乳酸菌菌种的分离筛选方法.docx

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乳酸菌菌种的分离筛选方法

乳酸菌菌种的分离筛选方法

乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。

为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。

营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。

在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。

通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。

乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。

当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类

时，SL培养基常用作为选择性培养基。

对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。

M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。

嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。

其特性为：

杆菌，两端圆，不运动，无

鞭毛。

粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。

乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。

革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。

在MRS培养基上菌落小，呈白色。

沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。

乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。

分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。

培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。

乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。

分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。

也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。

一.筛选方法：

1.溶钙圈法：

利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。

其中培养基中加入CaCO3的作用是：

①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。

筛选过程：

样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养

48h→挑选产生溶钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。

2.溴甲酚绿指示剂法：

培养基：

MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液）

筛选过程：

同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。

二.菌种的分离筛选

1.培养基：

★1.1麦芽汁碳酸钙培养基：

麦芽汁（10BX）1L预先灭菌碳酸钙5-10g/LPH自然（分离用）

★★1.2牛肉膏10g/L蛋白胨10g/L酵母膏10g/L番茄汁200g/L葡萄糖10g/L吐温0.05%CaCO315-20g/L溴甲酚绿0.01%PH6.0-6.5（分离用）

★1.3番茄汁碳酸钙培养基：

酵母膏7.5g/L葡萄糖10g/L番茄汁100mL蛋白胨7.5g/LKH2PO42.0g/L吐温0.5mLPH6.0-6.5（分离用）

1.4葡萄糖20g/L酵母膏10g/LPH6.0-6.5

1.5蛋白胨8-10g/L酵母膏3-5g/L葡萄糖13-15g/LKH2PO41.5-2.0g/L

MgSO40.3-0.5g/LMnSO40.2-0.25g/LNaAC3.0-5.0g/LPH5.5-6.5

1.6蛋白胨0.8-1.0g/L糖蜜3.0-5.0g/L酵母膏3-5g/L玉米浆0.5-1.0g/L

KH2PO40.1-0.3g/LMgSO40.3-0.5g/LNaC13-5g/L葡萄糖8-10g/L

PH5.5-6.5（发酵或种子培养基）

★★1.7MRS培养基（分离培养计数用）

蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、

葡萄糖20.0g、吐温801.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂18.0g、蒸馏水1L,pH6.5。

（分离培养基），当MRS培养基冷却至45～50℃时,加入已灭菌的碳酸钙,充分混匀,倒平板。

1.8BCP培养基（溴甲酚紫培养基）

乳糖5.0g蛋白胨5.0g酵母膏3.0g0.5℅溴甲酚紫10ml自来水1000mlpH6.5-7.0（分离用）

1.9BCG牛乳营养琼脂：

脱脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6℅溴甲酚绿酒

精溶液0.07ml，0.075Mpa20min。

另取琼脂2.0g，溶于50ml水中，加酵母膏

1.0g溶解后调pH6.5-6.8，0.1Mpa20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀，

倒平板，37℃培养24h，检查是否有杂菌。

2.分离筛选：

2.1富集培养：

取1.0g（1.0ml）于无菌细口瓶中，加入无菌麦芽汁液体培养液于瓶口处，密闭，25-32℃培养48h。

若培养基表内出现绢丝波纹物，镜检杆状，革兰氏阳性，初步定为乳酸菌。

以同样方法转接2-3次，接种量3-5℅.

2.2菌种分离纯化：

溶钙圈法：

富集菌液或样品适当稀释至10-7，混菌法分离，先加入10-12mlMRS培养基 或麦芽汁培养基，凝固后再注入4-5ml水琼脂培养基，制成厌氧环境，30℃或37℃培养2-3天（温度低时间稍长），可出现针头状或圆形稍扁菌落，周围形成透明圈。

