重组人GCSF.docx
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重组人GCSF
一、写出你拟研发的基因工程药物的cDNA序列和蛋白质序列(可自由选择有应用价值的靶标基因)。
研发的基因工程药物名称:
重组人GCSF(CSF3)
cDNA序列:
1atggctggacctgccacccagagccccatgaagctgatggccctgcagctgctgctgtgg61cacagtgcactctggacagtgcaggaagccacccccctgggccctgccagctccctgccc121cagagcttcctgctcaagtgcttagagcaagtgaggaagatccagggcgatggcgcagcg181ctccaggagaagctgtgtgccacctacaagctgtgccaccccgaggagctggtgctgctc241ggacactctctgggcatcccctgggctcccctgagcagctgccccagccaggccctgcag301ctggcaggctgcttgagccaactccatagcggccttttcctctaccaggggctcctgcag361gccctggaagggatctcccccgagttgggtcccaccttggacacactgcagctggacgtc421gccgactttgccaccaccatctggcagcagatggaagaactgggaatggcccctgccctg481cagcccacccagggtgccatgccggccttcgcctctgctttccagcgccgggcaggaggg541gtcctagttgcctcccatctgcagagcttcctggaggtgtcgtaccgcgttctacgccac601cttgcccagccc
蛋白质序列:
1magpatqspmklmalqlllwhsalwtvqeatplgpasslpqsfllkcleqvrkiqgdgaa61lqeklcatyklchpeelvllghslgipwaplsscpsqalqlagclsqlhsglflyqgllq121alegispelgptldtlqldvadfattiwqqmeelgmapalqptqgampafasafqrragg181vlvashlqsflevsyrvlrhlaqp
二、分析该cDNA序列的限制性内切酶位点。
Name:
GCSF
Conformation:
linear
Overhang:
five_prime,three_prime,blunt
MinimumSiteLength:
5bases
MaximumNumberofCuts:
1
Included:
allcommercial,prototypesonly
Noncutters:
AarI,AbsI,AccI,AclI,AflII,AflIII,AgeI,AgsI,AjuI,AlfI,AloI,ApoI,ArsI,AscI,AsuII,AvrII,BaeI,BalI,BamHI,BarI,BbvCI,BcgI,BciVI,BclI,BdaI,BglII,BplI,BsaAI,BsaBI,BsePI,BsmI,BsmAI,Bsp1407I,BspHI,BsrBI,BsrDI,BstEII,BtrI,CfrI,ClaI,CspCI,DraIII,DrdI,Eam1105I,EciI,Eco31I,Eco57I,EcoRI,EcoRV,Esp3I,FalI,FauI,FseI,FspAI,HaeIV,HgaI,Hin4I,HindII,HindIII,HpaI,HphI,KpnI,MauBI,MfeI,MluI,MmeI,MslI,NarI,NcoI,NdeI,NheI,NmeAIII,NotI,NruI,NspI,OliI,PacI,PleI,PmaCI,PmeI,PpiI,PshAI,PsiI,PI-PspI,PspXI,PsrI,PvuI,RsrII,SacI,SacII,SalI,SapI,ScaI,PI-SceI,SexAI,SfiI,SgfI,SgrAI,SgrDI,SmaI,SnaBI,SpeI,SphI,SrfI,SspI,StuI,SwaI,TaqII,TatI,TfiI,TsoI,Tsp45I,TspGWI,Tth111I,VspI,XbaI,XhoI,XmnI
Name
Sequence
SiteLength
Overhang
Frequency
CutPositions
Eco47III
AGCGCT
6
