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REACH法规第四卷译稿39
B.39.体外哺乳动物肝脏细胞非常规DNA合成测定
1.方法
这个方法是世界经济合作与发展组织TG486的重复。
用哺乳动物样品的肝脏细胞进行的体外非常规DNA合成(UDS)测定(1997)。
1.1.引言
用哺乳动物样品的肝脏细胞进行的体外非常规DNA合成(UDS)测定的目的是为了证实测试物质能够诱导实验动物肝细胞内的DNA修复。
(见1.2.3.4)。
这个在体内进行的测定提供了研究肝脏中化学物质作用的方法。
最终要测量的是DNA的损害和随之而来的修补的表征。
肝脏通常是所吸收化合物新陈代谢的主要场所,因而它成为测量DNA损害的合适场所.
如果证明测定物质不能到达目标组织,用这个测定是不适合的.
非常规DNA合成(UDS)测定的终点通过限制细胞中并未经历预定的DNA合成法被标明的核苷的吸收来测量.用的最广泛的技术是用氚标记的胸腺嘧啶核苷(
的吸收。
鼠的肝脏最适合UDS测定。
用的是组织而不是肝脏,但这不是这方法的主题。
UDS响应的探测取决于在损害部分减少或取代的DNA母链的数目。
总之,UDS测定对测定物质引起的长斑点修补最有价值.。
相反短斑点修补,灵敏度就低得多。
此外,由于DNA损伤的不修补,错误修补或错误复制将导致引起突变的状况。
UDS测定影响的延伸没有给出修补过程是否正确的表现。
另外,DNA能引起突变的反应,但是,DNA损伤并不是通过一种切除、修补过程来修补的。
UDS测定所提供的关于能引起突变的行为方面的详细实验数据的缺少,可以由这个终点的潜在敏感性来抵消,因为这是在整个整组基因中进行的。
又见B部分的总引言。
1.2.定义
修补中的细胞:
网状核微粒(NNG)高于预先设定值,这个在实验室测试中被证明。
网状核微粒(NNG);在放射自显影的UDS测定中,细胞UDS活性数量上的测量,通过从核微粒的数目(NG)减去在细胞质区域的细胞质微粒的平均数目(CG)来计算:
NNG=NG-CG。
NNG数先是用个体细胞数再是同一特性的、平行特性的等等的细胞集中起来算。
非常规DNA合成(UDS):
在切除或转移一段包含有因物理化学因素而导致的损伤的DNA片段后的DNA修补合成。
1.3.测定方法原理
哺乳动物肝脏细胞的UDS测定表明这个测定通常基于在细胞循环S-phase中有低频率细胞(
标记的肝脏细胞DNA的合并。
(
的吸收通常由自动射线照相术法来限制。
基于这项技术不像S-phase细胞引起影响液体闪烁计数。
1.4.方法描述
1.4.1准备
1.4.1.1动物种类的选择
通常用大鼠,但其它种类适合的哺乳动物也可使用。
应利用实验室通常使用的种类的年轻健康的成年动物。
研究开始时,对每个性别动物体重的变化必须最少不超过通常体重的
%。
1.4.1.2居住和喂养条件
虽然温度的目标应在50%~60%,总的条件参考文献B部分的总引言。
1.4.1.3动物样品的准备
健康年轻的成年老鼠随机分配给各个对照组和测试组。
笼子应按所占地方最小引起的可能影响来安排。
动物要确认唯一并至少在研究开始前关在笼子里5天,保证它们适应实验室的条件。
1.4.1.4测定物质/准备
固体测定物质应溶解或悬浮在合适的溶剂或赋形剂中,如果可能,在给动物喂食前稀释。
液体测定物质直接喂或在喂前稀释。
可利用测定物质的新鲜储备,除非固定实验数据证明库存也适合。
1.4.2.测定条件
1.4.2.1.溶剂/媒介物
溶剂/媒介物在所有剂质量标准上不能毒性害作用,也不能与测定物质起任何化学反应。
如果除了所用的有名的溶剂/媒介物,它们所包含的东西应有表明它们适合性的实验数据支持。
建议是只要有可能,似水的溶剂/媒介物的使用应优先考虑。
1.4.2.2对照组
同时的阳性和阴性(溶剂/媒介物)对照必须包括在实验的每个独立的操作部分。
除了测定物质的处理,对照组的动物必须与处理组的动物用同样的方法处理。
阳性对照必须是在暴露标准管理时已知能产生UDS的物质,这样才能在背景上给出一个可察觉的增长。
需要变化活化作用的阳性对照必须在能引出合适的响应剂量伤使用。
剂量可以选择在影响很清楚但又不是马上向读者显出编码幻灯片的本身。
阳性对照物质的举例包括:
取样时间
物质
CASNo.
EINECSNo.
