过氧化氢酶活力的测定实验报告.docx

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过氧化氢酶活力的测定实验报告

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过氧化氢酶活力的测定实验报告

　　篇一：

实验35过氧化氢酶的活性测定

　　植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使h2o2发生累积。

h2o2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。

过氧化氢酶可以清除h2o2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。

因此，植物组织中h2o2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。

本实验用分光光度法测定过氧化氢含量，利用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。

　　一、过氧化氢含量的测定

　　【原理】

　　h2o2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀，可被h２so4溶解后，在415nm波长下比色测定。

在一定范围内，其颜色深浅与h2o2浓度呈线性关系。

　　【仪器和用具】

　　研钵；移液管0.2ml×2支，5ml×1支；容量瓶10ml×7个，离心管5ml×8支；离心机；分光光度计。

　　【试剂】

　　100μmol/Lh2o2丙酮试剂：

取30%分析纯h2o257μl，溶于100ml，再稀释100倍；2mol/L硫酸；5%（w/V）硫酸钛；丙酮；浓氨水。

【方法】

　　1.制作标准曲线：

取10ml离心管7支，顺序编号，并按表40-1加入试剂。

　　待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml刻度，415nm波长下比色。

　　2.样品提取和测定：

（1）称取新鲜植物组织2~5g（视h2o2含量多少而定），按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管3000r/min下离心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。

（2）用移液管吸取样品提取液1ml，按表35-1加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min，弃去上清液。

沉淀用丙酮反复洗涤3～5次，直到去除植物色素。

（3）向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。

3.结果计算：

　　植物组织中h2o2含量（μmol/gFw）=

　　式中c—标准曲线上查得样品中h2o2浓度（μmol）；Vt—样品提取液总体积（ml）；V1—测定时用样品提取液体积（ml）；Fw—植物组织鲜重（g）。

　　二、过氧化氢酶的活性测定——高锰酸钾滴定法

　　【原理】

　　过氧化氢酶（cAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。

　　R（Fe+2）+h2o2==R（Fe+3+oh－）

　　R（Fe+3oh－）2+h2o2==R（Fe+2）2+2h2o+o2

　　据此，可根据h2o2的消耗量或o2的生成量测定该酶活力大小。

在反应系统中加入一定量（反应过量）的h2o2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的h2o2

　　5h2o2+2Kmno4+4h2so4

　　5o2+2Khso4+8h2o+2mnso4

　　即可求出消耗的h2o2的量。

【仪器和用具】

　　研钵；三角瓶50ml×4；酸式滴定管（10ml）；恒温水浴；容量瓶25ml×1。

【试剂】

　　10%h2so4；0.2mol/L磷酸缓冲液ph7.8；

　　0.1mol/L高锰酸钾标准液：

称取Kmno4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液标定；

　　0.1mol/Lh2o2：

市售30%h2o2大约等于17.6mol/L，取30%h2o2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/Kmno4溶液（在酸性条件下）进行标定；

　　0.1mol/L草酸：

称取优级纯h2c2o4·2h2o12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。

【方法】

　　1.酶液提取取小麦叶片2.5g加入ph7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

　　2.取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml0.1mol/Lh2o2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10%h2so42.5ml。

　　3.用0.1mol/LKmnＯ4标准溶液滴定h2o2，至出现粉红色（在30min内不消失）为终点。

　　酶活性用每克鲜重样品1min内分解h2o2的毫克数表示：

酶活（mgh2o2/gFw·min）=

　　式中A—对照Kmno4滴定毫升数；b—酶反应后Kmno4滴定毫升数；VT—酶液总量（ml）；V1—反应所用酶液量（ml）;w—样品鲜重（g）；

　　1.7—1ml0.1mol/L的Kmno4相当于1.7mgh2o2。

【注意】

　　所用Kmno4溶液及h2o2溶液临用前要经过重新标定。

　　三、过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法

　　【原理】

　　h2o2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240）随反应时间而降低。

根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

　　【仪器与用具】

　　紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴；

　　【试剂】

　　0.2mol/Lph7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/Lh2o2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。

【方法】

　　1.酶液提取：

称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml4℃下预冷的ph7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。

混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。

5℃下保存备用。

　　2.测定：

取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表40-2顺序加入试剂。

　　表40-2紫外吸收法测定h

　　样品液配置表25℃预热后,逐管加入0.3ml0.1mol/L的h2o2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。

　　以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。

　　过氧化氢酶活性（u/gFw/min）=

　　式中

　　A240=As0－

　　As0—加入煮死酶液的对照管吸光值；As1,As2—样品管吸光值；Vt—粗酶提取液总体积（ml）；V1—测定用粗酶液体积（ml）；Fw—样品鲜重（g）；

　　0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。

【注意事项】

　　凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。

　　【思考题】

　　1.影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些?