blunt
1
179
NaeI
GCCGGC
6
blunt
1
503
AcyI
GRCGYC
6
five_prime
1
416
ApaLI
GTGCAC
6
five_prime
1
65
Bpu10I
CCTNAGC
6
five_prime
1
271
BspMI
ACCTGC
6
five_prime
1
18
BtgZI
GCGATG
6
five_prime
1
182
Cfr10I
RCCGGY
6
five_prime
1
501
EcoNI
CCTNNNNNAGG
6
five_prime
1
343
FokI
GGATG
5
five_prime
1
241
SanDI
GGGWCCC
7
five_prime
1
388
SfaNI
GCATC
5
five_prime
1
263
StyI
CCWWGG
6
five_prime
1
395
AatII
GACGTC
6
three_prime
1
419
ApaI
GGGCCC
6
three_prime
1
103
BfiI
ACTGGG
6
three_prime
1
469
BglI
GCCNNNNNGGC
6
three_prime
1
502
BseMII
CTCAG
5
three_prime
1
262
BseRI
GAGGAG
6
three_prime
1
238
BsgI
GTGCAG
6
three_prime
1
100
BsrI
ACTGG
5
three_prime
1
464
BtsI
GCAGTG
6
three_prime
1
403
Hpy99I
CGWCG
5
three_prime
1
421
PflMI
CCANNNNNTGG
6
three_prime
1
440
Sse8387I
CCTGCAGG
8
three_prime
1
359
TauI
GCSGC
5
three_prime
1
332
TspDTI
ATGAA
5
three_prime
1
43
XcmI
CCANNNNNNNNNTGG
6
three_prime
1
33
三、分析蛋白质的分子量、等电点、糖基化、二硫鍵。
分子量为21977.62
等电点为5.81
糖基化
>Sequence204aminoacids##netglycate-1.0predictionresults##Sequence#ScoreAnswer#-----------------------------------------------------------#Sequence110.850glycateYES#Sequence46-0.532glycate.#Sequence53-0.891glycate.#Sequence64-0.820glycate.#Sequence70-0.875glycate.#MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWTVQEATPLGPASSLPQSFLLKCLEQ#50VRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQ#100LAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQ#150MEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRH#200LAQP#250%1..........G.......................................#50%1..................................................#100%1..................................................#150%1..................................................#200%1....
二硫鍵
有二硫键(蛋白质中含有C半胱氨酸)
4、写出用pET-30a质粒在大肠杆菌中表达的正向和逆向引物序列(含保护碱基、限制性内切酶位点、和基因的特有序列)。
pET-30a质粒图谱
引物包括3个部分组成:
保护碱基、酶切位点和目的基因的部分序列。
酶切位点的设定要保证,这个位点不存在于目的基因中(对照第二题的限制性内切酶位点),不存在于载体质粒的其它位置(以免破坏了载体本身的性质),只能存在于载体的多克隆位点里(对照上两张图片中的酶切位点)。
