马铃薯茎尖脱毒及脱毒苗快繁技术操作规程.docx

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马铃薯茎尖脱毒及脱毒苗快繁技术操作规程

马铃薯茎尖脱毒及脱毒苗快繁技术操作规程

1马铃薯茎尖脱毒技术操作规程

马铃薯健康种薯的生产方法主要有利用茎尖脱毒快繁技术生产无病毒种薯、田间系选生产良种和实生种子生产无毒实生薯等，其中植物茎尖分生组织培养脱毒技术（即茎尖脱毒）在实际的农业生产中应用最为广泛并取得了巨大成功。

茎尖脱毒技术是根据病毒在植物体内分布不均和茎尖分生组织带毒少的原理，结合使用钝化病毒的热处理方法，通过剥离茎尖分生组织进行培养获得脱毒植株。

这一技术具有周期短、效率高、能与组织培养快速繁殖相结合等特点。

目前除一些类病毒外，绝大多数植株病毒都可以通过茎尖脱毒技术进行脱除。

经茎尖分生组织培养获得的植株经病毒检测并确认其不带病毒后可进一步利用，对仍带有病毒的株系进行淘汰或再脱毒。

目前，马铃薯茎尖脱毒技术几乎在所有马铃薯生产国家得到应用，其可以长期保持优良品种的生产潜力，生产无病毒的基础薯，并通过一定的良种繁育体系，源源不断地为生产提供优良的健康种薯。

现将马铃薯茎尖脱毒技术的操作规程做一详细介绍。

缩略语

ELISA

Enzyme-linkedimmunosorbentassay

酶联免疫吸附测定

NASH

Nucleicacidspothybridization

核酸斑点杂交

R-PAGE

Returnpolyacrylamidegelelectrophoresis

往复双向聚丙烯凝胶电泳

PLRV

Potatoleafrollvirus

马铃薯卷叶病毒

PVY

PotatovirusY

马铃薯Y病毒

PVX

PotatovirusX

马铃薯X病毒

PVS

PotatovirusS

马铃薯S病毒

PVM

PotatovirusM

马铃薯M病毒

PVA

PotatovirusA

马铃薯A病毒

PSTVd

Potatospindletuberviriod

马铃薯纺锤块茎类病毒

MS

Murashige&Skoog（1962）

MS培养基

BA

6-Benzylaminopurine

6-苄胺基嘌呤

CCC

Chlormequatchloride

矮壮素

IBA

Indolebutyricacid

吲哚丁酸

NAA

1-naphthlceticacid

萘乙酸

HRP

HorswradishPeroxidase

辣根过氧化物酶

AKP

AlkainePhosphatase

碱性磷酸

PVP

Polyvinylpyrrolidone

聚乙烯吡咯烷酮

1.1设备条件

1.1.1试剂配置室

用于配制试剂、制作培养基的工作室。

室内应有耐酸碱、带电源的试验台，药品柜及制作培养基需要的各种化学试剂等，冰箱，不同感量的天平，各种规格的玻璃仪器（容量瓶、广口瓶、烧杯、量筒、移液管、玻璃棒）等。

1.1.2洗涤及灭菌室

用于培养瓶的洗涤、培养基和剪刀等接种器具的灭菌。

室内应有洗涤槽，放置培养瓶的架子，高压灭菌锅等。

1.1.3无菌室

用于茎尖剥离或脱毒苗茎切段繁殖的接种室。

室内应有紫外灯，超净工作台，解剖镜，培养瓶架，以及酒精灯，解剖针和弯头手术剪等。

1.1.4培养室

用于茎尖组织和脱毒苗的培养。

室内应具备带有日光灯照明的多层培养架，空调、医用双层小推车、温湿度自记仪等。

1.2材料的选择

选择适销对路的、生产上主栽的或具有某种特性的优良品种作为脱毒材料。

但是实践证明，同一品种个体之间在产量或病毒感染程度上都有较大的差异。

凡田间植株生长好、产量高的单株往往感染的病毒种类少或者浓度低，脱毒效果好于病毒症状严重、低产的单株。

因此，脱毒之前，应在施肥量中等或土壤肥力中等（施用氮肥量过多的地块，病毒症状易隐蔽）的地块，根据株型、叶形、花色等标记，选择具有品种典型性、生长势强、无病症表现的植株；收获时对标记的植株单独收获，并根据薯形、皮色、芽眼深浅等选择典型性的、无病斑虫蛀和机械损伤的大块茎，作为茎尖脱毒的基础材料。

