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应用激光显微切割技术研究大鼠短期致肝脏癌前病变机理
ApplyLaserMicrodissectionMethodtoStudytheMechanismofShort-termLiverPreneoplasticLesionsinRats
Renjin*,Qixinming,Liulinlin,Wuxiongfei
(CenterforDrugSafetyEvaluationandResearch,ShanghaiInstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofSciences)
ABSTRACTOBJECTIVE:
Tostudythemechanismofliverpreneoplasticlesionsandtheprotectiveeffectsofresveratrolinshort-termliverpreneoplasticlesionsmodelinratswithlasermicrodissectionmethod.METHODS:
MaleSDratsweretreatedwithdiethylnitrosoamine(DEN)and2-acetylaminofluorene(2-AAF)toinduceliverpreneoplasticlesions.Theplacental-typeglutathioneS-transferase(GST-P)positivealteredhepaticfoci(AHF)wereevaluatedasthepreneoplasticmarker.Oxidativestress,connexin32andCYP450(especiallyCYP2E1)werealsoassessedbylasermicrodissection,immunohistochemicalandwesternblotanalysis.RESULTS:
1.ThenumberandareaofAHFremarkablyincreasedinthemodelgroup(DEN+2-AAF)andtheproliferatingcellnuclearantigen(PCNA)alsostronglyexpressed.Takentogether,wecansaythatthismodelhadbeeneffectivelybuilt.2.Reducedglutathione(GSH)wasmarkedlyreducedinmodelgroup,whichindicatedthepresenceofoxidativestress.3.Weusedlaserconfocalmicroscopetofindthattheexpressionofconnexin32significantlydecreasedinhepatocytesaroundcentralveins.4.TheenzymeactivityandproteinexpressionofCYP1A1andCYP2E1wereup-regulated,whiletheexpressionofCYP1A2wasdown-regulated.WeusedthelasermicrodissectioninstrumenttocollecttheAHF.TheexpressionofGST-PandCYP2E1wasmuchhigherinAHFthanthehepatocytesaroundtheAHF.AspecificinhibitorofCYP2E1,diallylsulfide(DAS),reducedtheexpressionofCYP2E1,meanwhile,thenumberandareaofAHFalsodecreased.5.ResveratrolhadasimilareffectwithDAS,whichalsoreducedtheexpressionofGST-PandCYP2E1inAHFandthehepatocytesaroundtheAHF.ThenumberandareaofAHFwerealsodecreased.CONCLUSION:
Ingeneral,oxidativestress,Cx32maybeinvolvedintheprocessofpreneoplasticlesions.AndCYP450particularlyCYP2E1hasamajorroleinthepreneoplasticlesions.Resveratrolhasasignificantprotectiononthepreneoplasticlesions,whichmayattributetoCYP2E1.