　　2.（:

过氧化氢酶活力的测定实验报告）过氧化氢酶与哪些生化过程有关?

　　篇二：

过氧化氢酶活力的测定

　　实验三过氧化氢酶活性的测定

　　一、实验目的：

　　了解过氧化氢酶的作用，掌握碘量法测定过氧化氢酶活性的原理和方法；

　　二、实验原理:

　　过氧化氢酶是一类色素蛋白，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢既是氧化剂又是还原剂。

　　R（Fe＋2）2＋h2o2---R（Fe+3oh）2

　　R（Fe+3oh）2+h2o2----R（Fe＋2）2+2h2o+o2

　　并合上式：

h2o2----2h2o+o2

　　据此，可根据消耗h2o2的消耗量或o2的生成量测定该酶活力大小。

在反应系统中加入一定量的过氧化氢溶液，经酶促反应后，加入过量的KI溶液生成的I2用标准的na2s2o3滴定，根据na2so3消耗的体积计算h2o2的消耗量。

　　三、实验材料、仪器和试剂：

　　1、实验材料：

小白菜

　　2、仪器：

恒温水浴锅、研钵、容量瓶、刻度吸管、100mL三角瓶

　　3、试剂：

（1）0.05mol/Lh2o2

（2）2mol/Lh2so4

　　（3）0.1mol/Lna2s2o3

　　（4）1%淀粉溶液（5）10%（nh4）6mo7o24

　　（6）ph7.8的磷酸缓冲液（7）20%KI

　　（8）caco3

　　四、实验步骤：

（1）酶液提取：

　　称取2.5g白菜叶，加少量caco3，2mLph7.8的缓冲液少量，研成匀浆，移入100ml容量瓶，用上述缓冲液冲洗研钵数次转入容量瓶中定容，静置10分钟，过滤。

取滤液10mL于另一100mL的容量瓶中稀释定容待测（根据酶活高低而定）。

（2）酶促反应：

　　取锥形瓶4个，编好号各加入10ml酶液之后，立即向两个瓶中加入2mol/Lh2so45mL，终止酶活性，作空白对照。

向另外两瓶各加h2o25mL，摇匀，在加入h2o2的那一刻起，记录时间，5分钟后迅速向实验瓶中加入2mol/Lh2so45mL，终止酶活性。

向三角瓶中加1mL20%KI和3滴（nh4）6mo7o24，摇匀后迅速用标准na2s2o3溶液进行滴定至淡黄色，加入1mL1%淀粉指试剂，蓝色恰好消失，

　　记录消耗的na2s2o3的体积V0，V；

　　五、结果记录与数据处理：

　　被分解的h2o2量（mg）=（空白滴定值-样品滴定值）×na2s2o3摩尔浓度×17过氧化氢酶活性（mg.g-1.min-1）=

　　六、结果分析与问题讨论：

　　被分解的h2o2量（mg）?

（总体积?

测定取液量）样品重（g）?

时间（min）

　　实验十还原型Vc含量测定

　　一、实验目的

　　学会从生物样品中提取维生素c方法,了解蔬菜中维生素c的含量。

　　学会测定维生素c含量的原理和方法,进一步掌握滴定法的基本操作技术.