1.3类病毒和病毒的检测

1.3.1类病毒的检测

对于马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd），目前尚很难通过茎尖脱毒或化学抑制剂等方法去除，因此，应先对田间标记的入选单株通过非放射性核酸斑点杂交法（NASH）或往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（R-PAGE）等方法，筛选无马铃薯纺锤块茎类病毒的植株或块茎作为茎尖脱毒材料。

1.3.1.1非放射性NASH检测PSTVd

1.3.1.1.1原理

利用荧光标记探针，通过斑点杂交非放射性检测PSTVd的试剂盒包括：

缓冲液制备、样品提取和尼龙膜吸附、预杂交、杂交、漂洗、封膜、抗体孵育、信号发生及CDP-Star（底物）检测。

本试剂盒提供的PSTVd探针是通过随即引物合成系统标记的。

DNA的合成以九核苷酸引物引导，在变性PSTVd-cDNA上由大肠杆菌聚合酶Ⅰ克列诺大片段催化完成，标记过程中，荧光标记的脱氧尿苷（fl-UTP）部分替代脱氧胸苷（dTTP），合成荧光探针。

杂交之后，加入抗碱性磷酸酶抗体共同孵育，以检测杂交分子是否存在，然后洗掉多余抗体，加入底物CDP-Star。

CDP-Start是一种浓度小于1.5%（W/V）的溶液，成分为Disodium-2-Chloro-5-（4-methoxyspiro[1,2-dioxetane-3,2-（5’-chloro）-tricyclo[3,3,1,1]decan]

