透力强，可用于食品杀菌。

由于各种射线照射杀菌时不需要高温，所以这类杀菌又称为冷杀菌。

六、超声波与微波

超声波对微生物细胞内含物有强烈的震荡作用，可破坏细胞，另外，水溶液经处理后能产生过氧化氢，因而有杀菌能力，可以用来保藏食品。

微波是利用热效应对微生物有杀灭作用。

微波产生热效应的特点是加热均匀，热能利用效率高，加热时间短。

目前微波用于食品灭菌。

七、氢离子浓度

pH值对微生物生长影响较大，主要影响菌体细胞膜上的电荷，影响物质的吸收、代谢。

每种微生物都有自己适宜的pH值范围。

超过此一定范围后，生长就会停止。

由于pH值不同会影响微生物的代谢活动，改变物质合成方向。

高浓度氢离子可引起菌体表面蛋白质和核酸的水解，破坏酶的活性。

另外，某些有机酸可引起氧化作用，具有杀菌作用。

如食品防腐剂苯甲酸和水杨酸等。

高浓度的碱具有杀菌作用，如石灰水、氢氧化钠、碳酸钠等作为机器、工具以及冷库等的消毒剂。

八、化学物质

（一）、氧化剂：

氧化剂杀菌的效果与作用和浓度成正比关系，杀菌的机理是氧化剂放出游离氧作用于微生物蛋白质的活性基团（氨基、羟基和其他化学基团），造成代谢障碍而死亡。

主要有高锰酸钾、过氧化氢、漂白粉、过氧乙酸、碘等。

（二）、甲醛：

杀菌机理是与蛋白质的氨基结合而使蛋白质变性至死。

（三）、酚类：

机理是蛋白质变性。

石炭酸（苯酚）、来苏儿。

（四）、醇类：

脱水剂，乙醇：

70%的乙醇杀菌能力最强。

（五）、新洁尔灭

（六）、毒性物质：

SO2、H2S、CO、CN-。

（七）、染料：

结晶紫、孔雀绿、复红、次甲基蓝、孟加拉红对微生物有抑制作用。

（八）、重金属盐类：

重金属盐类对微生物都有毒害作用，其机理是金属离子容易和微生物的蛋白质结合而发生变形或沉淀。