油樟dna提取的研究大学论文.docx
- 文档编号:23018791
- 上传时间:2023-04-30
- 格式:DOCX
- 页数:24
- 大小:154.63KB
油樟dna提取的研究大学论文.docx
《油樟dna提取的研究大学论文.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《油樟dna提取的研究大学论文.docx(24页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
油樟dna提取的研究大学论文
本科毕业论文(设计)
毕业论文
题目:
油樟DNA提取的研究
专业:
生物科学
学生姓名:
学生学号:
030601023
系级班:
生物工程03级1班
指导教师:
职称:
教授
宜宾学院教务处制
摘要
油樟是樟科樟属植物,本课题主要研究油樟根茎叶DNA的提取方法以及对根茎叶DNA提取效果进行对比分析。
油樟的细胞内含有大量的多糖、多酚、鞣质等次生代谢物,针对这一情况本研究在常规CTAB法的基础上做了进一步改进,成功提取出了高质量DNA。
做的改进主要有:
①在CTAB提取缓冲液中加入2gPVP以除去酚类杂质;②将DNA样品溶于TE缓冲液中保存时在样品中加入3μlRNaseA,以除去RNA。
用改进CTAB法提取的DNA得率和纯度都较高。
用改进CTAB法提取的油樟根DNA得率小于油樟茎DNA的得率小于油樟叶DNA得率,由于植物各组织器官的基因组DNA是相同的,因此宜用更易研磨成细粉的油樟嫩叶来提取油樟DNA,用做科研和教学。
关键词:
油樟;DNA;CTAB(十二烷基三甲基溴化铵);电泳;光吸收
Abstract
CinnamomumlongepaniculatumbelongstolaurelfamilyandLauraceaespecies.ThetopicsstudiedmainlythemethodofextractingDNAandcomparedtheDNAextractingmethodsfromroots,branchesofCinnamomumlongepaniculatum.CellsofCinnamomumlongepaniculatumcontainalargenumberofpolysaccharides,polyphenols,tannins,andothersecondarymetabolites.BasedonconventionalCTABmethod,aserialofimprovementswerecarriedoutandhigh-qualityDNAwassuccessfullyobtained.Themainimprovementsare:
①2gPVPwasaddedintoCTABextractionbuffertoremoveimpuritiesphenols;②3μlRNaseAintothesampleswhenDNAsamplespreservedinTEbuffertoremoveRNA.ImprovedCTABextractionofDNAyieldandpuritywashigher.TheDNAyieldusingimprovedCTABextractionwasroots>stems>leaves.BecausegenomicDNAissame,itiseasiertoextractDNAfromleavesofCinnamomumlongepaniculatumforresearch.
Keywords:
Cinnamomumlongepaniculatum;DNA;CTABmethodofDNA;electrophoresis;absorbingvalueoflight
目录
摘要I
AbstractII
第1章绪论1
第2章油樟根茎叶DNA的提取方法3
