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农学毕业论文
农学毕业论文
水稻和大麦耐盐性的比较基因组学研究
郭秋林
(农学,3120100118)
摘要:
大麦(HordeumvulgareL.)是最耐盐的禾本科作物之一,其野生种质中蕴含丰富的耐性基因资源,这些基因通过各种分子机制调控植株的耐盐性。
然而,水稻是禾本科作物中耐盐差的物种之一。
但大麦和水稻在基因组序列及其表达模式上具有高度相似性。
这些基因往往较保守,在生长中具有功能显著性和等效性,称为共有基因,含有一些转录因子、酶家族、结构蛋白等,这些基因的作用可能与耐盐性相关。
本实验选用以水稻日本晴(Oryzasativasubsp.Japonica)和西藏野生大麦XZ26(Hordeumvulgatesubsp.spontaneum)为代表材料,用转录组测序寻找盐胁迫下大麦与水稻基因组中响应盐胁迫的共有基因和物种间特异表达基因,结合对应的耐盐表型与元素含量进行分析,初步探索大麦和水稻基因组与耐盐性的关系,从基因层面揭示大麦和水稻物种间耐盐的相关机理,为水稻耐盐性改良提供理论参考。
关键词:
盐胁迫;差异表达基因;表现型;元素含量;转录组测序。
Comparativegenomicsanalysisofsalttolerancebetweenriceandbarley
Qiu-linGuo
(Agronomy,3120100118)
Abstract:
Amonggramineouscrops,barley(HordeumvulgareL.)isoneofthemostsalt-tolerantspecies,whichcontainsrichresourcesofsalt-tolerancegenesregulatingsalttoleranceofplantsinitswildgermplasm.However,riceissaltsensitive.Barleyandricehavehighsimilarityinthegenomesequencesandtheexpressionpatternofgenes.Theseconservativegenesinbarleyandrice(cBRgenes)includingtranscriptionfactors,enzymefamilies,structuralproteinsmaintainthelawofgrowthregulation,whichplayingimportantrolesinsalttolerance.Inthisstudy,ricecultivarNipponbare(Oryzasativasubsp.Japonica)andaTibetanwildbarleyXZ26(Hordeumvulgatesubsp.Spontaneum)wereselectedforthisresearch.ThecBRsdifferentlyregulatedinriceandbarleyundersaltstresswereidentifiedthroughRNA-seq.ThenthecorrelationbetweencBRsgenesandsalttoleranceinbarleyandricewasdiscussed,revealingthemechanismofsalttolerancebetweenthetwocropsatthegenomelevel,whichcouldprovideavaluablereferenceforimprovingandbreedinginrice.
Keywords:
Saltstress;differentiallyexpressedgenes;phenotype;elementcontent;RNA-seq.
调节、离子平衡和抗氧化作用被认为是植物的主要耐盐机制[29]。
如植物在胁迫下产生大量的活性氧自由基(ROS),造成一系列次生胁迫,植物通过体内的抗氧化系统清除掉一部分的ROS,转基因植物实验研究中,过量表达抗氧化酶相关基因可增强转化植株对渗透和氧化胁迫的耐性[9]。
大麦耐盐机制涉及到多种生理途径与调节[2],最主要的是离子转运平衡,包括渗透调节的改善、根部Na+的摄入与Na+回流根际土壤的调节、木质部离子运输的调控、细胞中K+、Na+的置换与保留、细胞内Na+的区隔以及对氧化胁迫的耐受等[31]。
总体而言可被分为以下几方面:
(1)Na+排出机制;
(2)K+保留;(3)氧化胁迫耐性;(4)渗透调节[27,31]。
阐明各个机制的作用原理及其在大麦耐盐性上的相对作用,对于指导大麦及其它作物的耐盐性研究无疑具有重要的意义。
2.2大麦与水稻的耐盐性比较
相比较而言,大麦与水稻大约在5000万到1亿年发生分化,具有相当悠久的历史,但在其基因组的构成乃至RNA修饰、蛋白结构乃至功能上仍然具有较高的相似性。
基因若不受功能约束,其表达形式很容易变化,长久以来使萌发调节规律得以保持的水稻、大麦基因,表达序列与形式较恒定,在萌发中具有功能显著性和等效性,有较高的研究价值[23]。
此外,大麦中还存在特有的保守基因序列。
鉴于大麦具有较强的耐盐性,而这从根本上又是由基因进行调控的,因而将耐盐性的差异划归为基因组的比较也是十分必要的。
水稻栽培种的耐盐性普遍低于大麦,以水稻在盐处理下的生长状况作为参考指标,研究表明水稻幼苗期对盐碱较敏感,同一品种在发芽期和幼苗期的耐盐性存在一定差异,整个营养生长阶段,水稻耐盐性逐渐增强[5]。
