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试验指导书任2
生物化学实验指导
适用专业:
农学、植物保护、园艺、农产品质量
与安全、中草药栽培与鉴定
贵州大学农学院
生化与分子生物学教研室
2007年8月
目录
生物化学实验室规则1
实验记录及实验报告2
实验一植物DNA的提取与测定3
实验二蛋白质的两性性质及等电点测定7
实验三温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响9
实验四还原糖和总糖的测定—3,5-二硝基水杨酸比色法12
实验五糖的颜色反应和定性鉴定14
实验六双缩脲法测定蛋白质含量19
附录21
附录1生物化学实验基本操作21
附录2实验样品的制备25
附录3常用试剂的配制26
附录4市售常用酸、碱的浓度26
附录5一般化学试剂的分级27
附录6易变质及需特殊方法保存的试剂27
附录7标准缓冲液的配制28
附录8常用缓冲液的配制方法29
附录9干燥剂36
附录10硫酸铵饱和度的常用表37
附录11离心机转数(r/min)与相对离心力(RCF)的换算38
生物化学实验室规则
1.每个同学都应该自觉遵守课堂纪律,维护课堂秩序,不迟到,不早退,不大声谈笑。
2.实验前必须认真预习,熟悉本次实验的目的、原理、操作步骤,懂得每一操作步骤的意义和了解所用仪器的使用方法,否则不能开始实验。
3.实验过程中要听从教师的指导,严肃认真地按操作规程进行实验,并把实验结果和数据及时、如实记录在实验记录本上,文字要简练、准确。
完成实验后经教师检查同意,方可离开实验室。
4.实验台面应随时保持整洁,仪器、药品摆放整齐。
公用试剂用完后,应立即盖严放回原处。
勿使试剂、药品洒在实验台面和地上。
实验完毕,仪器洗净放好,将实验台面抹拭干净,才能离开实验室。
5.使用仪器、药品、试剂和各物品必须注意节约。
洗涤和使用仪器时,应小心仔细,防止损坏仪器。
使用贵重精密仪器时,应严格遵守操作规程,发现故障须立即报告教师,不得擅自动手检修。
6.实验室内严禁吸烟!
加热用的电炉应随用随关,严格做到:
人在炉火在,人走炉火关。
乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加热,并要远离火源操作和放置。
实验完毕,应立即拨去电炉开关和关好水笼头,拉下电闸。
离开实验室以前应认真、负责地进行检查水电,严防发生安全事故。
7.废液体可倒入水槽内,同时放水冲走。
强酸、强碱溶液必须先用水稀释。
废纸屑及其他固体废物和带渣滓的废物倒入废品缸内;不能倒入水槽或到处乱扔。
8.要精心使用和爱护仪器,如使用分光光度计时,不能将比色杯直接置于分光光度计上,并注意拿放比色杯时,不要打碎。
仪器损坏时,应如实向教师报告,并填写损坏仪器登记表,然后补领。
9.实验室内一切物品,未经本室负责教师批准,严禁带出室外,借物必须办理登记手续。
10.每次实验课由班长或课代表负责安排值日生。
值日生的职责是负责当天实验室的卫生、安全和一切服务性的工作。
实验记录及实验报告
每次实验要做到课前认真预习,实验操作中仔细观察并如实记录实验现象与数据,课后及时完成实验报告。
一、课前预习
实验课前要将实验名称、目的和要求、实验内容与原理、操作方法和步骤等简单扼要地写在记录本中,做到心中有数。
二、实验记录
从实验课开始就要培养严谨科学作风,养成良好习惯。
实验条件下观察到的现象应仔细地记录下来,实验中观测的每个结果和数据都应及时如实地直接记在记录本上,记录时必须使用钢笔或圆珠笔,并做到原始记录准确、简练、详尽、清楚。
如称量试材样品的重量、滴定管的读数、分光光度计的读数等,都应设计一定的表格准确记下正确的读数,并根据仪器的精确度准确记录有效数字。
例如,光密度值为0.050,不应写成0.05。
每一个结果至少要重复观测两次以上,当符合实验要求并确知仪器工作正常后再写在记录本上。
另外,实验中使用仪器的类型、编号以及试剂的规格、化学式、分子量、准确的浓度等,都应记录清楚,以便总结实验完成报告时进行核对和作为查找成败原因的参考依据。
如果发现记录的结果有怀疑、遗漏、丢失等,都必须重做实验。
三、实验报告
实验结束后,应及时整理和总结实验结果,写出实验报告。
按照实验内容可分为定性和定量两大类,实验报告的格式:
实验序号,实验名称;
(1)目的和要求
(2)内容与原理
(3)主要仪器及试剂配制
(4)操作方法与实验步骤
(5)结果与讨论
定性实验报告中的实验名称和目的要求是针对该次实验课的全部内容而必须达到的
目的和要求。
在完成实验报告时,可以按照实验内容分别写原理、操作方法、结果与讨论等。
原理部分应简述基本原理。
操作方法(或步骤)可以流程简图的方式或自行设计的表格来表示。
结果与讨论包括实验结果及观察现象的小结、对实验课遇到的问题和思考题进行探讨以及对实验的改进意见等。
定量实验报告中,目的和要求、原理以及操作方法部分应简单扼要的叙述,但是对于实验条件(试剂配制及仪器)和操作的关键环节必须写清楚。
对于实验结果部分,应根据实验课的要求将一定实验条件下获得的实验结果和数据进行整理、归纳、分析和对比,并尽量总结成各种图表,如原始数据及其处理的表格、标准曲线图以及比较实验组与对照组实验结果的图表等。
另外,还应针对实验结果进行必要的说明和分析。
讨论部分可以包括:
关于实验方法(或操作技术)和有关实验的一些问题,如实验的正常结果和异常现象以及思考题进行探讨,对于实验设计的认识、体会和建议,对实验课的改进意见等。
实验一植物DNA的提取与测定
一、目的
本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA的原理和方法,进一步了解DNA的性质。
