生物技术制药复习提纲.docx

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生物技术制药复习提纲

2008生物技术制药复习提纲

一、基本概念

1.质粒：

是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。

2.贴壁细胞：

生长须有贴附的支持物表面，自身分泌或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长、增殖的一类细胞。

3.悬浮细胞：

生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长的一类细胞。

4.抗体：

是指能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白。

5.抗原：

是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答、并能与相应免疫应答产物（抗体和致敏淋巴细胞）在体内外发生特异性结合的物质。

6.半抗原：

只有抗原性而无免疫原性的物质。

7.人-鼠嵌合抗体：

在基因水平上将鼠源单抗的H和L链可变区基因分离出来，分别与人Ig的H和L链的稳定区（C）基因连接成人-鼠嵌合抗体的H和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达完整人-鼠嵌合抗体。

8.改形抗体：

又称CDR移植抗体，是Ig分子中参与构成抗原部位的区域，是H和L链V区的互补性决定区，而不是整个可变区。

9.Fab抗体：

具有完整的双价抗体活性,且保持抗体分子的立体构型,在人体稳定的小抗体雌形。

Fv抗体：

含有L链和Fd链一半的N端可变区，具有与完整抗体相似的结合能力的片段。

10.单链抗体：

是由一段弹性连接肽（Linker）把抗体可变区重链（VH）与轻链（VL）相连而成，是具有亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单位。

11.植物的分化：

导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程，可分为胚胎发生和器官发生。

12.脱分化：

是指培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程。

13.再分化：

通过脱分化诱导形成的愈伤组织在适宜的培养条件下可再分化成为胚状体或直接分化出器官的过程。

14.愈伤组织：

是植物损伤后，在伤口长出的一块软组织。

15.继代培养：

由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代时间称之为第一代培养。

连续多代的培养即为继代培养。

16.固定化酶：

是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。

17.固定化细胞：

将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。

被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。

18.模拟酶：

是指根据酶的作用原理，用各种方法人为制造的具有酶性质的催化剂，亦称“人工酶”。

19.细胞融合:

是指认为地使两种不同的生物细胞在同一培养器中，用无性的人工方法进行直接接触，产生能同时表达两个亲本细胞有益性状的细胞杂交技术。

20.免疫耐受:

在某种情况下，抗原也可诱导相应的淋巴细胞克隆对该抗原表现为特异性无应答状态。

21.完全抗原:

具有免疫原性和反应原性的物质。

22.抗原决定簇：

又称表位，指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团,是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。

23.单克隆抗体：

是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。

24.生理活性物质:

是一类对细胞内的生化反应和生理活动起调节作用的物质的总称。

25.生物药物:

生物药物是指运用生物学、医学、生物化学等的研究成果，综合利用物理学、化学、生物化学、生物技术和药学等学科的原理和方法，利用生物体、生物组织、细胞、体液等制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。

生物药物，包括生物技术药物和原生物制药。

26.肽图分析：

肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质,对生成的肽段进行分离分析。

它是检测蛋白质一级结构最有效的方法，该技术灵敏高效是对基因工程药物的分子结构和遗传稳定性进行评价和验证的首选方法。

27.生物技术：

包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程及生化工程。

其中，基因工程是生物技术的核心，细胞工程是生物技术的基础，酶工程是生物技术的条件，发酵工程是生物技术获得最终产品的手段。

28.生物技术制药：

采用现代生物技术，借助某些微生物、植物和动物生产医药品。

29.基因工程抗体：

借助DNA重组和蛋白质工程技术，在基因水平对免疫球蛋白分子进行切割、拼接、修饰和重新组装的一种新型抗体。

所制备的抗体去除或减少了可引起副作用的无关结构，但保留天然抗体的特异性和主要生物学活性，并可赋予抗体分子以新的生物学活性。

包括：

人-鼠嵌合抗体、改性抗体、Fab与Fv抗体、单链抗体。

二、技术原理

1．简要说明影响目的基因高效表达的因素：

（1）表达系统；

（2）载体构建；

（3）外源基因的拷贝数；

（4）外源基因的表达效率；

（5）外源蛋白的糖基化；

（6）宿主菌株的影响。

2．基因载体应具备的条件：

（1）具有复制起始点，使重组DNA能在受体细胞内进行复制，达到无性繁殖的目的

（2）有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有1个；

（3）有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；

（4）有一定容量；

（5）有相当的拷贝数，即每个宿主菌可能容纳的最多数。

3．导致基因工程菌中质粒不稳定的原因及如何提高质粒的稳定性？

（1）分裂不稳定：

指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。

结构不稳定：

指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变

（2）导致基因工程菌遗传不稳定性的原因:

※受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解

※外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢

※重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配，这是重组质粒逃逸的基本原因

※受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排

（3）提高稳定性的方法:

※采用两阶段培养法：

（先使菌体生长至一定密度；再诱导外源基因的表达。

）

※在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失菌的生长，提高质粒稳定性。

※调控环境参数如温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度

※有些含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢，间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率，可改善质粒稳定性。

通过间歇供氧和改变稀释速率，都可以提高质粒稳定性。

4．简述三种分离纯化常用色谱方法的基本原理。

⑴离子交换层析（IEC）

基本原理：

通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。

⑵疏水色谱（HIC）

基本原理：

主要是利用蛋白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基团之间的相互作用，无机盐的存在能使相互作用力增强。

⑶亲和层析（AC）

基本原理：

是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用。

⑷凝胶过滤

基本原理：

是以具有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。

5．抗体的基本结构及每一区域的功能作用。

（1）由4条多肽链组成的四聚体，即由2条相同的轻链（L）和2条相同的重链（H）组成，重链之间以及轻链与重链之间通过二硫键连接，呈Y字型结构。

（2）其中可变区（V区）中，存在着抗体分子和抗原分子发生特异性结合的关键部位，即互补决定区（CDR）；而恒定区（C区）则决定了Ig分子的异种抗原性。

6．试比较动物细胞和植物细胞生理特点的异同。

7试比较说明动物细胞培养基与植物细胞培养基的区别。

8．试比较动物细胞与植物细胞培养操作方式的异同点。

（1）动物细胞与植物细胞培养都用到半连续式操作，它是一种将培养基一次性地加入反应器中，接种、培养一定时间后收获细胞的操作方式。

（2）不同的是动物用的分批式操作，而植物用的是成批培养；动物还有到灌流式操作，而植物还用到连续培养和固定化培养。

9．简要说明制备的单链抗体的基本原理及该抗体的优缺点。

（1）基本原理：

首先从杂交瘤细胞、外周血淋巴细胞中提纯mRNA，再经RT-PCR分别扩增抗体的重链可变区和轻链可变区编码基因，人工合成一条寡核苷酸序列（称为Linker），将VL的C端与VL的N端或VH的C端与VL的N端相连接，构建成单链抗体基因，在一定的表达系统中得以表达。

（2）优点：

＃分子小，容易进入组织；

＃为单链，易于进行分子改造；

＃体内半衰期短、免疫原性低；

（3）缺点：

＃稳定性依然较低；     

＃功能单一，仅能与一种抗原特异性结合；

＃亲和力低，稳定性较差，体内消除过快。

10．  试以环糊精为例说明模拟酶制备的基本原理。

答：

环糊精（CD），它是一种优良的模拟酶，可提供一个疏水的结合部位并能与一些无机和有机分子形成包结络合物，以此影响和催化一些反应。

环糊精分子是由多个D-（+）-吡喃葡萄糖残基通过α-1，4糖苷键连接而成。

每个葡萄糖残基呈现无扭曲变形的椅式构象，整个分子组成略呈锥形的圆筒，分子内有空穴。

环糊精分子的疏水区处于空穴内侧，亲水区处于环状分子外侧。

当一个与环糊精的空穴相适应的疏水分子遇到环糊精时，则进入它的空穴中与之“契合”（包结）。

环糊精催化反应时，参与反应的底物分子先被环糊精分子包结，再与其发生反应，这与酶促反应十分相似。

三、技术方法

1．基因工程药物制造流程。

※目的基因和载体的准备；

※目的基因与载体的连接构建重组质粒；

※转化至受体细胞构建基因工程菌；

※培养工程菌；

※目的基因的表达，产物分离纯化；

※除菌过滤；

※半成品、成品检定；

※包装。

2．试述获得目的基因的一种方法。

（1）鸟枪法

随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。

鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离。

局限性：

a、工作量较大，需要了解目的基因的背景知识；

b、不能获得的最小长度的目的基因；

c、不能除去真核生物目的基因的内含子结构。

（2）反转录法

先从产生某特异蛋白的真核细胞中提取mRNA，以其为摸板，在反转录酶的作用下，反转录合成该蛋白mRNA互补DNA（cDNA第一链），再以cDNA第一链为摸板，在反转录酶或DNA聚合酶I的作用下，最终合成编码该多肽的双链DNA序列。

