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单抗材料
一、绪论2
(一)体外培养2
(二)杂交瘤技术2
(三)污染2
1.细菌污染及判断3
2.真菌污染及判断3
3.支原体污染及判断4
4.病毒污染及判断4
二、单克隆抗体制备5
(一)骨髓瘤细胞的选择5
1.杂交瘤选择原理5
2.骨髓瘤细胞系种类6
3.骨髓瘤细胞的制备6
(二)免疫B淋巴细胞的制备6
(三)细胞融合7
1.定义7
2.融合方法7
3.融合诱导物7
4.融合条件7
5.杂交瘤细胞的选择性培养8
(四)杂交瘤细胞的克隆化8
1.定义与原理8
2.克隆方法8
(五)杂交瘤细胞的保存与复苏9
1.细胞冻存的目的9
2.冻存原理9
3.冻存保护剂9
4.冷冻速度10
5.冷冻保存温度10
6.冻存方法10
7.复苏11
(六)单克隆抗体大量制备11
1.体内诱生法11
2.体外大量培养法11
(七)单克隆抗体的鉴定12
1)McAb特异性的鉴定12
2)McAb亚型分析12
3)McAb的亲和力比较12
4)McAb效价测定13
5)McAb识别抗原表位测定13
6)总结13
(八)单克隆抗体的纯化13
一、绪论
(一)体外培养
1.定义:
将活体结构成分(如活体组织、活体细胞、活体器官等)甚至活的个体从体内或其寄生体内取出,置于类似于体内生存环境的体外环境中生长和发育的方法。
2.体外培养(invitroculture)分为组织培养(tissueculture)、细胞培养(cellculture)及器官培养(organculture)等类别。
组织培养:
指从生物体内取出活的组织(多指组织块)在体外进行培养的方法。
细胞培养:
指将活细胞(尤其是分散的细胞)在体外进行培养的方法。
器官培养:
指从生物体内取出活的器官(一般是胚胎器官)、器官的一部分或者器官原基在体外进行培养的方法。
(二)杂交瘤技术
1.定义:
肿瘤细胞与体细胞融合形成的杂交细胞称为杂交瘤细胞。
建立杂交瘤细胞系的技术称为杂交瘤技术(hybridomatechnique)。
2.淋巴细胞杂交瘤可分为:
①T淋巴细胞瘤(胸腺瘤)杂交而成淋巴细胞杂交瘤,主要分泌淋巴因子。
②B淋巴细胞瘤(浆细胞瘤)杂交而成淋巴细胞杂交瘤,主要分泌单克隆抗体。
B淋巴细胞杂交瘤细胞经过单个细胞培养(克隆化)形成细胞系,它们分泌的抗体均具有完全相同的抗体结构,氨基酸顺序和特异性等都是一致的,这种抗体称为单克隆抗体(简称单抗或McAb)。
而动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系,重排后具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。
当机体受抗原刺激时,抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。
被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞(浆细胞)和记忆B细胞,大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。
如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养,就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群,即单克隆。
单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体,就是单克隆抗体。
单克隆抗体的最显著特点:
均一性和(只识别一种抗原决定簇的)特异性。
B淋巴细胞杂交瘤技术是一项周期长、高度连续性的实验技术。
涉及大量细胞组织培养,免疫化学和细胞免疫学方法。
具体包括:
a、两种亲本细胞的选择(骨髓瘤细胞及免疫活性脾细胞)和制备;b、细胞融合;c、杂交瘤细胞的选择性培养;d、杂交瘤细胞的克隆化;e、单抗的制备;f、特性鉴定和纯化等。
(三)污染
与培养无关的杂质混入培养系统,称为污染(contamination)。
广义的污染包括各种微生物污染、各种培养物间的交叉污染和化学物质的污染。
后两种污染比较容易预防,而微生物污染的预防及处理就比较困难。
因此,通常论及培养物污染多指各类微生物(包括细菌、真菌、支原体、病毒等)对培养细胞的污染。
在体外培养中微生物污染是最为致命的失败原因。
体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力,因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染(如细菌、真菌、支原体、病毒等)、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染(如抗体、补体)。