早期取样时间(2-4小时)
N-亚硝基二甲胺
62-75-9
200-249-8
末期取样时间(12-16小时)
N-2-Fluorenylacetamide(2-AAF)
53-96-3
200-188-6
其它合适的阳性对照物质也可使用,正面对照必须由不同于测定物质的方案来管理,这些普遍被接受。
1.5.实验步骤
1.5.1.动物样品的种类和性别
考虑到在测定影响中自然生物上的变化,必须使用适量的动物,至少是每组三只可分析的动物。
正如一个著名的历史实验数据库曾记载的,同样的阳性和阴性对照小组只需一或两只动物。
如果研究周期间能从相同种类并用同样路线的暴露进行的研究中得到实验数据,这种实验数据能证明性别之间在毒害性上并无本质差别的话,那么可用一种性别测定,最好是雄的,这样就足够了。
如果化学药品的人为影响可能有性别差异,举个例子,对一些药剂测定只能用适合的性别来测定。
。
1.5.2.处理目录
测定物质要以一个单独的处理来统一管理。
1.5.3.剂质量标准
通常,至少要有两个剂质量标准。
最高剂量必须是以这剂量能产生毒害的迹象,但如果用基于同样的剂量摄入法会导致死亡来定义。
总之,最低剂量应是最高剂量的50%到25%。
在低无毒害的剂量时具有特殊生物活性的物质(像荷尔蒙和分裂素)可能排除在剂量选择标准之外,并且要基于一次次的实验来评估。
如果因为没有适合的实验数据而进行发现范围的研究,则必须在相同的实验室,用相同的种类,血统,性别和在主研究中使用的处理摄生法。
最高剂量必须由能在肝脏中产生一些毒害性的表现来限定。
(如,固缩核)
1.5.4.限制实验
如果在至少2000mg每kg体重每天的剂质量标准的实验,在一种处理或同一天两个处理,并使用为这个研究所描述的进行并没产生可观察到的毒性效应,并且如果毒性程度并不象期待的那样基于结构上有相连的物质,那么就不需一个完全的研究了。
预料中的人为接触可能会表明在限制测定中更高剂量的需要性。
1.5.5.剂量分配
测定物质通常需要用一个胃试管或一种合适的插管通过强饲的方式来分配。
其它只要可证明是正确的接触路线可能都是可取的。
然而,不建议使用引流过腹膜的方式,因为它会使肝脏直接接触测定物质而不是通过血液循环。
通过一次强饲或注射分配的液体最大量取决与测定动物样品的大小,应每100g体重增加2ml。
比这更大量的使用必须经过证实。
除了那些正常情况下表现出因更高的集中性而加剧影响的引起过敏或腐蚀性的物质。
测定量的变动性必须通过调整集中性来保证在所有剂质量标准上的不变量。
1.5.6.肝脏细胞的准备
正常的是在喂食的12-16小时后从处理过的动物身上提取。
附加的更早的取样时间(通常在处理前2-4小时)是非常需要的,除非在12-16小时有一明显的正反应。
然而,两选一的取样时间基于毒理学的实验数据
哺乳动物样品的短期培养通过在原位置用胶原酶灌注肝脏来完成并且允许新鲜的分开的肝脏细胞把它们自己连接到一个合适的表面上。
阴性对照的动物样品的肝脏细胞应有至少50%的生存能力。
1.5.7UDS的决定
新鲜的独立的哺乳动物样品的细胞通常在一段合适的时间(一般3-8小时)内用含(
的介质培养。
在培养阶段的后期,介质应移开,之后再用含有
过量未标记的胸腺嘧啶核苷的介质培养以消除不能结合的放射性(“冷追击”)之后细胞要清洗,固定,烘干,对更长的培育时间,冷追击可能就不是必须的。
切片要浸入放射自显影技术所用的感光乳剂中,在暗处的接触(例如冷藏7-14天),显影,染色,并且包括用银颗粒接触,每个动物准备2到3个滑面。
1.5.8分析
切片准备应包括正常形态学的足够细胞以至得到UDS的有用的评估,准备应用显微镜观察细胞毒害性的明显迹象(像细胞致密变化,用放射性同位素示踪或做标记减少标准)
切片在数颗粒前必须编码。
正常的是每个动物样品的至少两个切片上的100个细胞作记号。
少于100个细胞/每只动物应被确认。
S-phase的核颗粒数不用作记号,但是S-期细胞的比例可能要记录下来。
在形态学上正常细胞质的核中标记(
的总数应用合适的方法来决定,就像银颗粒沉积物所证明的那样。
细胞核颗粒数(细胞核颗粒,NG)和它在细胞质上的相等物(细胞质颗粒,CG)范围所决定的颗粒数.CG数通过获得细胞质的最重的标记的区域或通过2到3个随机的临近细胞质颗粒的平均值来测量。
其它数数方法(例如数整个细胞)如果可被确定,仍可使用。
2.实验数据
2.1.处理和结果
必须提供个体的切片和动物数的实验数据。
此外,所有实验数据应用列表计算的形式总结。
对每个细胞,每个动物,及每次喂食的时间的网状细胞核颗粒(NNG),应通过从CG数中减去NG数来计算。
如果要数修补中达饿细胞数,必须基于历史的或同步的消极对照实验数据来确认定义“修补中的细胞”这个定义的标准。
可用统计学方法来评价许多结果。
如果使用统计学测定,应在研究前就选择和确认。
2.2.实验结果评估和解释
阳性/阴性反应的的例子包括:
阳性:
(1)NNG应在基于实验室历史实验数据确定的事先对照的开端上评估;
或
(2)NNG值显著高于同步对照组值;
阴性
(1)NNG值低于
或
(2)NNG值并不显著高于同步对照组值。
考虑到实验数据的生物性关联:
即考虑像动物间变化,剂量反应关系和细胞毒害性等参数。
