耐碳青霉烯类抗菌药物的阴沟肠杆菌耐药机制及耐药传播机制研究.docx

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耐碳青霉烯类抗菌药物的阴沟肠杆菌耐药机制及耐药传播机制研究

耐碳青霉烯类抗菌药物的阴沟肠杆菌耐药机制及耐药传播机制研究

菌

⑧

论文作者签名：

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芒!

皇

指导教师签名：

论文评阅人1：

程东庆副教授硕士生导师浙时医缒

评阅人2：

‘l蓦篝蔓翼誓董董≯爹评阅人3：

评阅人4：

评阅人5：

答辩委员会主席：

张立煌教授博士生导师逝坚盔堂皇堕堂堕

委员1：

潘建平教授博士生导师浙江大学城吏堂堕

委员2：

夏大静教授博士生导师浙江大学生命科学望!

篁堡

委员3：

王晓健教授博士生导师浙江大学医学院

委员4：

陈建忠副教授浙江大学医学院

委员5：

答辩日期：

2012年2月23日

■．≮

浙江大学研究生学位论文独创性声明

’-

簟

本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研

究成果。

除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表

或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘堂或其他教育机构的学位或证书

而使用过的材料。

与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作

了明确的说明并表示谢意。

学位论文作者签名：

伊／尹谢签字日期：

2‖矿年2，月‖日

学位论文版权使用授权书

本学位论文作者完全了解逝鎏盘堂有权保留并向国家有关部门或机构

送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。

本人授权逝鎏盘鲎可以

将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、

缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。

保密的学位论文在解密后适用本授权书

学位论文作者签名：

导师签名：

签字日期：

一2-，，V年汐月多歹日签字日期：

力口，1，年2，月矽日

一峰

‖

t

浙江大学硕士学位论文致谢

致谢

◆

▲

衷心感谢我的导师王青青教授给了我学习深造的机会和学术上精心的指导，

’