对于天然培养基,污染主要来源于取材过程及生物材料本身,应当严格选材,严格操作。
对于合成培养基,污染主要来源于配制过程,配制所用的水,器皿应十分洁净,配制后应严格过滤除菌。
由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力,而且培养基中的抗生素抗污染能力有限,因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。
支原体污染后,因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存,培养基一般不发生浑浊,细胞无明显变化,外观上给人以正常感觉,实则细胞受到多方面潜在影响,如引起细胞变形,影响DNA合成,抑制细胞生长等。
1.细菌污染及判断
⑴定义:
细菌(bacteria)是一种原核细胞微生物,其大小以微米(μm)计。
在倒置显微镜下观察,可见(一团或一片)点状的细菌颗粒并不停颤动,原来清晰的培养背景变得模糊。
⑵初期:
由于受培养系统内的抗生素的作用,其繁殖处于抑制状态,细胞生长不受明显影响,这种情况用倒置相差显微镜观察不易判断。
怀疑培养细胞细菌污染时,可以将10ml左右的细胞悬液以1000r/min离心5min,再用无菌PBS洗涤2次,加入无抗生素的培养液2ml后,将细胞置于37℃培养箱培养。
如果受到污染,在24h内细菌大量繁殖可获得阳性结果。
⑶中/终期:
当污染的菌量比较大或者细菌增殖到一定基数时,大约每20min一代的细菌增殖速度,会使培养系统内很快产生大量细菌,后者不仅会消耗培养系统内大量的养分,也能释放大量的代谢产物。
几小时之后,即可导致培养液外观浑浊。
酸性代谢产物的积累可使培养液呈黄色或黄绿色。
镜检可见,满视野颤动地点状黑色颗粒,背景模糊,细胞状态差。
2.真菌污染及判断
⑴定义:
真菌(fungus)是一种真核细胞微生物,比细菌大几十倍以上。
真菌对干燥、阳光、紫外线以及一般的消毒剂有较强的抵抗力。
单细胞真菌称为酵母菌。
多细胞真菌能长出菌丝及孢子并交织成团,称丝状菌,又称霉菌(mold)。
⑵酵母菌污染:
类似细菌污染。
在倒置显微镜下可观察到圆形或卵圆形的酵母菌。
开启培养皿,可闻到像酒或酸的发酵异味。
随着培养液酸度下降,培养液外观呈现黄绿色。
⑶霉菌污染:
在倒置显微镜下可观察到呈丝状或树枝状的菌丝。
这些菌丝在培养液中可以长成白色菌丝块,如棉絮状漂浮在培养液中,有的附着在培养器皿或培养物表面。
在污染真菌后,菌丝会在培养板孔间蔓延而很快波及邻孔,一旦发现霉菌污染该培养板应立即丢弃。
3.支原体污染及判断
定义:
支原体(mycoplasma)直径在0.2μm左右,是一种无细胞壁、具有高度异型性、可以穿过常规除菌滤膜的最小原核生物。
由于它无细胞壁,故对理化因素(如65℃下灭活、普通清洁剂和消毒剂处理)都比较敏感。
支原体依靠附着在宿主细胞表面,与细胞竞争培养液中的单糖、氨基酸和核糖前体物质而繁殖生长。
受支原体污染的培养细胞在显微镜下无特殊的外观表现,培养液不浑浊。
由于对支原体污染难以观察到特殊的外观变化,要在污染早期进行发现和处理相当困难。
在细胞培养过程中,如果在显微镜下发现破碎的细胞甚多,培养细胞需要频繁改善营养环境才能支持长期传代培养时,应怀疑培养物可能受支原体污染。
必要时应借助有关检测技术对培养物进行特殊检测,如DNA荧光染色法、聚合酶链反应方法、免疫学方法以及支原体培养法。
支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞型微生物。
自然界分布广泛,种类多,有80余种,分为两个属:
一为支原体属(Mycoplasma),有几十个种;另一为脲原体属(Ureaplasma),仅有一种。
与人类感染有关的主要是肺炎支原体和解脲脲原体。
支原体无细胞壁,多呈不规则球状、长丝状,可分枝,营寄生共生或腐生。
一般侵害对象为动植物,可造成多种疾病。
细胞培养(特别是传代细胞)被支原体污染是个世界性问题。
国内外研究表明,95%以上是以下四种支原体:
口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M.arginini)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)和菜氏无胆甾原体(A.laidlawii),为牛源性。
国外调查证明,大约有二十多种支原体能污染细胞,有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。