Keywords:
Short-termLiverPreneoplasticLesionsinRats,Lasermicrodissection,CYP2E1,Resveratrol
应用激光显微切割技术研究大鼠短期致肝脏癌前病变机理
任进*戚新明刘琳琳邬雄飞
(药物安全评价研究中心,上海药物研究所,中国科学院,201203)
摘要:
目的建立大鼠短期致肝脏癌前病变模型,采用激光显微切割技术,探讨癌前病变机理和中药白藜芦醇可能的肝细胞保护作用。
方法以大鼠肝脏为靶器官,用已知的致肝癌化合物二乙基亚硝胺(DEN)为诱变剂,以胎盘型谷胱甘肽巯基转移酶(GST-P)标记的转化灶作为肝细胞癌前病变的终点标记,建立短期致肝脏癌前病变模型。
同时检测氧化损伤、细胞间隙连接蛋白(Cx32)、CYP450酶等在肝脏细胞癌前病变中的作用。
进一步应用激光显微切割技术检测CYP2E1在肝脏细胞癌前病变中的作用。
结果1.大鼠短期肝脏癌前病变模型的建立模型组GST-P阳性转化灶数量增多、面积增大,细胞增生指标PCNA阳性细胞数量显著增加,表明模型建立成功。
2.氧化损伤检测模型组肝脏组织的还原型谷胱甘肽(GSH)明显消耗。
3.细胞间隙连接蛋白(Cx32)的改变激光共聚焦显微镜观察可见,模型组Cx32蛋白在中央静脉周围肝细胞的阳性染色在面积与数量上都有明显降低。
4.CYP450酶在癌前病变中的作用模型组CYP2E1和CYP1A1的活性增加,CYP1A1和CYP2E1蛋白表达均上调;CYP1A2则表达下调。
进一步用激光显微切割技术,结合连续切片的免疫组化方法,结果表明:
转化灶内肝细胞GST-P与CYP2E1的蛋白表达明显高于灶外正常肝细胞。
而CYP2E1特异性抑制剂大蒜素(DAS)抑制CYP2E1的表达,同时减少GST-P转化灶的数量和面积。
5.白藜芦醇的肝细胞保护作用白藜芦醇与DAS作用相似,可以显著的降低灶内、外肝细胞GST-P,CYP2E1的表达,并使转化灶的面积与数目显著减少。
结论综上所述,大鼠短期致肝脏癌前病变模型中,氧化损伤、细胞间连接蛋白可能参与了早期损伤过程;肝脏细胞早期损伤可能与CYP450代谢酶尤其是CYP2E1的改变密切相关。
白藜芦醇有明显的肝细胞保护作用,CYP2E1可能在其中起重要作用。
关键词:
大鼠短期肝脏癌前病变模型激光显微切割CYP2E1白藜芦醇
目前国际上常用的检测药物致癌性的实验方法主要是大鼠两年长期致癌实验。
该实验的结果可靠,但费时费人工。
而体外试验的假阳性和假阴性率较高,难以准确预测药物的致癌性[1]。
因此建立并应用快速、可靠的试验替代模型,结合两年长期致癌试验,是国际上公认的检测化学物质致癌性的有效途径。
短期大鼠致肝癌模型是日本学者伊藤等于1989年建立的,用于检测化合物的致肝癌性。
该模型自建立以来检测了三百多种化合物,其中,在肝脏致癌物的检测中,有97%的致突变物和88%的非致突变物呈现阳性结果,非肝脏致癌物中,该模型检测的阳性率为21%。
说明该模型是比较特异的检测肝脏致癌物的试验模型[1][2]。
应用这一模型也可用于早期致癌机理的研究[2][3],而应用先进的激光显微切割技术,将病变细胞和正常细胞分别切割下来,比较分析RNA、蛋白等的表达差异,可提供最直接的基因、蛋白水平的变化依据,目前广泛认为,这一新技术是将形态学和分子生物学最好的结合方法。
但多受昂贵的仪器设备和高难度技术的限制,因而开展的不多。
众所周知,绝大多数药物和致癌物通过肝脏进行生物转化,特别是经CYP酶系代谢后可能活化形成毒性较强的产物,对肝脏产生损害。
另外,CYP酶代谢后的产物参与基因表达的调控,也参与外源或内源性致癌物前体的生物激活。
有报道CYP基因族(即CYP1,CYP2,CYP3,CYP4),承担大量的肝脏内外源性物质的代谢作用,与化学致癌物关系比较密切[4][5],但是目前关于CYP450参与肝脏癌前病变的研究并不多,研究较多的是CYP2E1在肝脏癌变过程中起到重要的作用[6]。
在前人研究的基础上,我们采用激光显微切割和连续切片的免疫组化技术研究了CYP450酶尤其是CYP2E1在肝脏癌前病变中的作用。
白藜芦醇(Resveratrol,Rev)化学名称为3,5,4三羟基苯二烯,是一种广泛存在于葡萄、虎杖、花生等植物性食物或药物中的多酚类活性单体。
近年来大量的体内、体外抗癌试验结果表明,Rev对多种肿瘤,如肝癌、乳腺癌、皮肤癌、结肠癌等均具有潜在的保护作用。
