慢病毒包装浓缩纯化滴度实验步骤.docx
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慢病毒包装浓缩纯化滴度实验步骤
一、包装细胞293T细胞的培养之五兆芳芳创作
一、293T细胞的冻存
1.随着传代的次数增加,293T细胞会出现生长状态下降,出现突变等.所以要在细胞购进时就进行冻存.
2.在细胞对数生长期进行冻存,增加细胞苏醒成活率.
3.倒去细胞上清液,参加D-Hank's液洗去残留的培养基.
4.参加0.25%的胰酶,消化10-20s后倒去.
5.镜下不雅察细胞变圆,细胞间间隙加大时,参加新鲜培养基吹打混匀.
6.细胞计数.
7.将细胞离心,1000rpm,2min.
8.按照计数结果参加细胞冻存液(70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO)重悬细胞,密度为3×106个/ml.
10.第二天将细胞放入液氮灌,并记实.
二、293T细胞的传代
1.当细胞生长至会合率达到80~90%需要对细胞进行传代操纵,以扩大细胞数量,维持细胞良好的生长状态.
2.消化细胞,办法同上.
3.细胞离心结束后,参加完全培养基重悬.密度为3×105个/ml.
4.分到10cm培养皿中,10ml/皿.
三、293T细胞的苏醒
1.当细胞传代次数过量(超出50代),细胞状态变差时或细胞出现污染事故时,需要丢弃并对开始冻存的细胞进行苏醒.
2.打开水浴锅,设置温度为40℃.
3.查抄细胞库记实,按照记实从液氮灌中取出冻存的细胞(需戴上棉手套,避免被冻伤),迅速丢入水浴锅中并快速晃悠,在1~2min内使细胞溶液完全溶解.
4.将1ml细胞溶液参加9ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿.
5.放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养.
6.第二天不雅察细胞存活率.倒掉旧的培养基,参加10ml新鲜培养基.
二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定
1.所用病毒检测引物为WPRE特异引物,序列如下
5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3'(forwardprimer),
5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3'(reverseprimer)and
5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3'(probe)
2.TaqManUniversalPCRMasterMix(AppliedBiosystems,cat.no.4304437)
3.TaqManDNATemplateReagentKit(AppliedBiosystems,cat.no.401970)
4.TaqManRNasePcontrolreagent(AppliedBiosystems,cat.no.4316844)
用于包装的293T细胞的培养
用于包装的293T细胞(ATCCNo.CRL-11268)必须选择处于生长旺盛期,细胞状态较佳,存活率90%以上,细胞边沿清晰,传代次数较低.任什么时候候细胞会合率都禁绝达到100%.
慢病毒的包装
1.预先准备3个T150瓶的293T细胞,培养基为DMEM+10%FBS,1%Glutamax,1%青霉素-链霉素.
2.将细胞分到12分到12个T150瓶中,每瓶的细胞密度是8×106个.
3.第二天,镜下查抄细胞.细胞融合度应大致为30-40%,散布均匀.
4.转染前1小时,取出细胞板,去除原有细胞培养基,参加20ml的Opti-MEM培养基,将细胞送回培养箱.
5.取两支无菌的50ml离心管,其中一支中参加252μgpNL-EGFP/CMV/WPREDU3载体质粒,168μgpCD/NL-BH*DDD包装质粒和84μgpLTR-G质粒,用Opti-MEM培养基补齐到18ml.另一支中参加500μlTrans-EZ溶液和17.5mlOpti-MEM培养基,用电动移液器轻轻混匀.将Trans-EZ稀释液滴加到质粒管中,边加边轻轻晃匀.
关头步调:
推荐使用Qiagen质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒.
6.室温孵育20分钟,使DNA和Trans-EZ充分结合形成转染复合体.
7.取1支5ml的移液管,将得到的DNA-Trans-EZ复合体均匀滴参加到细胞培养板中,每板3ml.来回晃悠培养板,混匀后放回到5%二氧化碳培养箱.每一皿细胞培养盘不要超出6盘.
8.6小时后,移去细胞上清,改换为17ml的DMEM完全培养基.
9.转染后一天不雅察细胞,所有的细胞应当都是安康的并且密度接近60-80%.如果所转染质粒带有GFP荧光,那么这时候可以看到大于95%的细胞都是带有荧光的.
10.将细胞送回培养箱持续培养2天(36-48小时).在这个进程中,细胞会逐渐融合形成多核体,大多数的细胞依然贴壁.
11.收集所有的上清,分装到50ml离心管中.
12.4℃,500g离心10分钟,除去脱落的细胞和大的细胞碎片.
13.总的上清约为204ml,用250-ml0.45μmPVDF过滤装置过滤.如果发明滤膜被堵住,表示为过滤速度变慢,改换新的滤器.
慢病毒的浓缩与纯化
办法一超速离心沉淀法
1.取6个Ultra-clearSW28离心管,用70%乙醇消毒后,放在超净任务台中打开紫外灯持续消毒30分钟.
2.每个Ultra-clearSW28离心管中参加约32ml的预先处理的病毒上清液.
3.取一支10ml的移液管,吸取12ml20%的蔗糖溶液.将移液管一直拔出到离心管的底部,迟缓将蔗糖溶液打出4ml.同样地,将剩下8ml的蔗糖溶液辨别参加到另两个离心管中.另取一支洁净的移液管,对剩下3管进行同样处理.
4.用PBS调整各管的重量,使对应的离心管之间的重量相差不超出0.1g.