1.材料、药品、仪器3
1.1材料3
1.2主要试剂溶液3
1.3主要仪器设备4
2.实验方法和步骤4
2.1常规方法的提取4
2.2改良CTAB法5
2.3油樟根、茎、叶DNA提取的比较方法6
3.结果及分析6
3.10.8%琼脂糖凝胶电泳结果及分析6
3.2紫外光谱分析8
4.讨论10
4.1CTAB法的基本原理10
4.2几种主要试剂的作用与对比10
4.3方法的探索及改进11
4.4注意要点12
4.5实验过程中遇到的问题及对策12
5.总结13
5.113
5.213
5.313
参考文献14
致谢15
文献综述16
第1章绪论
图1-1油樟
如图1-1油樟[Cinnamomumlongepaniculatum(Gamble)]是樟科樟属植物。
高大乔木,叶互生,卵形、椭圆形或短圆形,先端长渐尖或急尖,基部楔形至近圆形,长5.5-12cm,宽3-6cm,幼时即无毛,腹面暗绿色,有光泽,背面粉绿色,通常羽状脉,中脉两面凸起,侧脉约5-6对,两面凸起,脉腋腹面泡状隆起,背面有小窝孔,孔内有短毛,横脉和细脉背面较明显,叶柄长2-3cm,无毛。
圆锥花序腋生,纤细,疏散,通常长10cm以上,无毛,花梗长1-3cm,无毛;花被长约2mm,外侧无毛,内侧密被毛,裂片卵形,长1.5mm,花后花被上部自花被管的顶端处整齐环裂脱落;雄蕊长约1mm,被柔毛,第3轮的花丝基部有1对具短柄状的腺体,退化雄蕊长约0.5mm,被毛,近心形;雌蕊无毛,子房近圆球形状,花柱较子房为长,柱头小,盘状。
果阔倒卵状,顶端平或微凹,歪斜,稍扁,长9mm,直径8mm,果托碟状,全缘,直径约3.5mm;果梗长4-5mm,向上增粗。
花期4-5月;果期8-9月[1]。
油樟在四川有大量分布,产于叙永、宜宾、屏山、娥眉、雅安、邛崃等地。
宜宾是油樟的分布中心。
在经历了许多坎坷之后,油樟终于闪现出了它那金子般的光芒。
1951年修建成渝铁路时,油樟被成批地砍伐用作枕木;1958年大办钢铁时,油樟竟老嫩不拘,被用作烧泡炭的燃料;1960年生活困难时,为了熬煮樟油,对幸存的樟树进行了掠夺性的采摘。
这些事实都导致珍贵的油樟资源招到了大规模的破坏,幸好在1978年十一届三中全会以来,各项林业政策得到了落实,油樟林也逐渐得以恢复。
1978年樟油产量增长为356t,比1959年的305t,增长16.7%。
到1985年宜宾县已有油樟林35130亩,采叶油樟树达到369万余株,全县树龄达到100年以上的油樟64株,200年以上的9株。
1986年宜宾县被列为四川油樟基地[2],由于大力发展油樟,到1995年,宜宾全县油樟面积由1980年的0.28万hm2发展到0.77万hm2,樟油产量从1980年的400多吨,增加到1995年的1200t,占全国同类产品产量的75%,占全省产量的90%,产品畅销日本、德国、法国、美国等50多个国家和地区,为国家创汇450多万美元[3]。
宜宾县被称为全国保存和发展最好的天然香料油源基地。
樟油粗加工的主产品1.8-桉叶油素,被称为“中国桉叶油”[4],1984年被评为四川省优质产品。
1999年,为适应西部大开发的形势,增加长江上游绿色植被,加大力度保护油樟树这一独特资源,建设全国最大的木本香料油基地,宜宾县又决定到2001年,用3年时间,再营造0.30万hm2油樟树基地。
油樟树具有生长快、材质好,萌发力强、干形通直,树形美观等特点,叶、枝、根、茎、花、果富含芳香油,是提炼天然香料的优良树种,也是目前全国保存和发展最好的天然香料油源。
它含有1.8-桉叶油素、α-萜品醇(松香醇)和香穗烯等40多种成分,经过深度加工可以提取多种重要的天然单离原料,是国防、轻工、香料、医药和高级电镀工业的稀有原料[5]。
特别是从中提取的1.8-桉叶油素物性稳定、芳香纯正,在国际贸易中被称为“中国桉叶油”,在世界各国都属免检产品。
