酶标记抗体的制备技术.docx
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酶标记抗体的制备技术
酶标记抗体的制备技术
(一)酶标抗体的条件
1.纯度高、含杂蛋白少,用IgG优于血清抗体,用Fab优于IgG。
2.特异性强即抗IgG与IgG在免疫电泳上只有一条沉淀线,与IgG的全血清也只有一条沉淀线,这才算是特异性的单价抗体。
3.效价高一般琼脂扩散鉴定为1︰64以上才算合格。
抗体的可供标记的位点结构图
(二)酶标记方法
1.交联法交联法通常用的交联剂是戊二醛,戊二醛商品大多为25%的水溶液,利用戊二醛分子上对称的两个醛基,分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记。
标记时应尽量采用新鲜纯品,当戌二醛的OD235nm/OD280nm<3时,即为好的交联剂。
戊二醛交联法又分为一步法和二步法。
⑴一步法:
即把酶、戊二醛和抗体一起加入进行交联。
然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶结合物。
由于抗体分子量大(16万),酶分子量小(4万),抗体分子的氨基数比酶蛋白分子氨基数多得多,结果生成的抗体-戊二醛或抗体-戊二醛-抗体多而造成酶标物的活性小。
一步法操作:
1抗IgG-AKP的制备:
将10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/LpH7.0)中,在冰浴中缓缓搅拌,尽量避免气泡产生,完全溶解后,缓缓滴加1%戊二醛溶液4ml,使戊二醛的最终浓度为0.2%,移至室温中静置2h~3h后,以0.01Mol/LpH7.0PBS液4℃充分透析或以SephadexG25柱除去过量的戊二醛,4℃保存备用(也可保存于50%甘油中置低温冰箱);
2抗IgG-HRP的制备:
将12mgHRP溶于含5mg抗IgG的1mlPBS(0.1Mol/LpH6.8)中,缓慢搅拌下加入1%戊二醛溶液4mL,置室温2h~3h,充分透析或以SephadexG25除戊二醛,小量分装后保存于低温冰箱,避免反复冻融。
或冷冻干燥保存。
⑵二步法:
是先使酶与戊二醛反应,除去未反应的戊二醛,再使已“活化”的酶分子与抗体分子的氨基结合,最后加入少量的赖氨酸封闭被戊二醛激活的酶的残基。
二步法操作:
a)将10mg的酶溶于0.2ml含1.25%戊二醛的0.1mol/LpH6.8PBS中室温放置18h,充分透析或以SephadexG25柱除去未反应的戊二醛。
b)加生理盐水至1ml然后加入1ml(含5mg)的抗体溶液和1ml1Mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液,混合后4℃冰箱放置24h,加入0.1ml0.2mol/L赖氨酸,置室温2h,以0.15Mol/LpH7.2PBS液充分透析,离心去沉淀,上清液即为酶结合物,再进一步以硫酸铵沉淀纯化后应用。
c)AKP一般不采用二步法,而只用一步法。
改良HRP二步标记法:
a)取HRP10mg溶于0.4ml,0.25Mol/LpH6.8PBS液中或0.05Mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液中,加入25%戊二醛0.1ml,37℃温育2h后加入冰冷的分析纯的无水乙醇2ml,2500r/min离心沉淀10min~15min,倾去溶液。
b)沉淀以80%乙醇4ml~5ml混悬,同上离心,倾去乙醇,将管倒置,使乙醇充分流出。
c)沉淀用1ml0.05Mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液溶解,加入0.5ml~1ml抗IgG抗体溶液(含抗体15mg左右),放在冰箱内过夜后,加KH2PO4,使近中性即可应用。
2.氧化法采用过碘酸钠,过碘酸钠是强氧化剂,能将HRP的甘露糖部分(与酶活性无关的部分)的羟基氧化成醛基,然后与抗体的氨基结合,形成酶标抗体
(1)氧化法操作过程如下:
1将5mgHRP溶于新配制的1ml0.30Mol/LpH8.1重碳酸钠中,加0.1ml1%氟二硝基苯(FDNB)无水乙醇溶液,在室温中混合后,再加入1ml0.04Mol/L~0.08Mol/L过碘酸钠(NaIO4),置室温中轻搅30min,在溶液呈黄绿色时,加1ml0.16Mol/L乙二醇溶液,在室温中放置1h,使氧化反应中止,然后在4℃中对0.10Mol/LpH9.5重碳酸钠缓冲液透析,换液3次。