保护碱基的选择需对照常用限制性内切酶保护碱基表来选择。
同时,还要注意保护碱基和酶切位点后的碱基个数,必要时可添加碱基,不要产生移码突变。
上游引物:
5′—CGGAATTCCGTATGGCTGGACCT—3′
下游引物:
5′—CAGAAGCTTGTGGGGCTGGGAA—3′
五、写出基因工程药物研发的基本步骤(从提取RNA到表达出蛋白质所进行的实验,按研究工作的先后顺序写)。
基因工程药物研发的过程:
提取RNA→cDAN合成→PCR扩增目的基因片段→提取质粒→构建重组质粒→转化→鉴别重组子→外源基因诱导表达→收集产物蛋白并纯化
提取RNA:
分离纯化完整的RNA是进行分子克隆、基因表达分析的基础。
要成功地提取真核生物RNA,最主要的是RNA的数量和质量,关键在于尽可能完全抑制或去除RNA酶的活性,分离获得全长的RNA。
Trizol法(试剂盒)
从组织中提取总RNA
1.液氮研磨:
组织块直接放入研钵中,加入少量液氮,迅速研磨,待组织变软,再加入少量液氮,再研磨,如此3次。
2.匀浆:
组织样品按50~100mg加入1mlTrizol,转移入离心管。
另外,组织体积不能超过Trizol的10%,用电动匀浆器充分匀浆1~2min。
3.12000r/min离心5min,弃沉淀。
4.按每毫升Trizol加入200μL氯仿,盖紧离心管,用手振荡混匀15s,室温放置10min。
5.4℃,12000r/min离心15min。
此时可以看到分为三层(RNA、DNA、蛋白质)。
6.吸取上层水相(含RNA),移至另一新离心管中。
7.按每毫升Trizol加入0.6ml异丙醇,混匀,室温放置5~10min。
8.4℃,12000r/min离心10min,弃去上清液,RNA沉于管底。
9.按每毫升Trizol加入1ml的75%乙醇,温和振荡,悬浮沉淀。
10.4℃,8000r/min离心5min,小心尽量弃去上清液。
11.室温晾干或真空干燥5~10min。
主页不要过分干燥。
12.用50μLDEPC处理水、TE缓冲液或0.5%SDS溶解RNA样品,5~60℃5~10min。
13.测260nm下吸光度值定量RNA浓度。
14.RNA可进行nRNA分离,或储存于70%乙醇中并保存于-70℃(如要进一步获得mRNA可以利用寡脱氧胸腺嘧啶核苷酸纤维素层析,把mRNA与其他的RNA分开,因为几乎所用的mRNA的3′端都具有一串可长至200bp的poly(A)序列,而其他的RNA上都没有这样的结构)。
cDNA合成:
cDNA是从mRNA反转录来源的DNA,其组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。
合成cDNA应先从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过反转录酶的作用产生一条鱼mRNA相互补的DNA链,然后除掉mRNA,以第一条DNA链为模板复制出第二条DNA链。
(1)SuperscriptⅡ-RT合成第一链
1.提取RNA
2.在一无RNase的0.2mlPCR管中加入:
mRNA(大约500ng)xμL
XhoⅠ引物(1.4μg/μL)1μL
无RNA酶水12-xμL
总体积为12μL
3.混匀后,70℃反应10min,消除二级结构。
4.反应完全后,立刻将反应体系置于冰上5min。
5.稍微离心一下,顺序加入以下试剂:
5×第一链缓冲液4μL
RNA酶抑制剂0.5μL
10mmol/LdNTP1μL
6.混匀,稍微离心反应物之后,42℃放置2min。
7.反应完成,趁热加入1μLM-MLV反转录酶,混匀。
8.42℃反应50min,然后70℃、15min灭活反转录酶。
(2)、cDNA第二链的合成
1.第一链反应完成后,取2μL第一链产物与-20℃冰箱中保存,待电泳检测。
其余的产物合并,混匀,然后顺序加入下列试剂:
10×DNA聚合酶Ⅰ缓冲液20μL
10mmol/LdNTP1μL
无RNA酶水xμL
RNaseH(2U/μL)1μL
DNA聚合酶Ⅰ(10U/μL)10μL
总体系为200μL
2.混匀后,16℃反应2.5h、
3.70℃灭活10min。
4.反应完成后,得到200μcDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上。
5.取2μL第二链产物,同保存的第一链产物一起电泳鉴定。
同时上1kbLadder,确定双链的范围大小。
(3)、双链cDNA末端补平
1.在第二链反应体系中顺序加入下列试剂:
10mmol/LdNTP6μL
