微生物实验工作总结.docx
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微生物实验工作总结
微生物实验工作总结
(一)培养基的营养成分
一般都含有水、碳源、氮源和无机盐,有些微生物需要添加特殊营养物质(如培养乳酸杆菌时需添加生长因子:
维生素)
高考警示钟:
自养微生物与异养微生物所需的营养物质不同
(1)自养微生物所需的碳源含碳的无机物(如CO2),而异养微生物需要的碳源含碳的有机物,因此可根据培养基中营养物质判断微生物的代谢类型。
(2)含氮无机物不但能给自养微生物提供氮源,也能作为能源物质,提供能量,如NH3既作为硝化细菌的氮源也作为能源。
(二)培养基的配制原则
(1)目的明确。
要根据微生物的种类、培养目的等选择原料、配制培养基。
(2)营养要协调。
各种营养物质要保证适当的浓度和比例。
营养物质比例过低,不能满足微生物生长;浓度过高则会抑制微生物的正常生长。
(3)pH要适当。
不同微生物生长所需pH不同。
如细菌为中性或微碱性(6.5~7.5);霉菌等真菌为酸性(5.0~6.0)。
(三)培养基的分类及作用:
1.物理性质:
根据是否添加琼脂等凝固剂
(1)液体培养基:
不加凝固剂,常用于工业生产
(2)固体培养基:
加凝固剂,常用于微生物分离、鉴定、活菌计数
2.用途或功能
(1)选择培养基:
培养基中加入或去除某种化学物质,允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长。
常见例子:
①培养基中加入青霉素,筛选酵母茵或霉菌等真菌;
②培养基中加入高浓度食盐,筛选金黄色葡萄球菌;
③无氮培养基,筛选固氮微生物;
④无碳培养基,筛选自养微生物;
⑤以石油为唯一碳源,选择能分解石油的微生物;
⑥以尿素为唯一氮源,筛选尿素分解菌;
⑦以纤维素为唯一碳源,通过是否产生透明圈筛选纤维素分解菌。
⑧将培养基放在高温环境中培养,分离耐高温的微生物。
(2)鉴别培养基:
根据微生物的代谢特点,在培养基中加入某种指示剂或化学药品,以鉴别不种类的微生物。
①伊红一美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有,茵落呈深紫色,并带有金属光泽);
②培养基中加入酚红指示剂,鉴定尿素分解菌;
③培养基中加入刚果红(CR),鉴定纤维素分解菌。
注意:
①病毒为非细胞结构的生物体,专营活细胞寄生,目前不能利用人工培养基来培养,需接种在动植物组织中才能增殖。
常用于培养病毒的是活鸡胚。
②加入培养基中的凝固剂(如琼脂),一般不能被微生物利用,只起到凝固作用。
(一)关键
获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌入侵。
(二)消毒、灭菌:
二者主要区别中:
芽孢和孢子是否存活(芽孢是微生物度过不良环境的体眠体,而孢子是微生物进行无性生殖时的繁殖体即无性生殖细胞。
)
1.消毒:
使用较为温和的物理或化学方法,仅杀死物体表面或内部一部分对人体等有害的微生物(不包括孢子和芽孢)
常用方法
应用范围
巴氏消毒法:
70~75℃水中煮30min或在80℃水中煮15min
一些不耐高温的物体如牛奶
煮沸消毒法:
在100℃水浴中煮沸5~6min
一般物品
化学药剂消毒法:
用乙醇、氯气、KMnO4等药剂来杀死或抑制细菌生长或繁殖
可用来对环境、双手和衣物等消毒
紫外线消毒法:
30W紫外灯照射30min
接种室、接种箱、超净工作台
2.灭菌:
使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物,包括芽孢和孢子
常用方法
应用范围
灼烧灭菌法:
酒精灯火焰
接种工具如接种环、接种针等
干热灭菌法:
在160~170℃加热1~2h
如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具
高压蒸汽灭菌:
压力为100kPa,温度为12l℃的条件下,维持15~30min
培养基及容器的灭菌
注意:
(1)酒精消毒用体积分数为70%的酒精效果最好,浓度过低。
杀菌力弱,浓度过高,会使菌体表面蛋白凝固成一层保护膜,乙醇分子不能进入其中