2在3mlHRP-醛基溶液中,加入5mg抗体(溶于1ml的碳酸盐缓冲液中),室温置2h~3h,加入5mg氢化硼钠(NaBH4),于4℃冰箱放置3h或过夜,然后用PBS液充分透析,离心去沉淀物。
上清液即为酶结合物,纯化后使用。
(2)改良过碘酸钠法:
①取5mgHRP溶于0.5ml双馏水中,加入新配制的0.06Mol/LNaIO4水溶液(10ml双馏水+128mgNaIO4)0.5ml,混匀,置4℃30min;
②取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O+0.09ml乙二醇)0.5ml,室温放置30min;
③加入含5mg纯化抗体的水溶液1ml,混匀,并装入透析袋,对0.05Mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6h(或过夜),使之结合;
④加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml,混匀,置4℃2h;
⑤在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液,混匀,4℃30min,离心,去上清,沉淀以少许0.02Mol/LpH7.4PBS液溶解,装入透析袋,以同样液体在4℃透析除盐过夜;
⑥次日取出离心,以除去不溶物,即得酶-抗体(HRP-IgG)结合物,以0.02Mol/LpH7.4PBS液加至5ml;⑦效价测定合格后,加入等量优质甘油,分装小瓶,低温保存。
戊二醛交联法与过碘酸钠氧化法比较,见表12-3。
表12-3戊二醛法与过碘酸钠法比较
比较项目
戊二醛法
过碘酸钠法
一步法
二步法
标记方法
简单
较复杂
较复杂
酶利用率
2~4%
2~4%
70%酶偶联到99%抗体上
产率
<5%
<5%
>50%
标记抗体分子量
750万
<25万
>40万
穿入组织能力
差
好
一般
抗体活性丢失
多
少
较多
酶活性丢失
多
少
较多
染色效应
差
较好
较好
3.二马来酰亚胺法二马来酰亚胺(Dimaleimide)能与蛋白质半胱氨酸的硫基反应。
首先用α-巯基乙胺还原蛋白质(IgG),并用N、N‘-O-苯二马来酰亚胺活化,然后除去多余的试剂,最后使含二马来酰IgG与含硫基的β-半乳糖苷酶连接。
具体操作如下:
①将Ag/Ab溶于0.1mol/LpH5.0醋酸钠缓冲液并对同一缓冲液透析平衡过夜,离心除去不溶性物质,Ag/Ab(14mg/2ml)与10mlα-巯基乙胺在37℃温育90min。
②过SephadexG25后浓缩使每ml含3.0mg左右的还原Ag/Ab。
在0℃,按1︰1滴加饱和N、、N‘-O-苯二马来酰亚胺溶液混合,于30℃温育20min,过SephadexG25柱,除去未反应的二马来酰亚胺。
3收集二马来酰亚胺“活化”的Ag/Ab浓缩使浓度为OD280nm=1.0(光径1cm),取1ml溶液加20μl(5mg/ml)β-半乳糖苷酶,置30℃20min,用0.10Mol/LNaOH中和后,于4℃置24h~72h,再过Sepharose-6B柱(1.5×40cm),以pH7.0PBS洗脱,收集酶结合物,加叠氮钠(NaN3)防腐,4℃保存备用。
4.酶标记半胱氨酸方法
试剂:
马来酰亚胺结合缓冲液:
含10mM磷酸氢钠,10mMEDTA的PBS,pH7.0。
抗体或抗原:
溶于PBS浓度达5mg/ml。
步骤:
1.用2-MEA还原Ag/Ab产生巯基
1)取100μl的马来酰亚胺结合缓冲液加入6mg2-巯基乙胺(2-MEA)的EP管中;
2)加准备好的Ag/Ab5mg到2-MEA溶液37℃温浴90min;
3)溶液降温到室温,用PBS超滤离心透析脱盐除去2-MEA。
Note:
Separationof2-MEAfromreducedIgGiscritical,asresidual2-MEAwillinterferewithcoupling.Todetermineifadequateseparationhasbeenachieved,performaBCA™Assaytoidentifylocationof2-MEA(SeetheAdditionalInformationSection).
4)包含还原态Ag/Ab的液体浓度约2.5mg/ml,立即进行下步反应减少二硫键形成。
Note:
Topreciselydetermineproteinconcentration,usetheCoomassiePlus-TheBetterBradford™AssayKit(ProductNo.23236).