　　二、实验原理

　　Vc由于其结构中具有烯二醇的结构，所以它是一种强还原剂，易被弱氧化剂氧化脱氢而成氧化型抗坏血酸。

Vc在酸性溶液中比中性溶液及碱性溶液中稳定，但易被热、光及某些金属离子破坏。

　　本实验是用碘液作氧化剂，淀粉为指示剂，当Vc全部被氧化后，过量一滴碘液与淀粉指示剂反应生成淡兰色络合物，即为终点。

　　三、实验材料、试剂及仪器

　　材料：

西红柿。

　　试剂：

　　2％草酸溶液：

称取20g草酸溶于蒸馏水中，溶解后稀释到1000mL，混匀；1％可溶性淀粉溶液：

称取1g可溶性淀粉用少量蒸馏水调成匀浆，倾入80mL的沸水中继续煮沸至透明，冷却后稀释至100mL；

　　0．1mol/L碘液（随用随配）：

称取6.5克碘和20克碘化钾于研钵中，加少量的蒸馏水研磨至完全溶解后稀释至500毫升混匀。

贮存于棕色试剂瓶中；1％草酸溶液：

称取10g草酸溶于蒸馏水中，溶解后稀释到1000mL，混匀；0.1mg/mLVc标准溶液：

准确称取抗坏血酸10mg，溶于1％草酸溶液中稀释至100mL贮存于棕色试剂瓶中冷藏（现用现配）。

　　仪器：

万分之一电子天平；棕色酸式滴定管；三角瓶等。

　　四、实验操作步骤：

　　1、碘液的标定：

吸取0.1mg/mLVc标准溶液10mL于100mL的锥形瓶中，加5滴可溶性淀粉，摇匀后用稀碘液滴定至浅蓝色，且30秒内不退色，即为终点。

滴二个平行样。

　　2、样品的提取：

准确称取10g左右的样品1份，

　　用少许2%草酸溶液研磨成匀浆，转入100mL容量瓶中，用2%的草酸溶液洗研钵3-4次，一并转入容量瓶中，最后用2%草酸溶液定容至100mL摇匀，放置10

　　分钟后过滤，滤液备用。

　　3、滴定：

　　空白滴定：

准确吸取10mL2%草酸溶液于100mL的锥形瓶中，加5滴1%淀粉指示剂，摇匀后用稀碘液滴定至浅蓝色，且30秒内不退色，即为终点,滴二个平行样。

　　样品滴定：

准确吸取10mL样品于100mL的锥形瓶中，加5滴1%淀粉指示剂，摇匀后用稀碘液滴定至浅蓝色，且30秒内不退色，即为终点,滴二个平行样。

　　六、数据记录及计算

　　1、样品的重量（g）：

样品1：

w1=

　　样品2：

w2=

　　2、碘液的标定（mL）：

V1=V2=V=

　　3、样品的滴定（mL）：

　　4、空白的滴定（mL）：

　　5、计算：

　　每毫升碘液相当于Vc的毫克数K（mgVc/mLI2）=0.1?

10V

　　Vc的含量（mg/100g样品）=

　　六、结果分析与讨论

　　（V样品?

V空白）?

c?

100?

100w样品?

10

　　篇三：

实验二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定

（1）

　　幻灯片1

　　实验二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定

　　——高锰酸钾滴定法

　　幻灯片2

　　一、实验目的

　　?

1.掌握过氧化氢酶活力测定的方法

　　?

2.了解过氧化氢酶在生物体中的作用原理?

3.掌握测定酶米氏常数的基本原理和方法

　　幻灯片3

　　二、实验原理

　　?

过氧化氢酶（cAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，

　　铁起传递电子的作用，过氧化氢既是氧化剂又是还原剂。

?

R（Fe2+）+h2o2=R（Fe3++oh－）

　　?

R（Fe3+oh－）2+h2o2=R（Fe2+）2+2h2o+o2

　　?

总反应式：

2h2o22h2o+o2

　　过氧化氢酶

　　幻灯片4

　　?

据此，可根据h2o2的消耗量或o2的生成量测定该酶活力大小。

　　?

本次实验酶促反应速度用单位时间底物的减少量表示，求出单位时间内反应前后h2o2

　　的量，计算出酶促反应速度。

　　?

在反应系统中加入过量的h2o2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条

　　件下）滴定多余的h2o2，即可求出消耗的h2o2的量。

　　?

5h2o2+2Kmno4+4h2so4=5o2+2Khso4+8h2o+2mnso4

　　幻灯片5

　　底物浓度对酶促反应速度的影响

　　?

在温度、ph及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速度有很大的影响。

　　?

底物浓度很低时，酶促反应的速度（v）随底物浓度的增加迅速增加；随着底物浓度继

　　续增加，反应速度的增加开始减慢；当底物浓度增加到一定值时，反应速度达到极限值（Vmax）。

　　?

米氏方程表示底物浓度与反应速度的关系

　　幻灯片6米氏常数Km

　　?

Km等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。

　　?

在酶学分析中，Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。

　　?

Km表示酶和底物之间的亲和能力，Km值越大，亲和能力越弱，反之亦然。

　　?

对于每一个酶促反应，在一定条件下都有其特定的Km值，因此可用于鉴别酶。

　　问题：

如何测定酶的Km值?