(2)关于高压蒸汽灭菌注意以下几点:
①压力为100kPa,温度为12l℃的条件下,维持15~30min;
②注意同时旋紧相对的两个螺旋,使螺栓松紧一致;
③到灭菌时间后,当压力表的压力降为零时,才能打开排气阀,否则灭菌锅的液体会冲出容器,造成污染。
(3)灭菌消毒的原理,就是通过一定理化手段,使病原茵蛋白质变性,失去生命活性。
(4)灼烧灭菌用的是酒精灯火焰的充分燃烧层。
(一)常用细菌培养基——牛肉膏蛋白胨培养基配制流程:
计算
称量
溶化
灭菌
注意:
据配方计算配制一定体积培养基时各成分的用量
注意:
①倒平板时,烧杯口要通过酒精灯火焰灭菌。
②平板冷凝后要将平板倒置,既可防止皿盖上凝结的水滴滴入培养基造成污染;又可使培养基表面的水分更好的挥发。
(调PH)
倒平板
注意:
①牛肉膏较粘稠,应玻棒挑取,在称量纸上称量
②牛肉膏蛋白胨易吸潮,动作要迅速
注意:
①溶化琼脂时要不断搅拌,防止琼脂糊底而导致烧杯破裂;
②加热过程中部分水分蒸发,待琼脂完全溶化后应补加蒸馏水,以保持溶液的浓度
注意:
由于不同微生物适宜的pH不同,因此在熔化后,必须用NaOH或HCl来调节pH
注意:
①用高压蒸汽灭菌法
②培养基先调PH再灭菌
③一般是培养基先灭菌再倒平板
计算
称量
溶化
灭菌
注意:
据配方计算配制一定体积培养基时各成分的用量
注意:
①倒平板时,烧杯口要通过酒精灯火焰灭菌。
②平板冷凝后要将平板倒置,既可防止皿盖上凝结的水滴滴入培养基造成污染;又可使培养基表面的水分更好的挥发。
(调PH)
倒平板
注意:
①牛肉膏较粘稠,应玻棒挑取,在称量纸上称量
②牛肉膏蛋白胨易吸潮,动作要迅速
注意:
①溶化琼脂时要不断搅拌,防止琼脂糊底而导致烧杯破裂;
②加热过程中部分水分蒸发,待琼脂完全溶化后应补加蒸馏水,以保持溶液的浓度
注意:
由于不同微生物适宜的pH不同,因此在熔化后,必须用NaOH或HCl来调节pH
注意:
①用高压蒸汽灭菌法
②培养基先调PH再灭菌
③一般是培养基先灭菌再倒平板
(二)纯化大肠杆菌
1.原理:
在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞,使其长成单个的菌落,这个菌落就是纯化的细菌菌落。
2.微生物接种方法:
平板划线法(只可纯化)和稀释涂布平板法(既可纯化又可计数)
(1)平板划线法:
固体培养上→连续划线→逐步稀释→单个细胞繁殖而成的菌落(如图)
注意:
a.用接种环取菌种之前、每次划线之前和划线结束都要进行灼烧灭菌,灼烧后要在酒精灯附近冷却后再操作;
烧灼时期
目的
取菌种前
杀死接种环上原有微生物
每次划线前
杀死上次划线后接种环上残留菌种,使下次划线的菌种直接于上次划线末端,使每次划线菌种数目减少,达到分离菌株的目的
接种结束后
杀死接种环上残存的菌种,避免细菌污染环境和感染操作者
b.划线时不要划破培养基,如果采用分段划线法操作从第二次操作应总在上一次划线末端开始,首尾区不能相连;
c.操作必须始终在酒精灯火焰旁进行。
(2)稀释涂布平板法:
10倍系列稀释操作(一系列梯度稀释)→稀释度足够高的菌液→分散成单个细胞→单个菌落
稀释涂布平板的操作比较复杂,且各个细节均需保证“无菌”,应特别注意:
a.配制系列梯度稀释液时,必须用无菌水配制;
b.涂布器用70%的酒精消毒,多余酒精在烧杯中滴尽,沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰引燃。
不要将过热的涂布器放入盛有酒精的烧杯中,一面引燃其中的酒精;
c.吸管头不要接触任何其他物体;吸管要在酒精灯火焰周围使用。
3.菌种的保存
保存时间
保存方法
具体方法
后续处理
频繁
使用
临时保藏法
将菌种接种到试管的固体斜面培养基上,培养,长成菌落后,放入4_℃的冰箱中保藏
每3~6个月需重新接种。
否则菌种容易被污染或产生变异
长期
保存
甘油
管藏法
在3mL甘油瓶中,装入1mL甘油后灭菌,将1mL菌液转移到甘油瓶中与甘油充分混合
放入-20_℃的冷冻箱中保存
将菌种放在低温环境中保藏的目的是降低微生物的新陈代谢速率。
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