局限性：

a、并非所有的mRNA分子都具有polyA结构；

b、细菌或原核生物的mRNA半衰期很短；

c、mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难；

d、仅限于克隆蛋白质编码基因。

（3）PCR法（聚合酶链反应法）

PCR（PolymeraseChainReaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序。

使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：

已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。

（4）化学合成法（是全基因合成）

化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略：

①小片段粘接法：

根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段；

②补钉延长法：

根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段；

③大片段酶促法：

根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段。

上述三种方法各有利弊：

化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低。

3．如何将目的基因与载体进行连接（几种末端的连接策略）。

（1）酶切末端的种类：

EcoRI产生的5’粘性末端，PstI产生的3’粘性末端，PvuII产生的平末端

（2）从分子动力学的角度上讲，粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平末端的连接属于分子间的连接。

（3）T4DNA连接酶：

催化相邻DNA链的5’-P端和3’-OH端与磷酸二酯键的结合反应，需要ATP作为辅酶。

不仅催化粘性末端间的连接，还能催化平末端的连接，还可以催化DNA与RNA间的连接，被广泛应用于基因工程中，甚至没有没有别的酶可代替。

E.coliDNAl连接酶：

只能催化粘性末端的连载，不能催化平末端的连接，也不能催化DNA与RNA的连接，需要NAD+为辅酶

4．单克隆抗体制备的流程，并简要说明每一步骤的理论依据。

（1）抗原与动物免疫

制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫，从动物脾脏中得到免疫的B淋巴细胞。

（2）细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养

PEG诱导细胞融合，用HAT培养基筛选杂交瘤细胞。

（3）筛选阳性克隆与克隆化

筛选阳性克隆常用检测方法：

免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术等。

克隆化：

单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。

（4）杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定

（5）单克隆抗体的大量制备

体外培养法:

可获的10μg/ml抗体

体内诱生法:

可获的5～20mg/ml抗体

（6）单克隆抗体的纯化

依单抗IgG类和亚类不同，选各种不同的纯化方法。

体内诱生法单克隆抗体的纯化方法：

1.离心,取上清，超滤，盐析。

2.分离⑴凝胶过滤用于IgGIgM单抗纯化

⑵阴离子交换层析IgG单抗纯化

⑶亲和层析IgG单抗纯化。

5．简要说明酶的固定化方法。

酶的固定化,就是通过载体等将酶限制或固定于特定的空间位置,使酶变成不易随水流失即运动受到限制,而又能发挥催化作用的酶制剂。

按所用载体和操作方法的差异，一般可分为载体结合法、包埋法和交联法三类。

（1）载体结合法

载体结合法是将酶结合到不溶性载体上的一种固定化方法。

根据结合形式的不同，可分为物理吸附法、离子结合法和共价结合法。

（2）交联法

交联法是用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物的细胞与细胞之间交联的固定化方法。

可分为交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法及载体交联法4种。

（3）包埋法

可分为网格型和微囊型两种。

将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中的称为网格型，将酶或细胞包埋在高分子半透膜中的称为微囊型。

包埋法一般不需要酶蛋白的氨基酸残基参与反应，只适合于小分子底物和产物的酶。

6．固定化酶反应器的类型特点及选择依据。

（1）固定化酶反应器的类型特点：

※间歇式搅拌罐反应器（亦称分批搅拌反应器，BSTR）

结构简单，设有夹套或盘管装置，主要用于游离酶反应。

※连续流动搅拌反应器（CSTR）

在结构上与BSTR基本相同，区别是连续进料、连续出料。

有搅拌系统，组分分布均一；但剪切力较大，容易引起固定化酶的破坏。

※填充床反应器（PBR）

反应器内流体的流动形态接近于平推硫硫型，底物按一定方向以恒定流速通过反应床。

※流化床反应器（FBR）

混合程度高，传热、传质情况良好。

※循环反应器（RCR）

让部分反应液流出，和新加入底物流入液混合，再进入反应进行循环。

用于不溶性反应底物。

※连续流动搅拌器-超滤膜反应器（CSTR/UFR）

可以实现酶的反复使用和使底物彻底转化。

（2）固定化酶反应器的选择依据

※固定化酶的形状

※底物的物理性质

※酶反应的动力学特性

※外界环境对酶的稳定性的影响

※操作要求及反应器的费用

四、实践与进展

1．试述基因工程药物的发展前景

自从DNA重组技术于1972年诞生以来，作为现代生物技术核心的基因工程技术得到飞速的发展。

目前，世界各国都将基因工程及其逐渐加速的产业化进程视为国民经济的新增长点，展开了激烈的市场竞争。

到1999年底为止，全球至少已有近3000家生物工程公司在从事生物药品与基因产品研究与开发,形成了一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。