5.顺次序将所有6个离心管放入BeckmanSW28超速离心转头中.
7.小心将管子从转头中取出.倒掉上清,将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余的上清流干.吸掉剩余的液滴.在管底应当有可见的沉淀.
8.每管中参加100ml不含钙和镁的PBS洗下沉淀.
9.将SW28超速离心管拔出到50ml锥底离心管中,盖上盖子.
10.在4℃溶解2小时,每隔20分钟轻轻震荡.
11.4℃,500g离心1分钟,使溶液集中于管底.
12.用200μl移液器轻柔吹打使沉淀重悬.避免产生泡沫.将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中.
13.集中后的病毒悬液分装成50μl每份,保管在成品管中.用碎干冰速冻后储存在-80℃.
办法二PEG-8000浓缩法
PEG(聚乙二醇)是高份子聚合物,具有高亲水性,在溶液中会吸收大量水分,削减病毒之间的距离,使病毒与病毒能够很容易的聚合在一起,病毒的相对浓度提高,达到沉淀浓缩的目的.
5XPEG8000+NaCl配制称取NaCl8.766g;PEG800050g溶解在200mlMilli-Q纯水中;121摄氏度30min湿热灭绝30min;保管在4℃.
1.使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液;
3.每20~30min混杂一次,共进行3-5次;
4.4度放置留宿;
5.4度,4000g,离心20min;
6.吸弃上清,静置管子1~2分钟,吸走残存液体;
7.参加适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀;
8.集中后的病毒悬液分装成50μl每份,保管在成品管中.用碎干冰速冻后储存在-80℃
病毒滴度的测定
稀释计数法
滴度单位:
TU/ml,指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数.”TU”为”transducingunits”的缩写,中文为“转导单位”,暗示可以传染并进入到靶细胞中的病毒基因组数.
第一天细胞准备
将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×105/ml,参加96孔板,100μl/孔,为每个病毒准备10个孔.放入37℃,5%CO2培养箱中培养.
第二天加病毒
在EP管中做10倍梯度稀释,连续10个稀释度.稀释办法如下:
每种病毒准备10个1.5mlEP管,每管参加90μl培养液,往第一个管中参加10μl病毒原液,混匀后,吸取10μl参加第二个管混匀.依此类推,做十个稀释度(10~10-8).
吸取96孔板中原有的培养基,参加含稀释好的病毒液.并做好标识表记标帜.
第三天追加培养液
在每个孔再参加100μl完全培养液,利于细胞的生长.
第五天不雅察结果并计较滴度
在荧鲜明微镜下不雅察结果,并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数.假定为X和Y,则滴度(TU/ml)=(X+Y*10)*1000/2/X孔的病毒液的含量(μl).
定量PCR法
病毒传染1天前,取6孔板接种HOS细胞.每孔细胞为5×104个.
接种细胞24小时后,取两个孔的细胞用血球计数板计数,确定传染时细胞的实际数目,记为N.
弃去其他培养板中的培养基,改换为含有5μg/mlpolybrene的新鲜培养基.将浓缩病毒用培养基稀释200倍,也就是取1μl病毒参加到199μl的培养基中.在3个培养孔中辨别参加0.5μl,5μl和50μl的稀释病毒.
传染开始后20小时,除去培养上清,换为500μl含DNaseI(TakaraMirusBio,终浓度为10U/ml)的新鲜培养基.在37℃消化15分钟,这一步是要除去残存的质粒DNA.然后换为2ml正常的培养基,持续培养48小时.
用0.5ml0.25%胰酶-EDTA溶液消化细胞,在37℃放置1分钟.用培养基吹洗下,离心收集细胞.依照DNeasy试剂盒的说明抽提基因组DNA.每个样品管中参加200μl洗脱液洗下DNA.用DNA定量试剂盒定量(Bio-Rad).基因组DNA可以稳定保管在-20℃至少2个月.
准备PCR所需的试剂和样品.为病毒序列检测引物配总管Ⅰ:
2×TaqManMasterMix
25μl×n
Forwardprimer(100pmolml-1)
0.1μl×n
Reverseprimer(100pmolml-1)
0.1μl×n
Probe(100pmolml-1)
0.1μl×n
H2O
19.7μl×n
n=numberofreactions.例如:
总反响数为40,将1ml2×TaqManUniversalPCRMasterMix,4μlforwardprimer,4μlreverseprimer,4μlprobe和788μlH2O混和.震荡后放在冰上.
为人基因组序列检测引物配总管Ⅱ:
2×TaqManMasterMix
25μl×n
10×RNasePprimer/probemix
2.5μl×n
H2O
17.5μl×n
n=numberofreactions.例如:
总反响数为40,将1ml2×TaqManUniversalPCRMasterMix,100μl10×RNasePprimer/probemix和700μlH2O混和.震荡后放在冰上.
在预冷的96孔PCR板上完成PCR体系成立.从总管Ⅰ中各取45μl参加到A-D各行的孔中,从总管Ⅱ中各取45μl参加到E-G各行的孔中.
辨别取5μl质粒尺度品和待测样品基因组DNA参加到A-D行中,每个样品重复1次.另留1个孔参加5μl的水做为无模板对照(no-templatecontrol).
辨别取5μl基因组尺度品和待测样品基因组DNA参加到E-G行中,每个样品重复1次.另留1个孔参加5μl的水做为无模板对照(no-templatecontrol).
所使用定量PCR仪为ABIPRISM7000定量系统.
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