　　幻灯片7

　　?

米氏方程的倒数形式，即双倒数作图法?

（LineweaveR-burk法）如下：

　　?

[s]为底物浓度（mol/L）?

v为反应速度（μ

　　mol/L*min）

　　?

vmax为最大反应速度（μ

　　mol/L*min）

　　?

Km为米氏常数（mol/L）

　　?

用双倒数法（以1/v对1/[s]作图）计算Km和vmax

　　Km11?

?

vvmax[s]vmax

　　幻灯片8

　　三、材料、试剂与器具1.材料：

新鲜马铃薯2.试剂：

　　1）10%h2so4

　　2）0.2mol/L磷酸缓冲液,ph7.8

　　3）0.02mol/L高锰酸钾标准液：

称取Kmno4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000mL，临用前用草酸钠标定。

幻灯片9

　　高锰酸钾溶液标定

　　?

取5mL0.1mol/L的草酸和3mL10%h2so4溶液于锥形瓶中，加热至（75～85）℃

　　（见冒热气），趁热用Kmno4标准溶液滴定，刚开始反应较慢，滴入一滴Kmno4标准溶液摇动，待溶液褪色，再加第二滴Kmno4（此时生成的mn2+起催化作用）。

随着反应速度的加快，滴定速度也可逐渐加快，但滴定中始终不能过快，，不断摇动或搅拌。

滴定至溶液呈现微红色并持续半分钟不褪色即为终点。

　　?

离子反应方程式：

2mno4-+5c2o42-+16h+←→2mn2++10co2+8h20计算公式：

标定的Kmno4c=0.2/Vmol/L幻灯片10

　　4）0.1mol/Lh2o2：

市售30%h2o2大约等于17.6mol/L，取30%h2o2溶液5.68mL，稀释至1000mL，用标准0.02mol/LKmno4溶液（在酸性条件下）进行标定。

　　5）0.1mol/L草酸钠：

称取优级纯na2c2o413.4g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。

　　幻灯片113.器具

（1）恒温水浴

（2）研钵

　　三角瓶（50mL×4）酸式滴定管（10mL）容量瓶（50mL）幻灯片12四、实验步骤

　　?

（一）酶液提取

　　取新鲜马铃薯5g加入ph7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至50mL容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将缓冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

　　注意：

提酶在0－4℃操作

　　幻灯片13

　　?

（二）酶活力的测定?

1.反应

　　?

取50mL三角瓶4个（两个测定＋两个对照），测定瓶中加入酶液2.5mL，对照瓶中加

　　入煮死酶液2.5mL，再加入2.5mL0.1mol/Lh2o2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10%h2so42.5mL。

　　?

2.滴定

　　用0.02mol/LKmnＯ4标准溶液滴定h2o2，至出现粉红色（在30s内不消失）为终点。

　　注意：

每瓶反应时间要精确控制在10min

　　幻灯片143.计算

　　?

酶活力用每克鲜重样品1min内分解h2o2的毫克数表示?

酶活（mgh2o2/g·min）=?

式中：

　　?

A—对照Kmno4滴定毫升数；

　　?

b—酶反应后Kmno4滴定毫升数；?

VT—酶液总量（mL）；

　　?

V1—反应所用酶液量（mL）；?

Fw—样品鲜重（g）；

　　1.7—1mL0.02mol/L的Kmno4相当于1.7mgh2o2

　　幻灯片15

　　（三）动力学常数的测定（Km和vmax）1.反应

　　?

取100mL锥形瓶5个，编号后按下表加入试剂

　　?

各瓶分别加好h2o2和蒸馏水后，再依次加入酶液0.5mL，混匀，记录各瓶起始反应的

　　时间。

30℃反应5min后立即加入10%h2so45.0mL终止反应。

　　（A?

b）?

VT?

17.Fw?

V1?

t

　　?

?

?

?

　　幻灯片162.滴定

　　?

用0.02mol/LKmno4滴定各瓶中剩余的h2o2至微红色，记录消耗的Kmno4溶液毫升数。

　　分别求出各瓶反应前后的底物浓度[s]0、[s]1，并计算反应速度v：

　　[s]0=c1V1/10[s]1=2.5c2V2/10v=（c1V1-2.5c2V2）/5

　　?

以1/v对1/[s]0作图?

求出Km和Vmax

　　（用excel作图）

　　3.计算

　　[s]0为反应前的底物浓度（mol/L）[s]1为反应后的底物浓度（mol/L）