为了充分开发利用油樟这一优势资源,国家科委于1996年将其列入了国家“星火计划”和名特优经济林商品基地建设项目[6]。
宜宾县地处金沙江和岷江下游“金三角”地带,是全国最大的油樟基地,樟油产量占全国的75%,占四川的90%,被中外客商誉为“油樟王国”。
大力发展油樟,对农民致富、出口创汇、增加税收、绿化荒山以及维持长江上游的生态环境等都起着十分重要的作用。
我们学校已经建立了以油樟为主要研究对象的“西南特色经济植物重点实验室”,为了从分子水平上对其做进一步的研究,本课题开始了初步的尝试,目的是为以后的分子生物学分析打下基础。
第2章油樟根茎叶DNA的提取方法
由于DNA分子标记实验以及其他许多分子实验,是从研究生物个体的基因组,脱氧核糖核酸开始的,因此,能否得到高质量的基因组DNA自然成为DNA标记技术关键的一步,只有高质量的DNA,才能够获得理想的DNA条带。
油樟的细胞内含有大量的多糖、多酚、鞣质等次生代谢物。
这些次生代谢产物,不仅能干扰DNA的提取过程,影响DNA的得率,还能与DNA发生不可逆的结合(尤其是多酚氧化后产物),影响DNA的质量,使提取的DNA样品呈棕褐色,DNA溶液粘稠,这种不纯的DNA既不能被内切酶酶切,也不能作为PCR模板,不能用于常规的分子生物学分析和研究[7]。
因此,如何从油樟中取得适于分子遗传分析和鉴定的高纯度基因组DNA是对其进行分子生物学研究首先要解决的问题。
虽然目前国内外针对多种顽拗植物基因组DNA的提取进行了大量的研究,提出了许多改进方法,但这些技术方法只是针对某种或某类植物而言,不同的顽拗植物所含的次生代谢物种类和含量不同,因此改进的方法也存在差异,不能普遍适用。
要想得到高质量的DNA,在DNA提取过程中既要防止DNA的降解和变性,又要尽量保持其在生物体内的天然状态。
要提取天然的具有生物活性的DNA,必须在温和的条件下,防止过酸、过碱和DNA酶的污染,避免剧烈振动与搅拌[8]。
采用常规CTAB法提取的油樟基因组DNA质量很差,本研究就以油樟的根、茎、叶为实验材料,探讨提取高质量油樟基因组DNA的方法。
1.材料、药品、仪器
1.1材料
采于宜宾县宗场镇孜岩村陆场主承包的油樟林,采取了幼嫩的油樟根、茎、叶,装入1.5mlEppendorf管和5ml离心管,立即置液氮罐中预冷,带回实验室后,保存于-70℃的冰箱中备用。
1.2主要试剂溶液
1.2.1液氮;
1.2.2CTAB提取缓冲液(2×):
100mmol/lTris-Hcl(PH8.0),20mmol/lEDTA,1.4mmol/lNacl,2%(W/V)CTAB,4%(V/V)β-巯基醇,2%(W/V)PVP;
1.2.3CTAB沉淀缓冲液(1×):
50mmol/lTris-Hcl(PH8.0),10mmol/lEDTA,0.7mmol/lNacl,1%(W/V)CTAB,2%(V/V)β-巯基乙醇;
1.2.4CTAB/Nacl溶液(10%CTAB/0.7mol/lNacl):
在80ml蒸馏水中溶解4.1gNacl,缓慢加入10gCTAB,同时加热搅拌,如果需要,可加热至65℃溶解[9];
1.2.5氯仿/异戊醇(24:
1);
1.2.6电泳缓冲液(TAE):
A)50×储存液(PH约8.5):
24.2gTris碱,5.7ml冰醋酸,3.72gEDTA,补加水至100ml
B)1×工作液:
40mmol/lTris·Ac,1mmol/lEDTA;
1.2.7琼脂糖凝胶:
0.8g琼脂糖,0.5μg/mlEB,补加1×TAE至100ml。
1.3主要仪器设备
1.3.1通风橱
1.3.2HH-S数显恒温水浴锅
1.3.3冷冻高速离心机
1.3.4紫外分光光度计
1.3.5CHN868PH计
1.3.6立式电热压力蒸汽灭菌器
1.3.7优普超纯水机
1.3.8格兰仕微波炉
1.3.9BIO-RAD凝胶成像系统
1.3.10电热恒温鼓风干燥箱
2.实验方法和步骤
2.1常规方法的提取