他们深邃的学术造诣、严谨的治学态度、国际化的视野都让我永志不忘，受益终

生。

衷心感谢陈学军老师在本研究的选题、实验、结果分析、论文撰写和修改等

过程的关心和指导以及生活上的亲切关怀与照顾。

衷心感谢细菌室其他老师对我

的帮助和大力支持。

衷心感谢周明明等其他同事，感谢他们无私的帮助和支持，

这将是我人生中非常难忘的一段岁月。

衷心感谢蔡佳昌博士在等电聚焦电泳实验上的指导和帮助。

衷心感谢我的挚友们，在我仿徨、焦虑和失落的时候给我的真诚的建议、开

导和安慰。

特别感谢我的父母，含辛茹苦把我抚养成人并供我求学到今。

也感谢

我的其他家人对我的默默支持，关心和鼓励。

叶青

2011年12月于浙大紫金港

本研究受浙江省医药卫生科技计划项目资助2011KYB045

浙江大学硕士学位论文中文摘要

耐碳青霉烯类抗菌药物的阴沟肠杆菌

●

耐药机制及耐药传播机制的研究●

■

浙江大学医学部免疫学

硕士研究生叶青

导师王青青教授

中文摘要

目的：

调查儿科临床分离的阴沟肠杆菌对临床常见抗生素的耐药现状，探究耐碳青

霉烯类阴沟肠杆菌的临床分布特征，耐药机制及耐药传播机制，为临床合理用药

和院感防控提供一定的实验依据。

方法：

回顾分析我院2009。

2011年问临床感染菌种类，科室分布，标本来源和耐药现

状，特别是对阴沟肠杆菌的临床现状进行详细的了解。

并对2009．09~2010．12期间

我院患儿感染性标本分离的阴沟肠杆菌采用ⅥTEK全自动微生物分析仪结合鉴定

卡鉴定，用药敏卡或结合K．B法做药敏试验。

对分离的耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌，

采用cLsI推荐的肉汤稀释法检测最低抑茵浓度，采用改良Hodge试验检测菌株碳

青霉烯酶，采用EDTA协同法检测菌株金属酶，等电聚焦电泳用于检测p．内酰胺

酶，用PcR扩增耐药基因，并进行测序分型。

质粒接合试验和质粒消除试验用于

评估质粒的移动性。

耐药基因的位置用质粒电泳进行大致的区分。

结果：

¨

浙江大学硕士学位论文中文摘要

菌分离自患儿的痰、尿液、脓液、分泌物、血液、咽拭子等临床标本，其中痰液

134／1419等。

阴沟肠杆菌主要分离自痰液82％，82／100。

所有菌株的检出率在监护病区最高，有369株26．00％，其次是呼吸科285

沟肠杆菌主要分离自新生儿科，占22％22／100，其次是监护病区和呼吸科都为

20％20／100。

总体上，阴沟肠杆菌对亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、庆大

霉素、左氧氟沙星仍高度敏感90％，对头孢哌酮／舒巴坦、哌拉西林／他唑巴

坦、头孢吡肟也有较高的敏感性。

其中，一株耐碳青霉烯类抗菌药物的阴沟肠杆菌携带金属酶IMP．26，并且此

酶由1类整合子捕获。

此菌株还携带超广谱D．内酰胺酶TEM。

104，它存在于一个

8kb左右的可接合质粒上。

．

结论：

1阴沟肠杆菌对头孢类抗菌药物的耐药很严重，这与此类药物在儿科中的

广泛使用引起的产p．内酰胺酶株的筛选有关。

耐碳青霉烯类抗菌药物的阴沟肠杆

菌也在临床被检测到。

2金属酶IMP．26在新加坡的铜绿假单胞菌中首次被报道，国外其它地区罕

有报道。

在国内未曾有报道。

在阴沟肠杆菌中检测到IMP．26尚属首例。

最主要的IMP酶，因此需加强对其突变株的管理。

4第一次发现金属酶IMP．26存在于整合子中，有非常重要的临床意义。

关键词：

金属酶；碳青霉烯酶；阴沟肠杆菌

IlI

andTEM?

?

1

04in

mase

Extended―Spectrump-Lacta

Plasmid

ConjugatiVe

Schoolofof

medicine，ZhejiangU『niVersi劬Institute

Immunology

2009Ye

PostgraduateQing

SupervisorPro￡Ⅵ，jmg

Qingqing

Abstract

Objectives：

TotlleaIltibiotics―resistallcesta_tusofEc面口c口PaIldtothe

irⅣeStigatestlJdy

ch￡lracteristicofcliIlicalmecbanismaIld

distribution，resistance

mechamsmofEordert0contributetotllecon臼-olof

Carb印enem-lksistamtc肠口∞P，in

Ilosocomialarld

infectiontheofaIltibiotics．

reasomlble印plication

Methods：

Awast0reViews仃aillsofclinical

re仃ospectiVearmlysisperf．o咖edinfection，吐leir

sourceaIldresis切ncet0le锄tlleclinical

dist舶utioll，specimensituation，especially

si触tionofEtIleof2009―20

c肠口阳P，duringyears11．Ec如口阳Pwasidentifiedtlle

by

●

GNIcardsonVitekteSts

alIto-microbi0109yaIlalysissystem．Antibiotiessensitivitr

wereGNSc砌s．

pe墒rIIled

using

Ewas

czD伽ewere

Then此C衲印enem―Resistant

studied缸cherly．MICs

Ⅳ

浙江大学硕士学位论文英文摘要

detemined丽th

staJldardofceUextracts、ⅣaSusedfor

procedures．Isoelectricfocusing

detectionoffortlleand

’p―lact锄aSes．PCRassays谢mprirnersSpecific6肠，^似巧gene

■

meconservedofclassto

segmentsaIldcarriedout

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ofthewasassessed谢t11locationofthe

genecoIljugationexperiments．Toidenti匆the

aIldwereca圩ied

6肠陋^乒，∞gene，co巧ugationexperimentsplaSmidelectrophoresisout，

PCR．

by

amplified

Results：

1419strains

timeof2009．9-200．1bacterium、Ⅳere

Durh玛tlle2，1of伊am-negatiVe

n‘omtllewardofourare469st】?