T4DNA聚合酶(8.7U/μL)2μL
BSA(10mg/mL)2μL
2.稍微离心混匀反应物,37℃反应30min,然后75℃灭活10min。
3.加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈震荡后,常温下13000r/min离心5min。
4.离心后,吸取上清液于另一1.5mLEp管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000r/min离心5min。
5.吸取上清液于另一Ep管,加入1/10体积3mol/LNaAc(pH5.2)和2.5体积预冷的无水乙醇,混匀,-20℃防治过夜以沉淀双链cDNA。
6.沉淀物在4℃下13000r/min离心60min以充分沉淀双链cDNA。
7.弃上清液,加入1mL70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000r/min离心5min。
8.弃上清液,常温干燥。
(4)、EcoRⅠ衔接子加接
1.往双链cDNA沉淀中加入9μLEcoRⅠ衔接头(400ng/μL),4℃至少放置30min以充分溶解cDNA沉淀。
2.顺序加入下列试剂:
10×DNA聚合酶Ⅰ缓冲液1.2μL
10mmol/LdNTP6μL
T4DNA聚合酶(4U/μL)1μL
3.混匀,16℃过夜连接。
(5)、双链cDNA末端的磷酸化及XhoⅠ酶切
1.连接反应完成后,将反应体系70℃放置15min灭活T4DNA聚合酶。
2.稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5min。
然后加入下列试剂:
10×缓冲液1.2μL
10mmol/LdATP6μL
ddH
O6μL
T4PNK(10U/μL)1μL
3.37℃反应30min,然后70℃灭活15min。
4.稍微离心,室温放置5min,然后加入下列试剂:
10×缓冲液4μL
BSA(10mg/mL)6μL
ddH
O5μL
XhoⅠ(10U/μL)8μL
5.37℃反应1.5h,然后65℃灭活酶10min。
6.反应完成,置于4℃准备回收。
(6)、胶回收cDNA(QIAEXⅡGELExtractionKit回收试剂盒)
1.配制1%琼脂糖凝胶,2μLEB/300mL胶。
2.取4℃保存样品上样,40μL/孔,电泳50V,1h。
3.紫外灯下分别切下0.5~1kb、1.0~2.0kb及2.0~4.0kbcDNA片段,分别放入已做标记的1.5mL离心管。
4.称取胶重,加入3倍体积QXⅠ缓冲液。
5.50℃水浴数分钟,至胶完全融化。
用手指弹QIAEXⅡ使重悬,每管中加入5μLQIAEXⅡ。
6.50℃水浴10min,每隔2min取出颠倒混匀数次,使QIAEXⅡ保持悬浮。
7.4℃、13000r/min离心30s,弃上清液(吸取上清液)。
8.加入500μLQXⅠ缓冲液,轻弹管底使QIAEXⅡ重悬。
9.离心并去上清液。
10.加入500μL缓冲液,重悬QIAEXⅡ,离心30s,去上清液。
11.再加入500μL缓冲液,重悬QIAEXⅡ,离心30s,去上清液。
12.超净台上吹干(至无乙醇味),加入10μL洗脱液,重悬QIAEXⅡ,静置5min,13000r/min离心30s,吸上清液,冰上放置。
13.取1μL上清液上样电泳,同时以相对分子质量标准(1kbLadder)及DNA含量标准(10ng,20ng)作对照。
14.收回的cDNA置于-20℃内保存,据电泳结果,取适量DNA进行连接。
PCR(扩增外源基因片段)
利用半保留复制的原理,以待扩增的DNA为模板,在体外由引物介导的酶促合成特异DNA片段的过程,类似于细胞内DNA的天然复制过程。
(引物已经提前设计好)目的基因DNA在高温下(94℃)下解链成为单链模板;人工合成的一对引物在低温(40~60℃)下分别与变性的目的基因两次的两条链的部分序列互补结合;在中等温度(65~75℃)下由Taq酶将dNTP中的脱氧单核苷酸加到引物3′-OH末端,并以此为起点,沿着模板以5′→3′方向延伸,合成一条新的互补链。
1.取一个0.2mLEp管,在其中添加以下各种成分反应液。
反应液:
ddH
O65.5μL
模板DNA5μL(100~200ng)
上游引物(10μmol/L)5μL
下游引物(10μmol/L)5μL
10×扩增缓冲液10μL
MgCl
(25mmol/L)6μL
dNTP混合物3μL(各20nmol)
Taq酶(5U/μL)0.5μL(2.5U)