利用统计学的方法的帮助来评估实验结果。
然而,统计学的表现并不是阳性反应的这唯一一个决定因素。
虽然很多实验都给出了清晰的阳性或阴性结果,但很少情况下,那些实验数据防止对测定物质的活性作出一个详细的判断。
不管实验室重复多少次,结果可能仍是模棱两可的或可疑的。
用哺乳动物肝脏细胞进行的UDS测定的阳性结果表明测定物质减轻了DNA在哺乳动物肝脏细胞中的破坏,并能`用一个没有预定的DNA接合体来修补。
阴性结果表明在测定条件下,测定物质不能减轻通过实验能发现的DNA损害。
应讨论测定物质到达总循环或特殊目标组织(像影响全身的毒害性)的可能性。
3.实验结果报告
测定结果报告
测定结果报告,如果可能,应包括以下实验数据:
溶剂/媒介物
-溶剂选择的理由;
-如果知道的话,测定物质在溶剂中的溶解性和稳定性。
测定动物
-使用的种类
-动物样品的数目和年龄
-来源,居住条件等等
-在实验前动物样品的个体体重,包括体重范围,每个组的平均值和标准偏差;
测定条件
-阳性和阴性的溶剂对照;
-如果执行的话,在研究范围内发现的研究实验数据;
-溶剂选择的确认
-测定物质准备的细节
-分配路线的合理性
-如果适用的话,证明测定药剂达到总循环或目标组织的方法;
-如果能应用的话,从饮食/饮水中测定物质大集中性(ppm)到精确的喂食(mg/kg体重/天)的变异过程;
-食物和水质量的细节
-处理和选择计划的详细描述;
-毒害性测量方法;
-肝脏细胞准备和培养的方法;
-所用的自动射线照相术;
-记录准备的滑面数和细胞数;
-评估标准;
-评价研究为正、负或模棱两可的标准;
结果
-每个滑面、细胞和小组对细胞核、细胞质及网状细胞核颗粒的平均评价;
-如果可能的话,剂量反应的关系;
-任何的统计学评估;
-毒害性的表现;
-同步的负(溶剂/媒介物)和正面对照实验数据;
-包括范围、平均值和标准偏差在内的历史的负(溶剂/媒介物)和正面对照实验数据;
-如果确定的话,“修补中的细胞”的个数;
-如果确定的话,S-phase细胞的个数;
-细胞的变化。
结果的讨论
结论
4.参考文献
Ashby,J.,Lefevre,P.A.,Burlinson,B.andPenman,M.G.(1985).AnAssessmentoftheInVivoRatHepatocyteDNARepairAssay.MutationRes.,156,1-18.
Butterworth,B.E.,Ashby,J.,Bermudez,E.,Casciano,D.,Mirsalis,J.,Probst,G.andWilliams,G.(1987).AProtocolandGuidefortheInVivoRatHepatocyteDNA-RepairAssay.MutationRes.189,123-133.
Kennelly,J.C.,Waters,R.,Ashby,J.,Lefevre,P.A.,Burlinson,B.,Benford,D.J.,Dean,S.W.andMitchell,I.deG.(1993).InVivoRatLiverUDSAssay.In:
KirklandD.J.andFoxM.,(Eds)SupplementaryMutagenicityTests:
UKEMRecommendedProcedures.UKEMSSubcommitteeonGuidelinesforMutagenicityTesting.Report.PartIIrevised.CambridgeUniversityPress,Cambridge,NewYork,PortChester,Melbourne,Sydney,pp.52-77.
Madle,S.,Dean,S.W.,Andrae,U.,Brambilla,G.,Burlinson,B.,Doolittle,D.J.,Furihata,C.,Hertner,T.,McQueen,C.A.andMori,H.(1993).RecommendationsforthePerformanceofUDSTestsInVitroandInVivo.MutationRes.,312,263-285.
Fautz,R.,Hussain,B.,Efstathiou,E.andHechenberger-Freudl,C.(1993).AssessmentoftheRelationBetweentheInitialViabilityandtheAttachmentofFreshlyIsolatedRatHepatocytesUsedfortheInVivo/InVitroDNARepairAssay(UDS).MutationRes.,291,21-27.
Mirsalis,J.C.,Tyson,C.K.andButterworth,B.E.(1982).DetectionofGenotoxicCarcinogensintheInVivo/InVitroHepatocyteDNARepairAssay.Environ.Mutagen,4,553-562.
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