基因工程药物因为其疗效好，副作用小,应用范围广泛而成为各国政府和企业投资研究开发的热点领域，大量的基因工程药品连续问世，年产值达数十亿美元。

在很多领域特别是疑难病症上，起到了传统化学药物难以达到的作用。

其原因在于，基因工程制药物的研究与开发多是以对疾病的分子水平上的有了解为基础的，往往会产生意想不到的高疗效。

2．如果你发现某海洋生物中有一种特殊的能治疗癌症的蛋白，你如何通过生物技术来生产它？

3.已知拟南芥中某一个序列已知、编码单体酶蛋白的基因在单细胞微生物中表达，请选择一种单细胞微生物，设计一个实验流程确保能得到最终产物？

实验流程

（1）目的基因、载体和受体菌的准备

由于基因序列已知，因此选用化学合成法获得目的DNA，同时选用克隆载体——大肠杆菌质粒pBR32，利用其带有细菌和酵母的质粒复制原点和选择标记，既能在细菌中进行质粒复制和表型选择，又能在酵母中进行质粒复制和表型选择。

因为外源基因是真核基因，表达产物是单体酶，故选用酵母菌做受体菌，一方面酵母菌具有真核细胞特性，适合真核基因的高效表达，另一方面酵母菌能使表达的外源蛋白在分泌过程中糖基化，使蛋白酶更加稳定，便于分离精制。

（2）目的基因与载体的连接构建重组质粒

利用限制性内切酶将目的DNA片段和载体进行切割，电泳回收，目的DNA和载体，然后利用T4DNA连接酶既能连接粘性末端又能连接平末端的特性对切割后的片对进行连接，构建重组质粒。

（3）转化至受体细胞构建基因工程菌

用原生质体转化法，将重组质粒导入酵母菌内。

首先，用纤维素酶处理对数生长期的酵母菌，除去细胞壁得到原生质体，然后将原生质体悬浮于含有钙离子的缓冲液中，加入PEG和重组质粒，使重组质粒导入受体细胞。

（4）培养工程菌

采用分阶段连续培养，为工程菌提供恒定的生长环境，控制生长速率。

（5）除菌过滤和产物的分离纯化

（6）包装

4.最近发现一种新型病毒，你如果开发一种该病毒的诊断试剂？

利用单克隆抗体进行新型病毒的快速诊断，酶免疫测定用抗体诊断试剂的开发：

（1）将病毒抗原一定量注射到实验鼠体内，待体内免疫后从实验鼠的脾脏内取得抗原激活后的B淋巴细胞，与骨髓瘤细胞进行融合，筛选纯化杂交瘤细胞，得到单克隆抗体。

（2）将单克隆抗体包被在固相载体上，加入待检标本，其中抗原既可与载体上的抗体相结合，洗去未结合的材料后，再加入该抗原的酶标抗体，洗去未结合的酶标抗体，加底物显色，用酶免疫检测仪测量颜色的光密度，就可以定量测定抗原。

5.某质粒载体具有Tetr和Kanr表型，在Kan抗性基因内有一BglⅠ的切点。

现用BglⅠ切割该载体进行外源基因克隆，问：

（1）重组质粒转化后涂皿时应加什么样的抗生素？

（2）培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型？

（3）如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组体？

1.含Tet抗性的抗生素

2.Tet（r）+Kan（r）+Tet（r）Tet（r）Kan（s）和Tet（r）Kan（r）

3.先将转化液涂皿在Tet平板上过夜培养，然后从平板上不同的单菌落中挑选细菌接种在新的Tet平板上作扩大培养纯菌落，再在纯菌落中挑选单菌落接种在含Tet,Kan的平板上进行检测，若在Tet,Kan平板上不生长的转化子即为含有插入片段的重组体，因此该纯菌落的细菌含有插入目的片段的重组质粒。

6.设计一种筛选杂交瘤细胞的实验方法，并简要说明基本原理。

淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后的可能出现的结果是：

淋巴细胞-淋巴细胞融合体、骨髓瘤细胞-骨髓瘤细胞融合体、淋巴细胞-骨髓瘤细胞融合体和许多未融合的淋巴细胞及骨髓瘤细胞，可以利用选择选择性培养基筛选杂交瘤细胞。

原理：

用次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶（T）配制HAT选择性培养基。

其中，氨基喋呤（A）能阻断DNA合成的主要途径，瘤-瘤融合细胞和瘤细胞因不能合成DNA而死亡，同时淋巴细胞-淋巴细胞融合体在这种培养条件下，几天内也会迅速死亡。

由于骨髓瘤细胞是次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）缺乏株，脾细胞内却有这种酶，因此淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合成的杂交瘤细胞可利用HGPRT，用次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T）合成DNA，是杂交瘤细胞得以生长。