本研究参考《精编分子生物学实验指南》,采用常规CTAB法来提取油樟根、茎、叶DNA,具体操作程序如下:
2.1.1在所需的CTAB抽提液中加入β-巯基乙醇,使终浓度达4%(V/V),将此溶液及CTAB/Nacl溶液加热至65℃;
2.1.2取新鲜幼嫩叶片(根或茎)约3g,迅速放入离心管中,置于液氮罐中预冷;
2.1.3将样品从液氮罐中取出,放入预冷的研钵中,在研钵中不断倒入液氮,将叶片(根或茎)研磨成细粉;
2.1.4迅速将研磨好的细粉装入试管中,加入12μl预热的β-ME/CTAB,混合使之充分湿润;
2.1.5将试管置于65℃水浴中,保温80min,不时混匀;
2.1.6待冷至室温后,用等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:
24:
1)抽提,轻缓颠倒充分混匀,于4℃,12000rpm离心10min,回收上(水)相;
2.1.7在回收的上层中加入1/10体积的65℃预热的CTAB/Nacl溶液,颠倒混匀;
2.1.8用等体积的氯仿/异戊醇抽提,混匀,于4℃,12000rpm离心10min,回收上(水)相;
2.1.9加入正好1.5体积的CTAB沉淀液,颠倒离心管混匀,如果沉淀可见,继续步骤2.1.11,否则于65℃预热30min;
2.1.11加入0.6体积的异丙醇沉淀核酸,充分混匀,于4℃,12000rpm离心10min,沉淀DNA,用80%的乙醇洗涤沉淀物,干燥;
2.1.12沉淀干燥后溶于100μlTE缓冲液中,-20℃储存备用;
2.1.13用0.8%的琼脂糖凝胶做电泳分析;
2.1.14用紫外分光光度计做紫外光谱分析。
2.2改良CTAB法
具体操作程序如下(所有步骤为严格的无菌操作):
2.2.1在12mlCTAB抽提液中加入480μlβ-巯基乙醇,使终浓度达4%(V/V)。
将此溶液及CTAB/NaCl溶液水浴加热至65℃;
2.2.2取新鲜幼嫩根(叶片或茎)约3g,放入预冷的研钵中,不断倒入液氮将根(茎或叶)研磨成细粉;
迅速将研磨好的细粉装入试管中,加入预热的β-ME/CTAB,混合使之充分湿润;
2.2.3将试管置于65℃水浴中,保温80min,其间不时混匀;
2.2.4将样品转移至50ml离心管中,待冷至室温后,用等体积的氯仿/异戊醇抽提,轻缓颠倒充分混匀,于4℃12000rpm离心10min,回收上(水)相;
2.2.5在回收的上相中加入1/10体积的65℃预热的CTAB/Nacl溶液,颠倒混匀;
2.2.6用等体积的氯仿/异戊醇抽提,混匀,于4℃12000rpm离心,回收上(水)相;
2.2.7加入1体积的CTAB沉淀液,颠倒离心管混匀,如果沉淀可见,继续步骤2.3.8,否则于65℃温浴30min;
2.2.8加入0.6体积的异丙醇沉淀核酸,充分混匀,于4℃12000rpm离心10min,沉淀DNA;
2.2.9用80%乙醇洗涤沉淀物,干燥;
2.2.10沉淀干燥后溶于加有2µl1mg/mlRNaseA的100µlTE缓冲液中,4℃储存备用;
2.2.11取油樟根、茎、叶DNA各7µl,用0.8%(W/V)琼脂糖做凝胶电泳分析;
2.2.12取10µlDNA样品,稀释至2.5ml,测其A260和A280的吸收值。
2.3油樟根、茎、叶DNA提取的比较方法
本研究设置了单因素变量对照,从DNA的浓度和得率两方面来对比评判提取油樟根茎叶DNA的难易程度,如表2-1:
表2-1单因素变量法对比油樟根茎叶DNA
选择因子
根
茎
叶
材料
油樟根(2g)
油樟茎(2g)
油樟叶(2g)
药品
相同
相同
相同
仪器
相同
相同
相同
DNA提取方法
相同
相同
相同
凝胶电泳分析方法
相同
相同
相同
紫外光谱分析方法
相同
相同
相同
DNA浓度计算方法
相同
相同
相同
DNA得率计算方法
相同
相同
相同
3.结果及分析
3.10.8%琼脂糖凝胶电泳结果及分析
