16SrDNA的提取鉴定.docx
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16SrDNA的提取鉴定
用16SrDNA方法鉴定细菌种属
一、实验目的
1.掌握16SrDNA对细菌进行分类的原理及方法;
2.掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。
二、实验原理
随着分子生物学的迅速发展,细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平,如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16SrDNA序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA,分别为5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA,rRNA基因由保守区和可变区组成。
16SrRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16SrDNA。
5SrRNA虽易分析,但核苷酸太少,没有足够的遗传信息用于分类研究;23SrRNA含有的核苷酸数几乎是16SrRNA的两倍,分析较困难。
而16SrRNA相对分子量适中,又具有保守性和存在的普遍性等特点,序列变化与进化距离相适应,序列分析的重现性极高.因此,现在一般普遍采用16SrRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
利用16SrDNA鉴定细菌的技术路线:
PCR的基本原理:
必须已知部分序列设计出引物,10-30bp。
以此类推,呈几何级增长。
一般进行25-35个扩增循环
DNA可扩增106~109倍。
三、实验步骤
(一)细菌基因组DNA提取
技术路线:
具体步骤:
1.挑单菌落接种到10mL高氏液体培养基中37℃,振荡过夜培养。
(菌体培养)
2.取2mL培养液到2mLEppendorf管中,8000rpm离心2分钟后倒掉上清液。
3.再往同一离心管中2mL培养液到2mLEppendorf管中,8000rpm离心2分钟后倒掉上清液。
4.加入200μL缓冲液GA,充分悬浮、混匀,将菌体彻底悬浮。
5.再加入20μLProteinK,混匀,55℃温育10分钟。
(55℃为酶最适温度)
6.加入220μL缓冲液GB,混匀后,55℃温育10分钟。
(实为50-60℃之间)
7.加入220μL无水乙醇(降低体系粘稠度),充分混匀。
将上清(挑去其中絮状杂质,少部分,会产生气泡,除不去))小心转入UNIQ-10柱(羟基纤维素膜,特异吸附核酸,因为吸附有限,所以损失核酸)中。
13000rpm(离心机最高设定实为10000rpm)离心5分钟,倒弃收集管内的液体。
6.加入500μLGDSolution,10000rpm离心1分钟。
8.加入500μL70%乙醇(WashSolution),10000rpm离心0.5分钟。
(离心机最小设定实为1min,仪表盘上显示时间的梯形最小面积为1min,所以没法在到梯形面积中间时按暂停)
9.再10000rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。
吸附柱转移到一个新的1.5mL的离心管。
10.加入50μL预热(60℃)的洗脱缓冲液(TE,含RNase),加到柱子中间的膜上。
60℃放置5分钟。
12000rpm离心2分钟,流下的液体即为基因组DNA。
11.电泳。
取5μL提取DNA溶液+2μLLoadingBuffer(不用吸放混匀,以免机械损伤DNA)进行电泳检测质量。
(吖啶橙做染色液,橙红色)
(二)PCR扩增
1.根据已发表的16SrDNA序列设计保守的扩增引物。
16S(F)5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
16S(R)5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
2.PCR扩增体系:
在0.2mLEppendorf管中加入1μLDNA,再加入以下反应混合液:
16S(F)1μL(10μM)
16S(R)1μL(10μM)
2×PCRMix25μL(含10×PCRBuffer,dNTP,Taq酶)
ddH2O22μL(最先加)
反应体系50μL,简单离心混匀。
3.PCR反应
将Eppendorf管放入PCR仪,盖好盖子,调好扩增条件。
扩增条件为:
94℃3min
94℃30sec
50℃(实为52℃)45sec35cycles
72℃100sec(因为Taq酶1Kb/min,时间为经验所得)
72℃7min(充分延伸)
4.PCR产物的电泳检测
拿出Eppendorf管,取出全部溶液点入预先制备好的1%的琼脂糖凝胶大孔中。
电泳1hr。
在紫外灯下检测扩增结果(下午1:
50)。
(三)扩增片段的回收
根据上步实验结果,如果扩增产物为唯一条带,可直接回收产物。
否则从琼脂糖凝胶中切割核酸条带,并回收目的片段。
1)称量一2mL.的Eppendorf管质量,记录0.99g。
2)在紫外灯下切割含目的条带的凝胶,放入2mL的Eppendorf管内,称量1,06g。
计算凝胶质量0.07g。
3)每100mg凝胶加入300μLBufferDE-A(促融),混匀。
70℃温育至凝胶融化。
4)加入0.5倍体积的BufferDE-B(帮助连接),混匀。
全部转入UNIQ-10柱(?