此外,相关研究[17]指出在盐碱胁迫下,水稻成熟期的株高和秆长不能很好地反映品种间耐盐性强弱,最佳取样期在分蘖期结束前,而单株分蘖数等是衡量水稻耐盐碱强弱的良好指标[4]。
相关研究表明,在检测到的大麦、水稻结构与功能基因中,同源数量达到57661个,大麦特有基因为4650个,即在漫长进化史中,大麦分化出少部分具有特异性的基因[2]。
而水稻与大麦在同源基因的蛋白质序列和表达形式上具有很高的相似性[23]。
基于同源基因组和大麦特异基因组的研究价值,分析特有基因在表达过程中的调控机理,比较同源基因调控差异,从中找出耐盐相关基因的可能性较高。
这些基因组的分析以及文库制备等也能够成为耐盐水稻开发的一项技术储备。
2.3转录组及其测序技术(RNA-Seq)
转录组是特定细胞或组织在特定时间或状态下转录出来的所有RNA的集合。
通过对转录组的研究可以揭示生物体的基因表达、研究结构变异及发现新基因等。
转录组分析的研究方法、研究平台发生着日新月异的变化,同时生物信息学分析的内容也在逐渐完善。
分子生物学技术的快速发展极大地提高了人们对转录组(Transcriptome)的分析能力,特别是随着高通量测序技术的发展,RNA-Seq分析已经逐渐成为一种常用的实验手段[7]。
作为一种新的转录组研究手段,RNA-Seq利用新一代测序技术能够更为快速、准确地为人们提供更多的生物体转录信息,并在生物信息学分析等相关领域得以不断应用[10]。
3. 材料与方法
3.1 实验材料
本实验所用的水稻和大麦分别选取日本晴和西藏野生大麦XZ26作为实验材料。
各取200粒左右具有活性的休眠种子。
3.2植株处理与取样
3.2.1种子萌发
水稻种子发芽:
取2个500mL的锥形瓶用去离子水洗净,各加入200mL蒸馏水,供试的的日本晴种子分别放入锥形瓶中,并标记名称,放入培养箱25℃饱和湿度进行暗室培养,每隔8小时换水一次,并注意轻摇混匀。
48h后,用同温去离子水冲洗一次,取2个发芽盒,标记水洗后,垫上3层用蒸馏水浸润的发芽纸,将种子均匀摆在发芽纸上,加蒸馏水至浸没。
再另用滤纸加水浸湿,覆盖在发芽盒底部,发芽盒置于25℃培养箱中。
恒温箱暗培养3d,出芽后补光培养。
大麦种子发芽:
水稻种子播种7d后进行大麦种子发芽。
供试的XZ26种子用3%H2O2表面灭菌处理20min,用去离子水冲洗4次后在发芽盒中发芽,播种方法同水稻种子。
发芽盒放置在25℃的生长室中暗培养3d,出芽后补光培养。
3.2.2苗期盐胁迫处理
大麦发芽9天后,将水稻和大麦幼苗各自移栽到6个盛有营养液的6*8孔塑料黑箱(15L)中进行水培,水稻、大麦各分为2个处理组与1个实验组。
每处理(箱)各设置4⨯6=24个重复,每个重复取2粒发芽状况良好的种子在海绵固定下种1个孔。
大麦的水培箱用气泵连续充气。
所有处理在温室中培养,培养条件为光照14h,黑暗10h,昼夜温度设置为22℃/18℃,营养液pH控制在5.6左右。
定期更换营养液,配方如表1,其中大麦使用的营养液编号H1到H6,水稻使用的营养液编号R1到R3及H1到H3[2]。
元素种类
营养液编号
化学成分
浓度(g/L)
每10L营养液用量(mL)
大量元素(大麦)
H1
KNO3
101
10
Ca(NO3)2·4H2O
236
H2
MgSO4·7H2O
246
4
H3
NH4H2PO4
115
2
微量元素
H4
H3BO3
1.85
1
MnCl2·4H2O
0.99
(NH4)6Mo7O24·4H2O
12.36
ZnSO4·7H2O
1.15
H5
CuSO4·5H2O
0.25
1
H6
Fe(Ⅲ)-EDTA
42.1
1
大量元素(水稻)
R1
KH2PO4
24.8
5
R2
MgSO4·7H2O
134.8
5
(NH4)2SO4
48.2
R3
KNO3
18.5
5
Ca(NO3)2·4H2O
86.4
表1水稻与大麦营养液配方
水培8d起进行盐胁迫处理,每个基因型的3组处理分别将营养液中NaCl的浓度设定为0mM(对照)、100mM(处理)、150mM(处理);所有营养液每3d更换一次,加缓冲液以控制pH在6.0左右,实验组开始时NaCl浓度每次换营养液增加50mM,直到达到目标浓度,使植株逐渐去适应高盐环境。
3.2.3取样方法
盐处理7d(播种第33d)后对材料进行取样,取样品种为XZ26、日本晴,浓度为0mM、100mM,共4组处理。
每组处理各收取生长状况最好的6个重复,每个重复分别剪取地上和地下共2部分,各自作为1个样本。
地下部的根用自来水冲洗3次,连续冲洗1min,洗去吸附在根表面的离子,地上部剪去除生长状况不佳的老叶片。
取样时就将6个重复先后分2批收取,每批随机3个重复。
第一批样品,编号地上部S1-S12,地下部R1-R12,在80℃下烘干72h称干物重,烘干后称重。
烘干后的样品用于短期盐处理的金属元素含量测定。
第二批样品同为3个样本,编号地上部S1-S12,地下部R1-R12,立即放于液氮冷冻烘干,-80℃保存备用于代谢含量测定(RNA-seq)[2,31]。
3.3元素含量测定
取样后,将地上部和地下部的第一批烘干后样品,研碎后称取重量。
将样本加入试管,冷却后再加入10mlHNO3:
H2O(1:
1),用试管加热器以160℃消煮约2h,直至消煮液只剩试管半球部分。
用滤纸过滤,收集提取液并定容至20mL,保存于试管并标记。
各样本Na、K、Ca、Mg、Cu、Fe、Mn和Zn离子含量用电感耦合等离子体发射光谱仪ICP-OES(iCAP6000型号,美国赛默飞世尔科技公司)测定。
3.4RNA提取与R
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