支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染(某些支原体在人体是正常菌群)、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染,等等。
4.病毒污染及判断
病毒(virus)是一种能通过细菌滤器,大小以纳米(nm)计,不能独立地利用外界营养物质进行自体繁殖的微生物,又称非细胞型微生物。
细胞培养中的病毒污染可以来自原宿主体细胞的潜伏性感染,也可以通过细胞膜受体或其他理化方法诱导后进入。
病毒进入细胞后,可以利用细胞作为宿主进行复制或装备新的病毒颗粒(生产性感染),或将自身的遗传物质整合进宿主细胞的DNA内(潜伏性感染)。
这两种方式都可以改变培养物的生物学性状,影响培养细胞的生长或干扰实验结果的客观性。
判断培养的细胞是否被病毒污染,其困难之处在于病毒种类的复杂性和相应的宿主细胞的特异性。
感染了病毒的宿主细胞形态学上不一定有显著的特异性的改变,因此仅依据用目测或显微镜观察到细胞形态学变化来判断病毒的污染是不充分的。
应根据不同的病毒选用不同的方法,如红细胞吸附试验、接种鸡胚或实验动物、与已知的宿主细胞进行联合培养,以及利用特异的血清学反应等等,才足以判断培养的细胞是否存在某种病毒的污染。
这些方法都需要建立相应病毒的参照系统,属于病毒学的研究范畴,在普通实验室不易推广。
要判断培养细胞是否被病毒污染,还可以应用电子显微镜观察或用商品化的试剂进行免疫学染色。
有条件的实验室可以设计出对某种病毒特异的DNA引物,再用PCR方法对培养的细胞进行鉴定。
二、单克隆抗体制备
1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在细胞杂交技术的基础上,创建立杂交瘤技术,他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细胞融合,成为杂交细胞系,既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性,又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。
将这种杂交瘤作单个细胞培养,可形成单细胞系,即单克隆。
利用培养或小鼠腹腔接种的方法,便能得到大量的、高滴度的、非常均一的抗体,其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的,而且在培养过程中,只要没有变异,不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。
这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的。
这项新技术从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性问题,可用于探讨①蛋白质的精细结构;②淋巴细胞亚群的表面新抗原;③组织相容性抗原;④激素和药物的放射免疫(或酶免疫)分析;⑤肿瘤的定位和分类;⑥纯化微生物和寄生虫抗原;⑦免疫治疗和与药物结合的免疫-化学疗法(“导弹”疗法,利用单克隆抗体与靶细胞特异性结合,将药物带至病灶部位。
)因此,单克隆抗体可直接用于人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究,为人类恶性肿瘤的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔前景。
(一)骨髓瘤细胞的选择
1.杂交瘤选择原理
为了便于筛选出成功融合的杂交瘤细胞,需要选择DNA合成主要途径缺陷型的骨髓瘤细胞【次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶激酶(TK)】与脾细胞融合,因为这种缺陷型的瘤细胞正常的核酸合成途径被氨基喋吟(aminopterin)阻断后,由于缺失这些酶,即使补充它的底物次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T),核酸合成的旁路也不能起到救援的作用,结果导致瘤细胞死亡。
而杂交瘤细胞因带有B细胞的全套基因,在HAT存在的条件下借助于HGPRT和TK的作用通过替代的核酸合成途径能正常合成DNA和RNA。
所以杂交瘤能正常地生长繁殖而被选择出来。
未被融合的游离的B细胞只能存活10d而后自行死亡。
这就是用HAT培养基进行选择的原理。
通常是HGPRT-的骨髓瘤细胞。
要得到这种细胞需要做两件事,第一是得到骨髓瘤细胞,第二步是诱导和筛选出HGPRT-的骨髓瘤细胞。