2.准备马来酰胺:
HRP
1)称取1.067mgHRP对每毫克的巯基化抗体;
2)加1.1mg巯基-SMCC每毫克HRP;
3)加PBS使HRP终浓度为8mg/ml;
4)磁力搅拌混合2h;
5)PBS平衡柱除盐HRP,收集第一个峰;
3.抗体:
HRP连接反应
1)按1mgHRP每毫克Ag/Ab立即混合HRP与巯基化Ag/Ab,室温孵化1h;
2)在2-8℃混合16-20h;
3)对PBS透析换3次液,每2h换一次液;
4)加储存Buffer或等量无菌甘油稀释2倍-70℃保存。
马来酰亚胺活化的载体蛋白与含SH-的半抗原的交联
活化的酶与含SH-的抗原/抗体的标记过程
(一)酶标抗体结合物的纯化
在酶标记的溶液中,出现的是各种交联物的混合物,有酶-抗体、酶-抗体-酶、抗体-抗体、酶-酶,甚至还有游离的酶和抗体。
在这中间,除了抗体-酶和酶-抗体-酶外,其它都应该给予除去。
1.50%饱和硫酸铵沉淀法。
此法只能除去游离的酶及酶-酶聚合体。
而不能除去其它不需要者。
但是此法对酶标抗体的损耗少。
2.过SephadexG200或Sepharose-6B柱。
此法较繁琐,而且对酶标抗体的损耗较大,但提纯的质量好。
(三)酶标抗体的鉴定
1.酶标抗体的活性鉴定一般以琼脂扩散和免疫电泳进行鉴定。
使酶标抗体和相应的抗原(抗原浓度为1mg/ml)产生沉淀线,洗涤后于底物溶液中显色,显色后用生理盐水漂洗,沉淀线不褪色,说明酶和抗体都具有活性。
良好的酶标结合物琼脂扩散滴度一般应在1:
16以上。
2.酶结合物的定量测定包括酶量、IgG含量、酶与IgG克分子比值以及结合率的测定。
酶量(µg/ml)=OD403nm×0.42
(1)戊二醛法:
IgG(mg/ml)=(OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62
(OD403×0.42为酶在403nm的光密度,抗体与酶-戊二醛结合后OD280nm约增加6%,所以乘以0.94校正。
由于兔IgGOD280nm=1.0时为0.62mg,所以又乘以0.62)。
(2)过碘酸钠法:
IgG(mg/ml)=(OD280-OD403×0.30)×0.62
(40000和160000分别为辣根过氧化物酶和IgG的分子量)。
⑷酶结合率=结合物中的酶量/标记时加入的酶量×100%。
⑸酶标记率:
OD403nm/OD280nm即酶中正铁血红素辅基的吸光度(403nm)与抗体-酶蛋白中的色氨酸、酪氨酸的吸光度(280nm)之比表示HRP在AbE中所占的比例,它与E/Ab克分子比值呈高度正相关。
3.酶结合物的质量标准纯化的酶结合物的质量标准应包括以下几个方面。
(1)酶的催化活性。
(2)免疫学活性。
(3)未联接的游离酶的量。
(4)未联接的原始免疫反应物的量。
(5)每个酶分子所联接的免疫反应物分子数目。
(6)生化性质。
(7)酶标记免疫试验效果。
酶结合物的质量差异,可引起试验敏感度的很大变化。
例如用不同的程序制得的HRP-IgG结合物进行酶标记免疫试验,可得到不同的试验结果,故应予重视。
用于ELISA的各项指标参数见表12-40
表12-4用于ELISA酶标抗体的各项指标参数
评价
最好
好
一般
酶结合量(mg/ml)
≥1.0
≥0.5
0.4
酶结合率(%)
>30
9~10
7
酶IgG克分子比
>1.5
1.0
0.7
(五)酶标抗体的保存
分装小瓶,冻干低温保存。
也可分装小瓶,在4℃或0℃以下保存。
加甘油或牛血清白蛋白(最后浓度为33%)保存更好。
避免反复冻融。
保存期:
一般1~2年活性不变。
抗原/抗体的ELISA/WESTERN检测
Thepiptedconjugatedtohoseradshperxdase
Thefollowing5stepsofpreparationarecarriedoutinlabelinganimmunoglobulin(IgG)withhorseradishperoxidase(HRP):
(i)oxidationofHRPwithNaIO4;
(ii)crosslinkingofHRP(ox.)with1,13-diamino-4,7,10-troxatridecane(DTT);
(iii)couplingofIgGwithcrosslinkedHRP;
(iv)stabilizationoftheazomethinebonds;and
(v)S-300gelpermeationchromatography.
Steps(ii)and(iii)arecarriedoutinconnectionwiththemethodofthepresentinvention.TheyaredescribedindetailbytheexampleoftheHRP--labelingofIgG(rabbits)with1,13-diamino-4,7,10-trioxatridecane.Therefore,steps(i),(iv)and(v)whichareonlyindirectlyconnectedwiththepresentinventionandaregenerallyknown,aredescribedhereonlybriefly.