大蒜素(Diallylsulfide,DAS)是多种烯丙基有机硫化物复合物,已证明它是CYP2E1的抑制剂[7]。
有文献报道DAS可以明显的改善DEN引起的肝细胞癌前病变[8],在实验中作为阳性对照。
本试验首次应用激光显微切割技术,结合连续切片的免疫组化和WesternBlotting两种分析方法,观察大鼠短期致肝脏癌前病变模型中,肝脏转化灶内肝细胞和灶外肝细胞GST-P和CYP450蛋白水平的差异,进一步分析和比较了给予Rev后肝细胞转化灶内、外GST-P和CYP2E1蛋白表达不同,表明Rev具有明显的肝细胞保护作用,而CYP2E1可能在其中起到重要作用。
1材料与试剂
1.1实验动物:
实验用60只SD大鼠购买于西普尔-必凯实验动物有限公司,饲养在中国科学院上海药物研究所的SFP级动物房。
1.2主要试剂:
二乙基亚硝胺(DEN)、2-乙酰氨基芴(2-AAF)、大蒜素(DAS),p-nitrophenol,ethoxyresorufin,erythromycin购于Sigma。
白藜芦醇购买于陕西慧科植物发展有限公司,兔抗GST-P抗体购于MBL公司,兔抗CYP2E1、CYP2B1/2、CYP1A1、CYP1A2抗体购买于Chemicon公司,鼠抗PCNA、Connexin32单抗购于SantaCruz公司,免疫组化ABC试剂盒购买于中衫金桥公司,HRP标记的GAPDH抗体购买于SantaCruz公司,ECL试剂盒购买于Amersham公司,谷胱甘肽含量测试盒购自南京建成生物工程公司,其他试剂均为上海国药集团生产的分析纯试剂。
2实验方法
2.1大鼠短期肝脏癌前病变模型的建立
以大鼠肝组织为靶器官,用已知的致肝癌化合物二乙基亚硝胺(Diethylnitrosoamine,DEN)为诱变剂,以2-乙酰氨基芴为促进剂,进行肝脏的大部分切除术,促进肝细胞再生。
并以胎盘型谷胱甘肽巯基转移酶(GST-P)阳性结节或病灶为癌前病变的终点标记,用形态学和免疫组织化学的方法检测GST-P和细胞核增生抗原(PCNA)在肝脏转化灶中的分布和阳性率,并进行统计学的分析和比较,判断模型的建立(图1)。
图1大鼠短期肝脏癌前病变模型
5周龄大鼠在动物房适应性饲养一周后,给予200mg/kgDEN腹腔注射,在两周时在饲料中混入0.01%2-AAF,三周时进行肝脏大部切除,八周时将大鼠麻醉处死取材。
A空白对照组,B给予DEN,不给予2-AAF,C不给予DEN,仅给予2-AAF,D模型组,DEN与2-AAF均给予,E在模型D组的基础上,给予0.1g/kg的Rev灌胃,F在模型D组的基础上,给予0.05ml/2d的DAS灌胃给予。
2.2肝脏组织P450酶及亚型活性的检测
我们使用差速离心法分离肝脏微粒体[9],分别检测了与致癌密切相关的CYP1A,CYP2E1,CYP2B,CYP3A代谢酶活性:
CYP2E1,CYP1A1,CYP3A1等,使用的活性检测底物分别为p-nitrophenol,ethoxyresorufin,erythromycin[10]。
同时使用WesternBlotting检测GST-P,CYP1A1,CYP1A2,CYP2E1,CYP2B1/2等的蛋白表达。
2.3肝脏组织氧化损伤检测
切取100mg肝脏组织,加入10mL20mMEDTA,高速匀浆。
取100μl匀浆液,加入等体积反应溶液(10%三氯乙酸(trichloroaceticacid,TCA)/20mMEDTA-Na2),充分混匀后3000×g,4oC离心5分钟,取适量上清,加入等体积含0.4mMTris-HCl,10mM5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoicacid)(DTNB),20mMEDTA-Na2的溶液,在5分钟内读取A412吸收值[11]。
以还原型GSH做标准曲线,方法同上。
2.4Connexin32免疫荧光染色
我们使用Connexin32(Cx32)抗体与Rhodamine标记的二抗进行免疫荧光染色,用甘油封片后,使用LeicaTCS2激光共聚焦显微镜观察,激发波长480nm,发射波长540nm。
2.5免疫组化方法
大鼠肝脏石蜡切片,厚度为5um。
常规脱蜡、脱水,浸入3%H2O210分钟,用10%正常山羊血清37℃封闭1小时,按照ABC法进行免疫组化染色。
染色后的切片用LeicaQW550图像分析系统进行着色面积的测定和比较分析。
2.6激光切割技术和方法