一般可以通过向小鼠腹腔内注射碳氢化合物、石蜡油类物质而诱发其产生骨髓瘤细胞,通常的做法是注射降植烷(Pristane,又称姥鲛烷)。
诱导出骨髓瘤后,在无菌条件下取出此骨髓瘤,用完全培养基培养一段时间后,再用8-氮杂鸟嘌呤或者5-溴脱氧尿嘧啶核苷酸进行筛选即可得到HGPRT-的骨髓瘤细胞。
对于第一步的诱导过程,目前只有BALB/C和N2B品系的小鼠才具有高度的敏感性。
目前最常用的骨髓瘤是来自BALB/C小鼠的,为了减小远亲属种系之间的排斥反应,单抗制备中用来免疫的动物品系应该与骨髓瘤来源的品系相同。
1972年,Potter第一次从Balb/C小鼠中分离骨髓瘤细胞株MOPC,第一次用于脾细胞融合的骨髓瘤细胞株为P3-X63-Ag8,简称X63或P3,它由Milstain实验室将P3K(源自MOPC)细胞系经8-Aza筛选得到。
X63自身不能分泌完整的免疫球蛋白,但是可以合成并分泌γ1重链和κ轻链,因此如果用X63骨髓瘤细胞与脾脏融合,得到的融合细胞除分泌脾细胞的抗体外,还可以分泌X63的γ1链和κ链。
后来又从P3K细胞系选育出另一变种P3-NS1-Ag4-1,简称NS-1,它不能合成γ1重链,能合成κ轻链,但是合成之后在细胞内降解而不能被分泌出来。
后来人们又陆续地筛选出完全不产生自身Ig的骨髓瘤细胞系,如最常见的SP2/0。
2.骨髓瘤细胞系种类
目前可用于融合的骨髓瘤细胞系种类见下表:
细胞系
简称
来源
染色体数
分泌Ig链
P3-X63-Ag8
P3或X63
Balb/C小鼠MOPC21
65
γ1,κ
P3-NS1/1-Ag4-1
NS1
P3
65
κ(非分泌型)
SP2/0-Ag14
SP2/0
P3和Balb/C脾细胞杂交
72
-
P3-X63-Ag8.653
P3-653
P3
58
-
P3-X63-Ag8-UI
P3UI
P3
-
FO
SP2/0-Ag14克隆
72
-
S194/5.XX0.BU1
S194
Balb/C小鼠
κ(非分泌)
MPC11-X45.6TG
MPC11
Balb/C小鼠
62
IgG2b,κ
3.骨髓瘤细胞的制备
常用的小鼠骨髓瘤细胞有:
SP2/0、NS-1、P3-653、FO四种。
通常这些细胞生长在含10%FCSDMEM培养液中,细胞密度达到5×
~1×
/ml时,SP2/0细胞处于指数生长期,那时的倍增时间是15-20小时,选择对数生长期细胞进行融合,因为处于相似分裂期的两个亲代细胞易于融合。
免疫脾细胞中参与融合的主要是处于分化、增殖状态的浆母细胞。
骨髓瘤细胞以悬浮或轻微附着形式生长。
附着细胞用滴管冲吹或轻轻叩击瓶子,细胞就容易从瓶壁脱落,不需要用胰酶消化。
在用于融合前把骨髓瘤细胞培养在每毫升含20微克8-氮鸟嘌呤(AG)中,以排除任何返祖现象(酶缺损发生逆转)发生。
*对数生长期:
当微生物生长一定阶段后,微生物的比生长速度达到最大,此时进入对数生长期,在对数生长期中若没有抑制或限制微生物生长的因素存在,因而微生物保持一个恒定的最大的比生长速度生长,细胞数量呈指数递增。
(二)免疫B淋巴细胞的制备
事实上,真正产生抗体的是效应B细胞,由于效应B细胞量太少(效应B细胞不能分裂),不易把它筛选出来。
制单克隆抗体时用的B细胞包含效应B细胞,让它们和瘤细胞融合后,杂种细胞有好多种,再筛选出杂交瘤,由于和效应B细胞融合形成的杂交瘤能分裂,这时产生抗体的杂交瘤就多,所以产生的抗体量就多,此时就可筛选出产生所需抗体的杂交瘤。
也就是说,用B细胞制备单克隆抗体,而真正发挥作用的是其中的效应B细胞。
融合成功的重要因素之一就是应用何种免疫方法。
为了提高获得高分泌抗体杂交瘤的机会,就必须设法增加小鼠体内分泌该种抗体的B淋巴细胞数量。
最常用的方法是初次免疫后,接着再免疫及加强免疫后3-4天取脾、淋巴结,制备细胞。
一般一个小鼠脾脏能获得5×
~2×
脾细胞,一次融合活细胞数不能<90%。
(三)细胞融合
1.定义
细胞融合(cellfusion)是在自发或人工诱导下,两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。
基本过程包括细胞融合形成异核体(heterokaryon)、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的杂种细胞。
有性生殖时发生正常的细胞融合,即由两个配子融合成一个合子。
2.融合方法
同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并,称自发融合;异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合,称诱发融合。
诱导细胞融合的方法有三种:
生物方法(如病毒诱导融合法)、化学方法(如聚乙二醇PEG诱导融合法)、物理方法(如电场诱导融合法)。
某些病毒如:
灭活的仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白(fusionprotein),可介导病毒同宿主细胞融合,也可介导细胞与细胞的融合,因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。
化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变,去掉作用因素之后,质膜恢复原有的有序结构,在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。
3.融合诱导物
细胞融合的诱导物种类很多。
常用的主要有生物法用灭活的仙台病毒(Sendaivirus),化学法如用聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)和物理法如电脉冲。
目前应用最广泛的是聚乙二醇,因为它易得、简便,且融合效果稳定。
PEG的促融机制尚不完全清楚,它可能引起细胞膜中磷脂的酰键及极性基团发生结构重排。
动植物细胞融合方法不同,生物法利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。
PEG促融机制:
在细胞工程中普遍认为聚乙二醇(PEG)分子能改变各类细胞的生物膜结构,使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组,由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用,从而使细胞发生融合,形成杂种细胞。
4.融合条件
融合时的温度变化、融合剂的分子量及浓度变化、脾细胞与骨髓瘤细胞数的比例都对融合起着至关重要的作用。
A、融合中使用的培养基从冰箱中取出后都需要37℃温育,有助于细胞融合。
B、PEG应选用:
相对分子质量据相关文献记载有两种:
一是1000—1500为宜;二是常用4000。
常用浓度为50%,pH8.0~pH8.2(用10%NaHCO3调整)。
分子量小的PEG,融合效应差,又有毒性,分子量过大,则粘性太大,不易操作。
50%浓度,pH偏碱时融合效应最高。
也有采用30%~50%浓度的PEG加上10%二甲亚砜。
不同批号的PEG,即使分子量相同,但融合率却有明显差异,选用时必须注意。
C、融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例在2:
1—10:
1之间,5:
1为最佳效果。
D、融合后,融合板应存放于37℃,5%CO2培养箱条件下培养为宜。
5.杂交瘤细胞的选择性培养
一般细胞合成DNA有两条途径:
①主要合成途径:
利用糖和氨基酸合成核苷酸,进而合成DNA,而叶酸拮抗剂氨基喋呤可阻断该途径。
②补救途径:
当叶酸代谢受阻时,细胞通过HGPRT和TK,利用核苷酸的前体合成核苷酸作为进一步合成DNA的原料。
HAT中含有次黄嘌呤(hypoxanthine,H)、氨基喋呤(aminopterin,A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)
HAT培养基的选择原理:
⑴A是叶酸拮抗剂,可阻断细胞叶酸代谢,迫使细胞通过补救途径,依靠HGPRT利用培养液中的H和T合成DNA。
⑵融合用骨髓瘤细胞缺乏HGPRT,不能通过补救途径合成DNA而死亡。
⑶免疫脾淋巴细胞本身不能长期培养,一般在2周内自然死亡。
⑷异核杂交瘤细胞由于从免疫脾细胞获得了HGPRT和/或TK的基因,并从骨髓瘤细胞中获得肿瘤细胞不断生长增殖的特性,使之在HAT培养液中能够生长增殖。
(四)杂交瘤细胞的克隆化
1.定义与原理
克隆(clone):
一个共同前体通过无性繁殖而形成的一群基因结构相同的细胞或个体。
在筛选出的含阳性上清液的培养孔中,通常会有2个以上的杂交瘤集落。
有的杂交瘤集落可能不分泌抗体或分泌的并非所需抗体,只有其中的某一个集落才是分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。
由此,必须利用克隆培养方法把他们分开,选出所需杂交瘤。
另外,即使在分泌抗体的杂交瘤细胞中,部分细胞也会因传代过程中染色体的丢失而失去分泌抗体能力,这些细胞往往生长较快,如不及时利用克隆方法,将这些细胞分开就会影响能分泌抗体的杂交瘤细胞的生长。
所以,对杂交瘤细胞进行克隆培养,是保证阳性杂交瘤细胞能处于优势生长的有效途径。
2.克隆方法
常用的克隆方法有:
有限稀释法(limitingdilution,LD)、软琼脂法、直接挑取法及荧光激活细胞分离仪(FACS)分离法。
①有限稀释法(最常用的克隆方法):
通过适度稀释达到分离单个细胞进行培养的目的。
有限稀释法最大的优点在于操作简便、克隆率较高,特别适用于专一性细胞比例低于1/1000杂交瘤细胞的克隆化培养。
②软琼脂法:
是在琼脂糖凝胶半固体培养基中使用细胞增殖的方法。
③显微挑选法:
是以显微镜操作术用微细吸管将单个克隆细胞选出,分别进行培养。
④FACS法:
利用McAb、免疫荧光和激光原理对细胞进行定性或定量流式细胞光度分析与分离,分离后将选出的杂交瘤细胞放入96孔板中培养。
(五)杂交瘤细胞的保存与复苏
1.细胞冻存的目的
当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后,必须将一部分杂交瘤细胞保存,否则在连续传代的过程中,可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。
另外在长期的培养过程中,难免不发生污染以至于毁灭。
所以必须冷藏保存一部分。
细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。
利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存,可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来,这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。
而且适度地保存一定量的细胞,可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种,起到了细胞保种的作用。
细胞冷冻储存在-80℃冰箱中可以保存半年之久;细胞储存在液氮中,温度达-196℃,理论上储存时间是无限的。
2.冻存原理
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融,实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂,这两种物质能提高细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细胞内冰晶的形成,从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
复苏细胞应采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化,避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
3.冻存保护剂
冻存保护剂(Cryoprotectant)是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质(常为溶液)。
细胞悬液中加入冷冻保护剂可保护细胞免受溶液损伤和冰晶损伤。
冷冻保护剂同溶液中的水分子结合,发生水合作用,弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成.同时冷冻保护剂可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度,降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度,使细胞免受溶质的损伤。
冷冻保护剂根据其是否穿透细胞膜可分为渗透性和非渗透性两类。
渗透性冷冻保护剂多是一些小分子物质,可以透过细胞膜渗透到细胞内。
该类保护剂主要包括二甲基亚砜(DimethylSulfoxide,DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。
其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前,渗透到细胞内,在细胞内外产生一定的摩尔浓度,降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度,从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤同时。
细胞内水分也不会过分外渗,避免了细胞过分脱水皱缩。
在使用该类冷冻保护剂时,需要一定时间进行预冷,在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。
目
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