二、原理
细胞中的DNA绝大多数以DNA-蛋白复合物(DNP)的形式存在于细胞核内。
提取DNA时,一般先破碎细胞释放出DNP,再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质,最后用乙醇把DNA从抽提液中沉淀出来。
DNP与核糖核蛋白(RNP)在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大,利用这一特性可将二者分离。
以NaCl溶液为例:
RNP在0.14mol/LNaCl中溶解度很大,而DNP在其中的溶解度仅为纯水中的1%。
当NaCl浓度逐渐增大时,RNP的溶解度变化不大,而DNP的溶解则随之不断增加。
当NaCl浓度大于1mol/L时,DNP的溶解度最大,为纯水中溶解度的2倍,因此通常可用1.4mol/LNaCl提取DNA。
为了得到纯的DNA制品,可用适量的RNase处理提取液,以降解DNA中搀杂的RNA。
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,可以形成具有刚性的滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度,DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。
不同DNA的分子量大小及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带。
琼脂糖凝胶电泳法分离DNA,主要是利用分子筛效应,迁移速度与分子量的对数值成反比关系。
因而就可依据DNA分子的大小使其分离。
该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。
溴化乙锭(EB)为扁平状分子,在紫外光照射下发射荧光。
EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物,其荧光强度与DNA的含量成正比。
据此可粗略估计样品DNA浓度。
关于植物总DNA的提取主要有两种方法:
1.CTAB法:
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵,hexadecyltrimethylammoniumbromide,简称CTAB):
是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中(0.7mol/LNaCl)是可溶的,当降低溶液盐的浓度到一定程度(0.3mol/LNaCl)时从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开,然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中,再加入乙醇使核酸沉淀,CTAB能溶解于乙醇中。
2.SDS法:
利用高浓度的阴离子去垢剂SDS(十二烷基磺酸钠,Sodiumdodecylsulfate,简称SDS)使DNA与蛋白质分离,在高温(55~65℃)条件下裂解细胞,使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸,然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀,离心后除去沉淀,上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
一般生物体的基因组DNA为107~109bp,在基因克隆工作中,通常要求制备的大分子DNA的分子量为克隆片段长度的4倍以上,否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端,导致酶切后有效末端太少,可用于克隆的比例太低,严重影响克隆工作。
因此有效制备大分子DNA的方法必须考虑两个原则:
(1)尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质(如多酚、类黄酮等)、多糖等杂质,并防止和抑制内源DNase对DNA的降解。
(2)尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
几乎所有的DNase都需要Mg2+或Mn2+为辅因子,故实现
(1)尽量去除蛋白质的要求,需加入一定浓度的螯合剂,如EDTA、柠檬酸,而且整个提取过程应在较低温度下进行(一般利用液氮或冰浴)。
为实现
(2)需要在DNA处于溶解状态时,尽量减弱溶液的涡旋,而且动作要轻柔,在进行DNA溶液转移时用大口(或剪口)吸管。
提取的DNA是否为纯净、双链、高分子的化合物,一般要通过紫外吸收、化学测定、“熔点”(meltingtemperature,Tm)测定、电镜观察及电泳分离等方法鉴定。
本实验采用CTAB法提取DNA并通过紫外吸收法鉴定。
三、实验材料、主要仪器和试剂
1.实验材料
新鲜菠菜幼嫩组织、花椰菜花冠或小麦黄化苗等
2.主要仪器
(1)高速冷冻离心机
(2)751型分光光度计
(3)恒温水浴
(3)液氮或冰浴设备
(4)磨口锥形瓶
(5)电泳仪,电泳槽
(6)紫外透射检测仪
3.试剂(CTAB法)
(1)CTAB提取缓冲液:
100mmol/LTris-HCl(pH8.0),20mmol/LEDTA-Na2,1.4mol/LNaCl(如表1),2%CTAB,使用前加入0.1%(V/V)的β-巯基乙醇。
表1CTAB提取缓冲液配制
试剂名称
M.W.