肝脏组织经OTC包埋、-80℃冰箱速冻后,用LeicaCM3500冰冻切片机制成厚度16um的切片,平铺于附有PET膜的不锈钢框架上,快速H.E染色,显微镜下选择明确的转化灶,使用LeicaASLMD型激光切割仪,将所需肝脏细胞切下,置入不同的50ul离心管,-80℃保存。
按照常规方法提取RNA或蛋白,进行Real-timePCR或Westernblotting检测(图2)。
图2激光显微切割(HE×20)
(A)快速HE染色切割前的肝脏组织;
(B)红色标记的区域为:
疑似转化灶
(C)激光切割
(D)收集于离心管中的切割组织片。
2.7数据管理及统计分析
各检查指标数据录入SPSS进行统计学分析。
结果用mean±SD表示。
两组间的比较用t检验或t’检验。
计量指标,用单因素方差分析(onewayANOVA)过程进行分析,采用最小显著级差法(LSD)进行各组间比较。
计数资料用卡方检验进行比较。
显著性标准为p<0.05。
3.实验结果
3.1大鼠短期肝脏癌前病变模型的建立
免疫组化和图像定量分析显示,D组可见多量、大的GST-P染色阳性灶,面积与A组相比明显增加(p<0.01),PCNA阳性细胞数量明显增加(p<0.01)。
实验结果说明短期大鼠肝脏癌前病变模型已经成功建立(图3)(表1)。
表1.GST-P和PCNA免疫组化染色的定量图象分析
Group
GST-Pfociarea(mm2/cm2)
PCNA(+)nuclei
(1000cells)
A
Notdetectable
31.83±12.89
B
1.16
67.67±45.13
C
1.08
115.58±27.71a,c
D
17.13a
134.83±30.1a,b
注:
ap<0.01vs.A组;bp<0.01vs.B组;cp<0.05vs.B组;
3.2肝脏组织谷胱甘肽含量检测
表2显示,模型D组肝脏组织可见明显的谷胱甘肽消耗,说明在给予DEN和2-AAF后,肝脏细胞可能出现了氧化损伤。
表2肝组织谷胱甘肽的含量
Group
GSH
(mg/gprotein)
A
65.82±5.02
B
53.25±2.33b
C
55.12±2.21b
D
46.03±2.90a
ap<0.01comparedtogroupA;bp<0.05comparedtogroupA;
3.3细胞间隙连接蛋白(Cx32)的改变
图4显示,与对照A组相比,模型D组中央静脉周围肝细胞Cx32蛋白阳性染色在面积与数量上都有所降低,但在汇管区附近肝细胞的Cx32阳性染色与对照组没有明显的改变。
图4Cx32免疫荧光染色
A.B.:
对照组A组;C.D:
模型组D组。
其中A,C为中央静脉附近;
B,D为汇管区附近。
红色荧光为Cx32着色,蓝色为DAPI,细胞核着色。
3.4CYP450代谢酶在肝脏癌前病变过程中的变化
3.4.1肝脏微粒体代谢酶的表达与活性测定
我们使用差速离心法分离得到肝脏微粒体后,检测各相关CYP450酶的表达情况与活性。
图5显示,CYP1A1蛋白在正常组织中几乎不表达,而在损伤过程中表达上调。
CYP1A2蛋白在正常组织中大量存在,而在损伤过程中表达下调。
CYP2E1蛋白在正常组织中有稳定的表达,在癌前病变过程中也有上调。
CYP2B1的表达在癌前病变过程中下调。
这些结果与前人在相似的致癌模型中报道的结果一致。
图5CYP450酶在各组肝脏微粒体中的表达情况
每个样品是5只大鼠微粒体蛋白的混合,每孔上样量为40μg蛋白。
表3显示,D组和C组的CYP2E1活性相比于B组和A组增加。
D、B、C组的CYP1A1的活性相比A组都有所增加。
CYP3A的活性在A、B、C、D四组中没有明显的差异。
Group
PNPHactivity(nmol/mg/min)
EthoxyresorufinO-dealkylaseactivity(pmol/mg/min)
ErythromycinN-demethylaseactivity(×103pmol/mg/min)
A
2.115±0.258
23667.10±4616.95
1.46±0.154
B
2.216±0.260
126771.32±18071.63b
1.42±0.296
C
2.75±0.272a,e
174533.87±54160.03b
1.54±0.164
D
2.875±0.610b,c
61335.92±10334.76b
1.56±0.349
表3CYP2E1,CYP1A与CYP3A的活性测定
Note:
ap<0.05,bp<0.01comparedtocontrolgroup;cp<0.05,dp<0.01comparedtogroupC;ep<0.05,fp<0.01comparedtogroupB.