),10000rpm离心1分钟,倒去收集管(与之前的试剂盒中的收集管规格不同)内的液体。
5)加入500μLBufferW1(WashSolution),10000rpm离心1分钟,倒去收集管内的液体。
6)加入500μLBufferW2(去盐液,70%乙醇),10000rpm离心0.5分钟。
(离心机最小设定实为1min)
7)再10000rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。
吸附柱转移到一个新的1.5ml的离心管。
8)加入30μL预热的洗脱缓冲液(Eluent),60℃放置3分钟。
12000rpm离心2分钟,流下的液体即为回收的DNA片段。
(四)DNA片段测序
将回收的片段(足量)送至生物公司测序,测序引物为16SPCR引物。
(Sanger双脱氧法,一边PCR,一边测序)
四、实验结果及分析
1.细菌基因组提取DNA电泳结果:
第十一泳道为我组结果,条带清晰,说明提取的DNA含量较高。
2.PCR产物的电泳检测:
正极
点样孔为大孔,96μL。
Marker6条带,清晰明亮。
第五泳道为我组结果,可见条带清晰,说明提取的DNA含量较高。
3.根据测序结果,到NCBIBlast项目上进行比对,确定该未知菌的种属。
分析讨论实验的过程及结果。
选择序列三:
1)打开网站www.ncbi.nlm.nih.gov,选取BLAST。
2)选择核酸比对
3)将序列粘贴到框中,下面的方框选Referencegenomicsequence,按BLAST,得到结果。
序列三与葡萄球菌属细菌的16SrDNA基因相同性最高,与StaphylococcussaprophyticussubspATCC.的16SrDNA基因的相同性为99%。
可初步判定序列三所属菌株可能是Staphylococcus属的成员。
如果要明确的得到其种属,还要进行相关的生理生化分析。
(四)结果处理:
生成文件,制作进化树。
1)点击Rrna-16SribosomalRNA
进去后,按图示点击,CreateFiles,保存在文件夹中,供生成进化树时使用。
每一种保存一次,我们共对20组生成了文件,保存在一个文档中。
2)运行MEGA5.05软件,按如下操作,打开下载下来的Sequence文件。
4)点击Alignment,AlignbyClustalW,然后按OK键,等待。
5)得到以下画面,删除序列两端不能对齐的碱基(不同源)。
6)按Data,PhylogeneticAnalysis,关闭窗口,将文件保存。
7)选择一个方法,构建系统发育树。
8)Bootstrap选择1000,点击compute开始计算。
9)得到最终的进化树。
(我们用的是样品3,命名为Alice)
五、分析讨论
(一)
本次试验主要是通过16SrDNA的方法来鉴定细菌种属,通过提取基因组DNA、PCR扩增、电泳检测,最后将得到的序列在NCBI上比对,找出与之同源性最大的菌种,最后用MEGA4软件制作出进化树。
在做这个时要注意的地方:
1细菌基因组DNA的提取中,加入缓冲液GA后要彻底悬浮菌体,来回吸打几次,使菌体彻底悬浮,切记不要产生气泡。
2加完GB缓冲液后,手拿Eppendorf管轻轻地上下颠倒混匀,令其充分反应,破坏细胞膜。
加完无水乙醇后会看到澄清透亮的液体中有一团白色的残渣漂浮着,用枪头小心地把它挑出,避免抽入不溶性的絮状沉淀,否则后面会出现较多的粘稠状物质堵住膜孔
3离心前要精确平衡,避免对离心机造成机械损害
4预热的洗脱缓冲液要竖直打到硝酸纤维素膜上,该膜能特异性的吸附核酸,若打到壁上会造成损失
5提取好的基因组DNA要在4℃条件下保存
6在制作PCR扩增产物时,先加水,打DNA液时将枪头伸入水中,防止有DNA液损失在壁上。
其他的可以几个人一组制成大体系混合液,这样取用更加方便而且准确;
7取液时注意试剂瓶上的标志,如10×、6×等,用前记得稀释;
8割胶的时候要带手套,带好紫外线防护罩,防止伤害眼睛。
9通过查找资料,我们摸索出了在NCBI上进行序列比对以及构建进化树的方法,过程很艰辛,但结果令人欣慰。
10构建进化树时,一定要参考多和同学们讨论,有条件时多多向实验室的研究生学长学姐请教,他们经常会用到BLAST和MEGA软件,知道很多小技巧和注意事项,在做进化树的时候给我很大的帮助。
11
(二)
1.由于核糖体进化保守,所以可以通过测定核糖体16SrDNA(序列约1.5KB)来鉴定细菌种属。
若要鉴定真核生物,则测定核糖体18SrDNA。
2.氯仿抽提可以去除蛋白(中间层)和有机物,G+菌用溶菌酶,G-菌用细胞膜裂解液。
GA为Tris-Hcl,GB为裂解缓冲液SDS。
3.好引物的特点:
扩增产物多,杂带少。
4.由于分子生物学实验的特点是实验时间长,中间等待时间长,涉及的高值仪器多,接触有害试剂多,实验原理较复杂,所以我们要严格遵守实验室纪律,认真做好实验,认真做好值日,从有限的学时中真正地学到东西。
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