配制1000ml
配制500ml
Tris
121.14
12.114g
6.057g
EDTA-Na2
372.24
7.4448g
3.7224g
NaCl
58.44
81.816g
40.908g
用HCl调
pH值。
(2)TE缓冲液:
10mmol/LTris-HCl,1mMEDTA(pH8.0)。
(3)DNase-freeRNaseA:
溶解RNaseA于TE缓冲液中,浓度为10mg/ml,煮沸10~30min,除去DNase活性,-20℃贮存(DNase为DNA酶,RNase为RNA酶)。
(4)氯仿-异戊醇混合液(24:
1,V/V):
240ml氯仿(A.R.)加10mL异戊醇(A.R.)混匀。
(5)3mol/L乙酸钠(NaAc,pH6.8):
称取NaAc·3H2O81.62g,用蒸馏水溶解,配制成200ml,用HAc调pH至6.5。
(6)无水乙醇
(7)Tris-硼酸(5×TBE):
54gTris,27.5硼酸,20mol/LEDTA,配制成1000ml
(8)6X载样缓冲液:
0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青,40%蔗糖水溶液
(9)溴化乙锭(EB)
TE缓冲液,Tris-HCl(pH8.0)液,NaAc溶液均需要高压灭菌。
四、操作步骤
(1)DNA抽提
1.称取2~5g新鲜菠菜幼嫩组织或小麦黄花苗等植物材料,用自来水、蒸馏水先后冲洗叶面,用滤纸吸干水分备用。
叶片称重后剪成1cm长,置研钵中,经液氮冷冻后研磨成粉末。
待液氮蒸发完后,加入15mL预热(60~65℃)的CTAB提取缓冲液,转入一磨口锥形瓶中,置于65℃水浴保温,0.5~1h,不时地轻轻摇动混匀。
2.加等体积的氯仿/异戊醇(24:
1),盖上瓶塞,温和摇动,使成乳状液。
3.将锥形瓶中的液体转移到离心管中,在室温下4000r/min离心5min,静置,离心管中出现3层,小心地吸取含有核酸的上清到另一干净的离心管中(注意吸取上清时不能吸入界面物质),弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。
4.根据需要,上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。
5.在抽提后的上清液中加入1/10倍体积的3mol/LNaAc(pH6.8)和2倍体积的95%乙醇,混匀,室温放置5min,以10000r/min离心5min,倾去乙醇液,将离心管倒置于吸水纸上,吸干液体。
6.加入1ml70%乙醇洗涤DNA沉淀,按步骤5所述方法弃上清,于空气中或用电吹冷风使DNA沉淀干燥。
7.用适量含RNaseA酶(20μg/ml)的TE溶解DNA。
(2)DNA含量及纯度测定
1.吸取5μlDNA样品,加水至1ml,混匀后转入石英比色杯中。
2.分光光度计先用1ml蒸馏水校正零点。
3.在260nm紫外光波长下读出光密度值,代入下式计算DNA的含量。
4.测OD260/OD280值,DNA纯品的OD260/OD280值为1.8。
如果OD260/OD280值大于1.8,说明存在RNA,可以考虑用RNA酶处理样品;小于1.6,说明样品中存在蛋白质,应再用酚/氯仿抽提以及氯仿单独抽提,之后用乙醇沉淀纯化DNA。
(3)琼脂糖凝胶电泳分离DNA
11g琼脂糖加入100ml1×TBE电泳缓冲液中,摇匀。
在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。
(冷却到60℃,加入100μl的0.5mg/mlEB,并摇匀。
)
2用胶带将制胶板两端封好,插入适当梳子,将溶解的琼脂糖(约50℃)倒入,室温冷却凝固。
3充分凝固后撕掉两端的胶布,将凝胶置入电泳槽中,加1×TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm,小心垂直向上拔出梳子。
4用移液器吸取总DNA或质粒样品4μl于封口膜上,再加入2μl的6X载样缓冲液,混匀后,小心加入点样孔。
5打开电源开关,调节电压至3-5V/cm,可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动,电泳约30min-60min。
6将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。
7将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上,盖上防护观察罩,打开紫外灯,可见到发出荧光的DNA条带。
五、结果计算
DNA浓度(μg/ml)=
OD260
×稀释倍数
0.020×L
式中OD260为260nm处的光密度;L为比色杯光径(cm);0.020为1μg/mlDNA钠盐的光密度。
六、附注
如果植物样品不经液氮处理,提取液中的CTAB浓度需要提高到4%(W/V)。
在许多情况下,使用0.1%(V/V)巯基乙醇,并不能完全抑制叶片中的氧化作用,但是,这种氧化作用不会影响限制性内切酶的活性。
如果使用的巯基乙醇浓度高于0.1%(V/V),则会大大降低DNA的得率。
七、思考题
1.制备的DNA在什么溶液中较稳定?