3.4.2GST-P与CYP2E1在肝细胞转化灶内外的表达差别
使用激光切割技术将转化灶内肝细胞和转化灶周围正常的肝细胞切下,用WesternBlotting的方法进一步检测了转化灶内、外肝细胞GST-P与CYP2E1的表达情况。
图6A显示,模型D组灶内(D)GST-P表达明显高于灶外(D’),同时发现在给予CYP2E1的特异性抑制剂DAS后,灶内(F)和灶外(F’)GST-P的表达均明显低于模型D组。
同样的,模型D组灶内(D)CYP2E1的表达也明显高于灶外(D’),而在给予DAS后,灶内外CYP2E1的表达均有了显著的下降。
为了进一步验证CYP2E1在转化灶形成过程中的作用,我们采用了连续切片的方法,检测同一个转化灶内GST-P与CYP2E1的表达情况。
实验结果显示,在模型D组和F组中,GST-P与CYP2E1在转化灶内肝细胞的表达呈现协同增加的趋势,两者表达的位置一致,均位于转化灶肝细胞区域内(图6B4/5/6,10/11/12),而F组GST-P转化灶内肝细胞的数量和面积均明显少于模型D组,CYP2E1表达也相似。
图6GST-P与CYP2E1在转化灶内外的表达情况。
A每组6个独立样本,每个样本切割2000个细胞,混合处理后进行westernblotting实验,GAPDH作为内参。
D灶内,D’灶外;E灶内,E’灶外;F灶内,F’灶外;A对照组;
B肝脏组织连续切片后进行免疫组化实验。
GroupE白藜芦醇组,GroupF:
DAS组。
3.5白藜芦醇对肝脏癌前病变的作用
应用大鼠短期肝脏癌前病变模型研究和寻找一些可能具有肝细胞保护作用的药物,以期寻找具有潜在抗肿瘤作用的药物。
实验结果表明,中药白藜芦醇(E组)可以明显的降低转化灶内肝细胞GST-P的表达,在灶内(E)和灶外(E’)均有明显的作用(图6A)。
同时发现白藜芦醇和CYP2E1特异性抑制剂DAS的作用极为相似,除了降低GST-P的表达外,同时还显著降低了灶内、外肝细胞CYP2E1的表达,提示白藜芦醇的肝细胞保护作用可能与其降低CYP2E1表达的作用有关(图6A)。
连续切片免疫组化的实验结果更进一步的验证了上述结果(图6B7/8/9)。
4.讨论
大鼠短期肝脏癌前损伤模型作为替代实验之一,与大鼠两年长期致癌实验,已被纳入ICH致癌试验的指导原则中。
在本实验中,应用形态学和免疫组织化学的方法证明了短期大鼠肝脏癌前损伤模型的成功建立。
细胞间隙连接蛋白是机体固有的、与细胞生长发育及增殖分化等密切相关的膜表面分子,是维持机体组织器官正常结构及功能的基础。
因此,它的异常与某些先天性发育畸形或功能障碍性疾病以及癌症等的发生发展密切相关。
Cx32是与肝细胞密切相关的基因,对正常肝细胞的功能维持起作用。
在肝癌组织和肝癌细胞中Cx32的表达会有明显减少[12][13],在癌前病变的组织中Cx32蛋白降低是转化灶细胞选择性增殖的机制之一。
在我们的实验中,发现在DEN和2-AAF引起肝细胞癌前病变的过程中就有明显的Cx32表达下降,说明Cx32可能在肝癌形成过程的早期就起到一定的作用。
本试验结果表明:
表达下调的CYP450酶有CYP1A2和CYP2B1/2,CYP1A2的降低表达是肝脏损伤的一个标志,在很多肿瘤细胞中CYP1A2表达降低[14][15]。
实验中表达上调的CYP450酶有CYP1A1和CYP2E1,CYP1A1是代谢2-AAF的主要的酶[16],它的上调表达促进了2-AAF向致癌性代谢产物转化,因此对于肝脏癌前病变的过程起着促进作用。
有文献报道CYP2E1的表达与肝脏癌变的过程相关[17][18]。
CYP2E1的表达增加会引起细胞内ROS增多而导致氧化损伤[18]
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