aillSEcDZf

mem，tllere

sep删tedhospital．Among

forthe

acco吼tingfirSt33．05％，465

the00Efort11e

seconds仃ainsmefifm

place，lc肠口翻P7．04％accoumingplace．All

bacteria、Ⅳeref．romthe

伊anl-negatiVes印eratedpatient’ssp砷哪，urine，blood，pus，

secretionandthroatthese1008

swabs，of

露。

二贯

Spun删；134s仃ains9．44％，134／1419c锄1e舶mpus，etc．Ec肠绷Pmailllys印erated

f．rom

splmlII】82％，82／100．

IntensiVecaremlitllas戗1ercleVallcera：

tiowim369

hi曲ests吮inS26．oo％；me

secondismeof285of

d印a咖1entrespiration谢thstrains20．08脚；DiVision

llas208haS160strains

su唱er，depanment

Neonatologystr。

ainS14．66％；general

■Ec如口c口PDivisionof

11．28％，etc．Andmailllys印erated舶mNeonatology

foruIlitaIldof

22％22／lcared印arnnenttaken

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。

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20％20／100，respectiVely．111e

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leVonoxacina11dleVonoxaCinE咖口c伽remained

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EczD口c口P

cefepime

Cefoperazone／sulbaCtam，pipemcilliIl／sulbact锄arld

V

浙江大学硕士学位论文英文摘要

SenSltlVe．

AEc，0口c口Pwasf．ound

c打bapenem-resistamtoIMP一26

carrymetallo．p．1ac锄2Lse

f

incl硒slandTEM-104ino

integronextended-spec饥吼p?

?

laCt锄aSeco巧ugatiVe

●

plaSmid．

Conclusions：

of

1Thet，peI加P-26iIl

Metallo―p-lact锄ase、vaS

firStly哪o他dSing印ore，

c删edas仃ainofisrareinandhaSnotbeen

byJp峪P“如，挖D刀伽口P，z倡f聆Ds口．Itforeign

i11ouris虹lefirstthetodetect

reponedco硼．t巧．hEczD口∞PIMP．26

c鲫叮ing

Me协llo―p-lactaIllaSe．

me

ismutants疵nofIMP一4．IMP-4

2IMP一26is

Metallo-陆c伽naseve巧

iIlshouldto

domestic，therefore、Vet11eofⅡle

popularstrengthenmanagemem

mutations．

ismefirsttimet0findIMP-26haS

3Itc印turedbyintegron，砌chmayve巧

cliIlical

importantsigIliflcallce．

c肠口c口P

Keywords：

metallo―p-lactamases；c抽apenemaSes；E

Vl

浙江大学硕士学位论文缩略词表

缩略词表

'