总体积100μL
2.混匀后,稍作离心(如果是利用非热盖的PCR仪器应添加30μL石蜡油于反应管中,防止样品水分的蒸发)。
3.将反应管放入PCR仪中,按下列条件设计好程序,进行PCR反应。
4.反应程序:
94℃条件下使模板DNA变性5min
变性94℃1min
退火55℃1min
延伸72℃2min
30个循环
最后再72℃条件下延伸7~10min
5.PCR反应结束后,取5μL反应液用琼脂糖凝胶进行电泳,鉴定PCR产物是否存在以及大小。
6.电泳确认后,将其余样品移至新的1.5mLEp管中。
7.加入200μLTE,加入300μL酚/氯仿/异戊醇,上下颠倒混匀,室温条件下12000r/min离心5min。
8.将上层水液转移到新的Ep管中,然后添加1/10体积的3mol/L的NaAc(pH5.2)和2.5倍体积的冷无水乙醇。
9.-20℃冰箱中放置30min以上。
10.4℃12000r/min离心15min。
11.弃去上清液,添加1mL的冷70%乙醇,上下颠倒混合。
12.4℃12000r/min离心5min。
13.弃上清液,将Ep管倒置于吸水纸上,室温干燥5~10min。
14.用TE溶液溶解沉淀,电泳确认回收到PCR产物后,置于-20℃冰箱中备用。
提取质粒pET-30a(BiomigaEZgene试剂盒)
将一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,转移进宿主细胞中进行繁殖或表达的工具称为载体。
细菌质粒是重组DNA技术中最常用的载体。
1.接种新鲜的单个大肠杆菌菌落到LB培养基中(含适量抗生素),37℃振荡培养14-16小时。
室温下10000r/min离心1min,收集大概3mL菌液中的菌体,并尽可能的吸去上清。
2.加入250μLBufferA1(确保已加入RNaseA),用移液枪充分悬浮细菌细胞。
3.加入250μLBufferB1,轻轻地反转10次以混合均匀,然后静置2min至溶液粘稠而澄清。
4.加入350μLBufferN1,立即反转多次,至溶液充分混匀,此时出现白色絮状沉淀。
5.将Ep管转至高速离心机,在室温下13000r/min离心10min.
6.小心吸取离心后的上清液至带有收集管的DNA管(先用1mLGEL溶液平衡柱子)中,室温下13000r/min离心1min,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回收集管中。
7.向DNA柱中加入500μLBufferKB,室温下13000r/min离心1min,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回收集管中。
8.向离心柱中加入500μLDNAWashBuffer(已加入无水乙醇),室温下,13000r/min离心1min,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回收集管中。
重复步骤8。
将DNA柱再放入离心机中,13000r/min离心1min。
9.将离心柱放在一个新的Ep管中,室温下,开盖晾10min。
10.将离心柱转至一个新的Ep管中,向DNA柱的正中间加入50μL的ddH
O(60℃)。
室温放置2min,13000r/min离心1min,洗脱质粒DNA,将洗脱液再加入到柱中,13000r/min离心1min,收集洗脱液。
构建重组质粒
酶切
1.在1.5mLEp管中分别加入下列成分。
PCR产物:
ddH
O2μL
PCR30μL(5μg)
10×缓冲液4μL
HindⅢ酶(10U/μL)2μL
BamHⅠ酶(5U/μL)2μL
总体系为40μL
质粒DNA:
ddH
O2μL
质粒pET-30aDNA30μL(5μg)
10×酶缓冲液4μL
HindⅢ酶(10U/μL)2μL
BamHⅠ酶(5U/μL)2μL
总体系为40μL
2.用手指轻弹管壁使溶液混匀,用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。
3.混匀反应体系后,将Ep管放于37℃条件下反应1h以上,过夜反应会更彻底。
4.取5μL反应液与上样缓冲液混合,然后进行凝胶电泳,预检。
5.用DNA凝胶回收试剂盒分离纯化DNA。
6.将酶切液保存于-20℃冰箱中或者直接用于连接。
连接
1.在1.5mLEp管中分别加入下列成分。
质粒DNA:
P
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