(i)OxidationofHRPwithNaIO4
4.0mgofhorseradishperoxidase(HRP,100nmole)areweighedinareactiontube,dissolvedin0.8mlofwaterand0.2mloffreshlyprepared0.1MofNaIO4solutionispipettedintothecopper-redHRPsolution,thecolorofwhichchangestoblack-green.Thereactiontubeisplacedimmediatelyintoanenclosurewhichisclosedtoavoidexposuretolight.Thereactiontimetotals15min.atroomtemperature,withanoccasionalmovingofthetube.50μlofethyleneglycolareaddedtoavoidanexcessofNaIO4.Thisquenchingisalsocarriedoutinthedarkandthereactiontimetotalsatleast30min.Thereupon,theHRP(ox.)solutionagainbecomescopper-red.TheseparationofHRP(ox.)fromlow-molecularreactantsiseffectedbygelfiltrationintheexclusionvolumeofaSephadex-G25column(approx.30cmlong,12mlofgelbedvolume).Itissufficienttotake20fractionsper0.5ml.Thered-brownHRPcontainingfractionsarepooledandareevaporatedbyultrafiltration(10,000NMGG)toavolume≤0.5ml.
(ii)HRP(ox.)Cross-linkingwithDTTintheEventofanEquimolarBatch
10mlofDTT(δ=1.005)arepipettedintoa50mlmeasuringflask,thatisfilledtothemarkwith0.1Mbicarbonatebuffer(pH9.8).ThisDTTsolutioncanbeusedformorethan2months.0.1ml(100nmole)ofthissolutionarepipettedintotheHRP(ox.)solutionconcentratedbyevaporation.Amicrostirrerisinsertedtomixthereactionsolutionrapidlyandthoroughly.Thereactiontimeforcrosslinkingtotals4hoursatroomtemperature;ifneeded,thereactionmixturemayalsobeplacedintoarefrigeratorovernight.
(iii)IgGCouplingwithCrosslinkedHRP
ThestoichiometricratiobetweencrosslinkedHRPandIgGshouldsuitablybeabout5:
1toobtainahighdegreeofsubstitution.15to16.7nmoleareusedforcouplinginviewofaninsignificantlossofHRPinthe1stand2ndpreparationstages2.25to2.50mgofIgG(rabbits).ImmunoglobuliniseitherdirectlyinsertedintothereactiontubewhichcontainsthecrosslinkedHRPsolutionin0.1Mbicarbonatebuffer(pH9.8),anddissolvedbystirring,orisearlierdissolvedin0.1Mbicarbonatebuffer(pH9.8),andisthenadded.DuringIgGcouplingthereactionconditionsarethesameasduringcrosslinkingreactionatroomtemperatureeitherfor4hoursorthecouplingmixtureisplacedintoarefrigeratorovernight.Thereactionvolumeshouldnotexceed0.8ml.
(iv)StabilizationoftheAzomethineBonds
50μl2Moftriethanolamine(pH8.0)areaddedtothecouplingsolution,thereactionmixtureisthoroughlymixedandcooledinarefrigerator.0.2MofNaBH4solutionarepreparedforhydrationoftheazomethinebonds,with8mgNaBH4dissolvedin1.0mlcoldwateronlyimmediatelybeforebeingused.Notmorethan75μlofthissolutionareaddedtothecouplingsolution.Whenstirringitthereactionsolutionfoamsvehemently.Thereactiontimetotalsapprox.30min.intherefrigeratorbefore25μl2Moftriethanolamine(pH8.0)areadded.Thereactionmixtureisplacedintoarefrigeratorforanother2hours.Finally,still10μl1Mofglycine(pH7.0)areaddedforstabilization.
(v)S-300GelPermeationChromatography
TheHRPtracerisseparatedina75cmlongSephacryl-S300.RTM.column(approx.41mlofgelbedvolume)whichiselutedwith0.05MofPBSbuffer/0.15MofNaCl(pH7.4).35-40fractionsof1.0mleacharetakenoff.Onlythefractionswithhighextinctionsat402nmshowingthemostfavorablepropertiesastotheirspecificandnonspecificbondsinEIA,atmostonly3tubes,arepooled.
酶标记抗体-HRP标记抗体原理及方法,戊二醛二步法和过碘酸钠法
酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。
酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否,因此被称为关键的试剂。
酶标记物中最常用的是酶标记抗体,它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。
酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体,其
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