■

缩写英文全称中文全称

InStitute

CLSICliIlicaland临床实验室标准化研究所

Laborato巧Stalldard

MICMillimal最低抑菌浓度

Inllibito巧Concen臼_ation

SSusceptible敏感

IIntenIlediate中介

RRIesistant耐药

ChainReaction聚合酶链反应

PCRPolmerase

nucleoside三磷酸脱氧核苷

dNTPDeoxytriphosphate

IMPImipenem亚胺培南粤

MEMMeropenem美罗培南

EsBLsExtended超广谱p-内酰胺酶

SpectrI蛐p．Lact锄ases

MBLsMatato。

D．Lact锄ases金属p-内酰胺酶

PBSsaline磷酸盐缓冲液

Phosphate．buffered

medi眦菌种保存液

LBLuria-BalaIli

NDM．1New1新德里金属-p一内酰胺酶l

Metallo．p．LaCtamase

TSAAgar胰蛋白胨大豆琼脂

T哪tic嬲esoy

chainreaction聚合酶链反应

PCRPol砌erase

Isoelectric．等电点

pIpoint

AmpCcephalosporinasesAmpC酶

EsBLsbe切，lact锄ases超广谱p-内酰胺酶

Extended．spectnlm

BaSe碱基对

bppair

Mmo儿摩尔每升

minute

RIevolutions每分钟转数

rpmper

VII

目次

致谢………………………………………………………．．I

中文摘要……………………………………………………．II

英文摘要……………………………………………………Ⅳ

缩略词表…………………………………………………．．vII

目次

1引言……………………………………………………．．1

2材料与方法………………………………………………．．3

2．1主要仪器………………………………………………．．3

2．2主要试剂………………………………………………．．4

2．3方法……………………………………………………6

3结果……………………………………………………．16

3．1阴沟肠杆菌等革兰阴性杆菌的临床分布和耐药性调查……………．．16

3．2耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌耐药性和分子机制……………………．19

4讨论……………………………………………………．29

5结论和展望………………………………………………．37

参考文献……………………………………………………38

综述l……』………………………………………………．47

综述2……………………………………………………．．56

附录…………………………………………．……………92

作者简历及在学期间所取得的科研成果…………．…………………93

浙江大学硕士学位论文引言

■耐碳青霉烯类抗菌药物的阴沟肠杆菌

o

耐药机制及耐药传播机制的研究

●

浙江大学医学部免疫学

硕士研究生叶青

导师王青青教授

1引言

金属p．内酰胺酶的产生是引起革兰阴性菌的多重耐药的重要因素，并且这种

因素所起的的作用变得越来越重要。

这源于它们作用底物的广泛，强效的碳青霉

烯酶活性以及对几乎所用酶抑制剂的耐受，以上种种特性使得它们能水解几乎所

有现在已知的p一内酰胺酶。

自从上世纪90年代起，已经有一些DNA移动元件编

码的金属D．内酰胺酶在一些重要的革兰阴性菌中出现。

例如肠杆菌科，铜绿假单

胞菌，鲍曼不动杆菌。

它们中的一些酶，例如VIM．1和NDM．1引起的碳青霉烯

类抗菌药物耐药的肺炎克雷伯杆菌和肠杆菌在全球的播散，引起如今的人类危机。

尽管我们已经了解了这些金属酶的分子生物学和基因实质，但是，我依旧缺乏完

整的流行病学资料和足够的临床经验。

致使我们在如何处理这些产金属p．内酰胺

酶的细菌引起的感染方面存在许多困惑和争议。

金属p．内酰胺酶的广泛传播，对

临床抗感染治疗以及感染防控提出了巨大的挑战。

阴沟肠杆菌Eemerobacter

cloacae广泛存在于水、土壤等外界环境和肠道中，

是一种条件致病茵。