3.1.1用常规CTAB法所提根茎叶DNA的0.8%琼脂糖凝胶电泳结果及分析:
图3-1常规CTAB法提取的油樟根茎叶DNA凝胶电泳图谱
M:
DL20001:
根DNA2:
茎DNA3:
叶DNA
结果分析:
由图3-1可以看出,常规CTAB法提取的DNA质量较差,表现为DNA样品浓度较低,有严重的污染,说明该方法有待改进。
3.1.2用常规CTAB法所提DNA样品污染物研究结果及分析:
图3-2加RNaseA前后油樟根茎叶DNA凝胶电泳图谱
M:
DL20001-3:
未加RNaseA根茎叶DNA4-5:
加入RNaseA后根茎叶DNA
结果分析:
由图3-2可以看出,加入RNaseA前(如图3-2中编号1-3),在250-1500bp处有明晰的条带,加入RNaseA后(如图3-2中编号4-5)则该条带消失,说明在250-1500bp处的清晰的条带为RNA条带,用常规CTAB法提取的DNA中有严重的RNA污染。
3.1.3用改进CTAB法所提根茎叶DNA的0.8%琼脂糖凝胶电泳结果及分析:
图3-3油樟根茎叶DNA的凝胶电泳图谱
M:
DL20001:
根DNA2:
茎DNA3:
叶DNA
结果分析:
由图3-3可以看出,DNA无降解也无蛋白质和RNA污染,改进CTAB法较常规CTAB法所提油樟根茎叶DNA质量明显提高,具体表现为DNA的浓度和纯度大幅度提高;[DNA]根<[DNA]茎<[DNA]叶,表明在其他条件相同时,所提取油樟的根DNA的浓度小于茎DNA的浓度小于叶DNA的浓度,说明提取油樟根DNA的难度大于茎DNA的难度大于叶DNA的浓度。
3.2紫外光谱分析:
3.2.1常规CTAB法所提取油樟根、茎、叶DNA紫外光谱结果及分析:
表3-1常规CTAB法所提取油樟根茎叶DNA紫外光谱分析表
A260(Abs)
A280(Abs)
A260/A280
DNA浓度(μg/ml)
DNA得率(μg/g)
根
0.007
0.003
2.333
87.5
43.8
茎
0.070
0.033
2.121
875
437.5
叶
0.102
0.046
2.217
1275
637.5
注:
①据公式[DNA]=A260×稀释倍数×50(µg/ml)[10]计算出油樟根茎叶DNA浓度为:
[DNA]根=87.5µg/ml
[DNA]茎=875µg/ml
[DNA]叶=1275µg/ml
②据公式DNA得率(提取率)(μg/g材料鲜重)=DNA浓度/取材量(g)计算出油樟根茎叶DNA得率为:
根DNA得率=43.8μg/g
茎DNA得率=437.5μg/g
叶DNA得率=637.5μg/g
结果分析:
由表3-1看出,常规CTAB法DNA质量很差,具体表现为油樟根茎叶DNA的浓度和得率都很小,A260/A280的比值>2,说明油樟根茎叶的DNA质量很低,有较严重的RNA污染。
3.2.2改进CTAB法所提取油樟根、茎、叶DNA紫外光谱结果及分析:
表3-2改进CTAB法所提油樟根茎叶DNA紫外光谱分析表
A260(Abs)
A280(Abs)
A260/A280
DNA浓度(μg/ml)
DNA得率(μg/g)
根
0.014
0.008
1.75
175
87.5
茎
0.200
0.109
1.83
2500
1250.0
叶
0.673
0.375
1.89
8413
4206.5
注:
①据公式[DNA]=A260×稀释倍数×50(µg/ml)计算出:
[DNA]根=175µg/ml
[DNA]茎=2500µg/ml
[DNA]叶=8413µg/ml
②据公式DNA得率(提取率)(μg/g材料鲜重)=DNA浓度/取材量(g)计算出:
根DNA得率=87.5μg/g
茎DNA得率=1250.0μg/g
叶DNA得率=4206.5μg/g
结果分析:
由表3-2看出,改进CTAB法较常规CTAB法所提油樟根茎叶DNA质量明显提高,具体表现为DNA的浓度和纯度大幅度提高:
改进CTAB法提取的油樟叶油樟A260/A280的比值在1.7-1.9之间,说明油樟根茎叶的DNA质量都比较高,无较大的RNA污染和蛋白质污染;[DNA]根<[DNA]茎<[DNA]叶,根DNA得率<茎DNA得率<叶DNA得率。
显示在单一变量对照下,所提取油樟的根DNA的浓度和得率依次小于茎DNA的浓度和得率小于叶DNA的浓度和得率,说明提取油樟根DNA的难度大于茎DNA的难度大于叶DNA的浓度。
4.讨论
4.1CTAB法的基本原理
由于植物染色体DNA与组蛋白等结合成为脱氧核糖核蛋白复合体(deoxy-ribonuleoprotein,DNP),存在于细胞核中,因而,从细胞中提取DNA时,首先需要把DNP抽提出来,其次把蛋白质除去,然后除去细胞中的糖,核糖核酸(RNA)及无机离子等,从中分离出DNA。
DNP和核糖核蛋白复合物(RNP)在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响不同,DNP在高盐溶液(≥0.7mol/lNacl)中可以稳定存在,但如果降低盐浓度,DNP的溶解度也随之降低,当盐浓度≤0.3mol/l时几乎不溶,这时与CTAB结合的DNP就会沉淀出来。
而RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小,在低盐溶液中溶解度较大[11]。
另外大部分的蛋白质和多糖仍溶于溶液中,所以利用这个原理,我们不仅能分离DNP和RNP这两种核蛋白,还能将大部分的蛋白质和多糖除去,得到DNA粗提物。
再经过进一步的纯化,便可提取出高质量的DNA。
4.2几种主要试剂的作用与对比
4.2.1十六烷基三甲基溴化铵(cetyltriethlammoninumbromide,CTAB)是一种去污剂,它能与核酸形成复合物,并在低盐溶液中将DNP沉淀出来,CTAB在15℃以下会沉淀,因此应先将CTAB抽提液置于65℃水浴锅中预热[12];
4.2.2乙二胺四乙酸(EDTA):
能螯合大多数核酸酶所需要的辅助因子—镁离子;
4.2.3β-巯基乙醇:
防止酚类氧化(酚类化合物能与DNA共价结合,使DNA带棕色或褐色);
4.2.4聚乙烯吡咯烷烔(PVP):
与酚类结合;
4.2.5氯仿/异戊醇(24/1):
去除蛋白质。
其中氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。
异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的泡沫[13];
4.2.6异丙醇:
沉淀核酸。
沉淀DNA时用异丙醇而不用乙醇,因为用异丙醇沉淀DNA时只需加入0.6体积的容量,而且小分子量DNA都能沉淀下来,用乙醇沉淀DNA时,只能有选择地沉淀大分子量DNA[14]。
要注意的是异丙醇不易挥发,最好用80%的乙醇多洗几次。
4.3方法的探索及改进
针对常规CTAB法出现的问题所作的探索和采取的措施:
4.3.1在CTAB提取缓冲液中加入2%(W/V)PVP(聚乙烯吡咯烷烔):
实验发现在探索实验中经80%乙醇洗涤干燥后的沉淀仍略带褐色,说明沉淀中仍然含有酚类杂质,而CTAB提取缓冲液中已经加入了体积比高达4%的β-巯基乙醇,CTAB沉淀液中也加入了2%(V/V)的的β-巯基乙醇,说明仅仅靠β-巯基乙醇防止酚类氧化是不够的,还得用聚乙烯吡咯烷烔与之结合并除去酚类杂质;
4.3.2使用氯仿/异戊醇(24:
1),而不使用酚/氯仿/异戊醇(25:
24:
1)抽提:
原因之一是在使用酚/氯仿/异戊醇(25:
24:
1)抽提时,由于所加试剂体积大于实验室5
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 油樟dna提取的研究 大学论文 油樟 dna 提取 研究 大学 论文