-4yl）Phenylphosphate）。

探针携带的碱性磷酸酶（AP）可以将性质稳定的CDP-Star催化酶解，反应过程伴有短暂的荧光放出，使杂交膜在加入底物后的最初几个小时内曝光胶片，并产生较强信号。

所需试剂和设备（可检测80个样品）

1.3.1.1.2试剂

20×无水柠檬酸钠-氯化钠缓冲液（SSC）

2包（各50ml）

10%十二烷基硫酸钠（SDS）

2管（各5ml）

20%硫酸葡聚糖

2管（各2.5ml）

封膜缓冲液

2管（各11ml）

稀释缓冲液

2管（每包可配制500ml溶液）

荧光素标记PSTVd探针

2管（各20ul）

抗荧光素碱性磷酸酶标记抗体

2管（各10ul）

牛血清蛋白组分V

2包（150mg）

吐温-20

2管（各1.35ml）

胞苷二磷酸-Star溶液（CDP-Star）

2管（各2ml）

Kodak（柯达）显影液

2管（各50ml）

Kodak（柯达）定影液

2管（各50ml）

1.3.1.1.3设备

杂交用塑料袋

显影夹

曝光盒

HybondN+尼龙杂交膜

Kodak胶片（13×18cmX-OMATXAR-2）

手套

数据记录表

塑料盒

1.3.1.1.4所需其他试剂盒设备

1.3.1.1.4.1试剂

37%甲醛（福尔马林）

苯酚

氯仿（三氯甲烷）

37%盐酸

1.3.1.1.4.2设备

样品处理用塑料袋

Eppendor管

微型离心管

可调移液管

无菌移液管头

实验室常规玻璃器皿

转动摇床

震荡温浴，55℃

紫外线交联仪或真空烘箱，80℃

医用镊子

涡旋振荡器

热塑料口器

1.3.1.1.5溶液制备

使用无菌水

1.3.1.1.5.1缓冲液

20×SSC

50ml

0.3mol/L无水柠檬酸钠

4.42g

3mol/L氯化钠

8.76g

1.3.1.1.5.2提取缓冲液

37%甲醛

40ml

10×SSC

20ml20×SSC+20mlH2O

1.3.1.1.5.3杂交缓冲液

定容至10ml

5×SSC

2.5ml20×SSC

封膜缓冲液1/20

0.5ml封膜液

0.1%SDS

0.1ml10%SDS

5%（W/V）稀释缓冲液

1.0ml50%稀释缓冲液

1.3.1.1.5.4稀释缓冲液

定容至600ml

100mmol/LTris-Hcl

7.266g

300mmol/LNaCl

10.52g

HCl调节pH值至9.5

*90ml用于封膜

50ml用于抗体孵化

450ml用于漂洗

1.3.1.1.5.5显影液

50ml（1管）+175mlH2O稀释

1.3.1.1.5.6定影液

50ml（1管）+175mlH2O稀释

1.3.1.1.6样品制备

采样时注意在塑料袋上做好标记，点样时膜上的样品应登记在数据记录表上，以免混淆。

1.3.1.1.6.1叶、芽样品

将样品采集在塑料袋中（叶片从植株顶部采集，幼芽可在块茎表面任意部位取样）。

塑料袋中加入适量提取液（1.0ml/0.5g组织）研样，然后移入Eppendorf管中。

加入等量苯酚/氯仿（各1/2体积）混匀，12000rpm离心5分钟。

吸取4ul上清液点于尼龙杂交膜上，并将点样膜置于80℃烘烤1小时或用紫外交联仪处理5分钟。

1.3.1.1.6.2种子样品

取足量种子（约50粒）放入试管中，蒸馏水浸泡过夜。

倒掉蒸馏水，在研钵中0.5ml提取缓冲液研磨样品。

将研液移入Eppendorf管中，加入等量苯酚/氯仿（各1/2体积）混匀，12000rpm离心5分钟。

吸取4ul上清液点于尼龙膜上，并将点样膜置于80℃烘烤1小时或用紫外交联仪处理5分钟。

1.3.1.1.7预杂交和杂交

将点样膜装入杂交塑料袋中（封口后切去一角）。

预热所需体积的杂交缓冲液（0.15ml/cm杂交膜）至60℃，注入盛有点样膜的塑料袋中，恒温预杂交1小时。

将所需数量的探针移入洁净的Eppendorf管（2ul/ml杂交缓冲液）。

如不足20ul，用蒸馏水调至该体积，沸煮使之变性，5分钟后置于冰上骤冷。

变性探针短暂离心后，注入预杂交缓冲液中（注意不要加在点样膜上），密封塑料袋，轻轻混匀。

60℃轻缓振荡杂交，过夜。

1.3.1.1.8漂洗、封膜和抗体孵育

使用试剂盒提供的塑料盒完成漂洗和封膜步骤。

1.3.1.1.8.1漂洗

严格制备洗液Ⅰ（1×SSC，0.1%（w/v）SDS）并预热至60℃，放入点样膜（2-5ml洗液/cm2杂交膜），室温轻缓振荡漂洗15分钟。

1.3.1.1.8.2封膜

仔细漂洗后，室温下将点样膜在封膜缓冲液（1ml/cm2杂交膜）中孵育1小时。

封膜液按1：

10用稀释液（100mmol/LTris-HCl，300mmol/LNaCl，pH9.5）稀释。

1.3.1.1.8.3抗体孵育

用现配的0.5%BSA稀释缓冲液稀释抗荧光素碱性磷酸酶酶标抗体至5000倍，将点样膜在稀释后的抗体溶液（0.3ml/cm2杂交膜）中轻振孵育1小时。

该步骤在试剂盒提供的塑料盒中完成。

1.3.1.1.8.4最后漂洗

室温下，用0.3%（w/v）轻振洗脱没有结合的抗体，重复3次，每次间隔10分钟。

1.3.1.1.9信号产生和检测

去掉膜上多余的洗液（可将膜的一角抵在塑料盒的壁上或其它方便的干净表面），然后点样面朝上平放在SaranWrap滤纸上。

向膜上滴加底物CDP-Star（30-40ul/cm2杂交膜）静置5分钟。

揭起杂交膜，使一角接触SaranWrap滤纸，除去多余底物（CDP-Star），然后夹在显影夹中，再用移液管滚压，挤出多余底物和气泡，热塑封口器密封。

开袋取出点样膜，平放在剖开塑料袋的半边，将另一半盖在膜上，曝光前要确保曝光塑料袋外侧干洁无水。

然后把装有点样膜的塑料袋（点样面朝上）放入胶片盒内，置于暗室。

关灯，取一张KodakX-OMATXAR-2胶片放在点样膜上，关上胶片盒曝光1小时。

取出胶片，按下述方