随着头抱菌素的广泛使用，阴沟肠杆菌已成为引起医院感染

的重要病原菌，其引起的细菌感染性疾病，常累及多个器官系统，包括皮肤软组

织感染、泌尿道感染、呼吸道感染以及败血症等。

由于阴沟肠杆菌能产生超广谱p．

1

浙江大学硕士学位论文引言

严重，仅对碳青霉烯类抗生素仍维持较高的敏感性【1捌。

碳青霉烯类抗菌药物在临

●

口

床上被广泛的用于治疗高产AmpC酶或超广谱p．内酰胺酶的肠杆菌科细菌引起的

严重感染【31。

然而，在过去的几年中，产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌不断被发现，●

这引起了临床工作者的强烈担忧【4'5】。

碳青霉烯类抗生素对极大多数由质粒或染色体介导的D．内酰胺酶都有较高的

稳定性，与青霉素结合蛋白PBPs亲和力强，导致细菌细胞的延长和溶解，能

有效渗透细菌外膜进入周质间隙，并且存在抗生素后效应，是目前对革兰氏阴性

菌抗菌谱最广，抗菌活性最强，具有快速杀菌作用的一类抗生素。

目前肠杆菌科

细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的机制主要有三种：

一、碳青霉烯酶的产生；二、

平p．内酰胺酶的持续产生，主要见于阴沟肠杆菌、产气肠杆菌‘6，刀；三、药物作用

靶位的改变，主要是青霉素结合蛋白PBPs的改变【81。

其中最重要是碳青霉烯酶的

和vIM．是肠杆菌科细菌中报道的最常见的两类碳青霉烯酶【9．111。

在肠杆菌科细

菌中己报道的碳青霉烯酶大多由染色体介导，如阴沟肠杆菌中的NMC．A，IMI．1和

粘质沙雷菌sⅧ．1～3【12。

15】，只有少数位于质粒上，如阴沟肠杆菌中的IMI．2【161，

肺炎克雷伯菌中KPC．1，KPC．2，KPC．3【17。

201。

本文调查了我院儿科临床分离的阴沟肠杆菌对临床常见抗生素的耐药现状，

并研究了耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌的临床分布特征和耐药机制。

发现了一株携带

究。

2

浙江大学硕士学位论文材料与方法

2材料与方法

-

Q2．1主要仪器

●VITEK．60全自动微生物分析仪法国生物梅里埃公司

恒温摇床华达利HZ．8811K江苏大仓市科技器材厂

多点接种器3GNl20L型S加a公司

电热恒温培养箱DK．S24型上海精宏实验设备有限公司

DK．8B电热恒温水浴箱上海精宏实验设备有限公司

江苏省太仓市科教器材厂

华利达空气恒温振荡器Hz．8811K

一70℃低温冰箱美国mmo公司

茸

一20℃低温冰箱美国西门子公司

2．8℃冷藏柜青岛海尔电器有限公司

冷冻离心机美国111enn0公司

离心机德国Eppendorf

低温超速离心机德国BeckmaIl

超纯水系统德国Sanorius公司璺、

Kodak凝胶图像分析系统美国Life

Technologies公司

超净工作台北京东联哈尔滨仪器制造有限公司

生物安全柜美国The胁。

公司

C02培养箱美国Thenno公司

激光共聚焦显微镜德国蔡司ZEISS公司

倒置显微镜麦克奥迪Motic公司

紫外分光光度仪德国Nano

Drop公司

紫外透射反射分析仪ZF型上海康华生化仪器制造厂

电子分析天平瑞士梅特勒公司

涡旋振荡器上海医大仪器厂

细菌比浊仪法国Ⅵtek公司

浙江大学硕士学位论文材料与方法

PH计瑞士梅特勒公司

可调式封闭电炉上海浦东荣丰科学仪器有限公司

●

内循环式高压蒸汽灭菌锅日本Hiray锄a公司‖

微量移液器法国Gilson公司

t

恒流恒压电泳仪美国Bio．Rad公司

脉冲场电泳仪CHEFD刚II美国Bio．Rad公司

DYCD．3lB型电泳槽北京六一厂

YxQ-Ls．50sII立式压力蒸汽灭菌器上海博迅实业有限公司医疗仪器厂

XW二80A旋涡混合器上海医科大学仪器厂

TF．zBJ．100型制冰机上海田枫仪器有限公司

PCR扩增仪德国Eppendorf公司

Eppendorf微量移液器德国Eppendorf公司

排枪德国Eppendorf公司

2．2主要试剂

2．2．1药敏纸片

美罗培南、亚胺培南、氨苄西林、头孢噻肟、头孢他啶、头孢唑啉、头孢西

丁、氨曲南、环丙沙星、左氧氟沙星、复方磺胺异嗯唑、