挑取透明圈大，培养基变黄的菌落，反复划线纯化2-3次，所得单菌落编号，经镜检后，疑似乳酸菌落接种于MRS培养基培养后保存备用。

或接入液体培养基中，25-32℃培养24-48h，然后穿刺于MRS培养基或麦芽汁碳酸钙半固体培养基中，25-32℃培养48h保存备用。

2.3性能测定：

乳酸菌定性试验：

不同条件下的产酸速率试验：

将分离菌种接种于MRS液体培养基中25℃37℃温度下培养测不同菌株不同温度的pH。

方法1.吸取发酵液10ml，注入空试管中，加入10℅硫酸1.0ml，在加入2.0

℅高锰酸钾约1.0ml，此时乳酸转化成乙醛。

取滤纸一条，在含氨的硝酸银

溶液中浸湿，横搭在试管口上，将试管徐徐加热至沸腾，使乙醛挥发，若管口滤纸变黑，证明有乳酸生成。

方法2.纸层析法：

展开剂为正丁醇：

甲醇：

水=80：

15：

5，毛细血管吸取发酵液，多次点样于新华滤纸上，1.5℅标准乳酸为对照，平衡2小时后进行层析，3℅溴甲酚蓝显色计算Rf值。

产酸量测定：

5.0ml发酵液于150ml三角瓶中，加中性蒸馏水10-20ml，酚酞指示剂2滴，用0.1mol/l氢氧化钠滴定至微红色。

醋酸量（g/100mL）=氢氧化钠摩尔浓度.Vx90.08x10-3/样品毫升数x100

同时，进行单因素试验，分别考察醋酸速度，耐高温，耐酒精度，耐低酸度等主要生产性能，选择优势菌株。

3.菌株鉴定：

3.1菌落形态：

3.2菌体形态：

（革兰氏染色观察）染色镜检：

杆状阳性。

3.3乳酸菌运动性检测：

半固体穿刺法

3.4生理生化：

3.3.1生化试验：

产过氧化氢，产硫化氢，葡萄糖产生，硝酸盐还原，产生吲哚，甲基红，明胶液化，需氧，精氨酸，糖发酵试验。

3.3.2生理试验：

乳酸菌产酸能力曲线：

将筛选的乳酸菌接种于MRS液体培养基中，25-32℃培养48h，间隔4-6h测定发酵液pH。

食盐对乳酸菌的影响：

在MRS液体培养基中，添加0.0℅2.0℅4.0℅6.0℅氯化钠，菌种分别接种于培养基中，32℃培养48h，测定OD值。

溴甲酚绿指示剂法：

原理：

溴甲酚绿指示剂在酸性环境中呈黄色，碱性环境呈蓝色，分离培养基配制后PH为6.8，加入溴甲酚绿指示剂呈蓝绿色，产酸后菌落周围变成黄色，较容易鉴别。

培养基：

BCG牛乳营养琼脂

初筛：

将样品富集液梯度稀释，适温培养，平板上出现扁平的黄色菌落及周围培养基也为黄色初定为乳酸菌。

复筛：

将典型菌落转接脱脂乳发酵管，若凝固，无气泡，呈酸性，镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色阳性，连续传代若干次培养，挑选出3-4h能凝固的乳管保存备用。

注：

1.乳酸菌筛选常在几种培养基同时进行：

分别在麦芽汁碳酸钙培养基，番茄汁碳酸钙培养基，BCP培养基（溴甲酚紫培养基）同时进行混菌划线或涂布培养（放厌氧袋），分别25℃37℃培养48h。

菌落观察：

平板表面形成浅色（黄色或白色）小菌落。

麦芽汁碳酸钙培养基表面，菌落周围形成透明圈，BCP培养基（溴甲酚紫培养基）周围使紫色的培养基形成黄色包围圈。

触酶反应：

厌氧菌一般无触酶（过氧化氢酶），用滴管滴加3.0℅过氧化氢于菌落上，若无气泡产生，证明该菌为触酶阴性。

将各种特征菌落分别接入斜面，培养后保存，进一步生理生化试验，以鉴定分别何种乳酸菌。

2.菌落鉴定：

半固体或双平板琼脂利于乳酸菌的生长，菌落出现早。

2.1菌落形态观察：

乳白色边缘不整齐，稍呈半球状凸起，实心菌落。

个体形态：

半透明细杆状链状排列，大量时呈发丝状堆积。

初步认为乳杆菌。

2.2生化鉴定：

在吲哚试验中，加入菌种试管无任何变化，为阴性反应。

说明该菌不具有分解色氨酸产生吲哚的能力。

明胶液化淀粉水解氢氧化钾试验均为阴性，说明此菌为乳酸菌。

（过氧化氢酶还原硝酸盐）

糖发酵试验：

发酵果糖半乳糖葡萄糖乳糖产酸为阳性反应，其余麦芽糖蔗糖棉子糖鼠李糖产酸为阴性反应。

根据手册第九版判断此种乳酸菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种。

（纤维二糖甘露醇山梨醇七叶苷水杨苷）

2.3乳酸菌生长曲线　pH-t测定结果：

三.几种乳酸菌筛选举例

1.嗜热链球菌：

样品来源：

市售酸奶培养基：

M17改良培养基，培养温度：

42℃，需氧情况：

兼性厌氧，筛选方法：

常规的稀释涂布和划线分离

2.保加利亚乳杆菌：

样品来源：

市售酸奶，培养基：

牛肉浸膏1.5％，酵母浸膏0.5％，葡萄糖3.0％，柠檬酸三铵0.2％，七水硫酸镁0.02％，琼脂1.5％，pH5.1。

培养温度：

42℃，需氧情况：

兼性厌氧，筛选方法：

常规的稀释涂布和划线分离法。

3.双歧杆菌：

样品来源：

婴儿新鲜粪便，培养基：

MRS培养基、NPNL培养基、TYP培养基、PTYG培养基，培养温度：

37℃，需氧情况：

严格厌氧，筛选方法：

常规的稀释涂布和划线分离法。

（注：

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）