2.为了保证植物DNA的完整性,在吸取样品、抽提过程中应注意什么?
八、注意事项
1.EB是致癌物质,切勿用手接触,更不要污染环境。
2.实验过程中操作要保持安静、镇定,注意样品不能混样。
实验二蛋白质的两性性质及等电点测定
一、目的
(1)通过实验了解蛋白质的两性性质及等电点与蛋白质分子聚沉的关系。
(2)掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。
二、原理
蛋白质是两性电解质。
蛋白质分子中可以解离的基团除N端α―氨基与C端α―羧基外,还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团,如酚基、巯基、胍基、咪唑基等基团,它们都能解离为带电基团。
因此,在蛋白质溶液中存在着下列平衡:
调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等,即所带正负电荷相等,净电荷为零,此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。
在等电点时,蛋白质溶解度最小,溶液的混浊度最大,配制不同pH的缓冲液,观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可确定蛋白质的等电点。
三、仪器和试剂
1.仪器
试管架;试管:
15ml×6;刻度吸管:
1ml×4,2ml×4,10ml×2;胶头吸管×2。
2.试剂
(1)1mol/L乙酸:
吸取99.5%乙酸(比重1.05)2.875ml,加水至50ml。
(2)0.1mol/L乙酸:
吸取1mol/L乙酸5ml,加水至50ml。
(3)0.01mol/L乙酸:
吸取0.1mol/L乙酸5ml,加水至50ml。
(4)0.2mol/LNaOH:
称取NaOH2.000g,加水至50ml,配成1mol/LNaOH。
然后量取1mol/LNaOH10ml,加水至50ml,配成0.2mol/LNaOH。
(5)0.2mol/L盐酸:
吸取37.2%(比重1.19)盐酸4.17ml,加水至50ml,配成1mol/L盐酸。
然后吸取1mol/L盐酸10ml,加水至50ml,配成0.2mol/L盐酸。
(6)0.01%溴甲酚绿指示剂:
称取溴甲酚绿0.005g,加0.29ml1mol/LNaOH,然后加水至50ml。
(7)0.5%酪蛋白溶液:
称取酪蛋白(干酪素)0.25g放入50ml容量瓶中,加入约20ml水,再准确加入1mol/LNaOH5ml,当酪蛋白溶解后,准确加入1mol/L乙酸5ml,最后加水稀释定容至50ml,充分摇匀。
四、操作方法
1.蛋白质的两性反应
(1)取一支试管,加0.5%酪蛋白1ml,再加溴甲酚绿指示剂4滴,摇匀。
此时溶液呈蓝色,无沉淀生成。
(2)用胶头吸管慢慢加入0.2mol/L盐酸,边加边摇至有大量沉淀生成。
此时溶液的pH值接近酪蛋白的等电点。
观察溶液颜色的变化。
(3)继续滴加0.2mol/L盐酸,沉淀会逐渐减少以至消失。
观察此时溶液颜色的变化。
(4)滴加0.2mol/LNaOH进行中和,沉淀又出现,继续滴加0.2mol/LNaOH,沉淀又逐渐消失。
观察溶液颜色的变化。
解释以上
(1)—(4)的颜色及沉淀变化的原因。
注:
溴甲酚绿的变化范围
2.酪蛋白等电点的测定
(1)取同样规格的试管7支,按下表精确地加入下列试剂:
试剂(ml)
管号
1
2
3
4
5
6
7
1.0mol/L乙酸
1.6
0.8
0
0
0
0
0
0.1mol/L乙酸
0
0
4
1
0
0
0
0.01mol/L乙酸
0
0
0
0
2.5
1.25
0.62
蒸馏水
2.4
3.2
0
3
1.5
2.75
3.38
溶液的pH
3.5
3.8
4.1
4.7
5.3
5.6
5.9
(2)充分摇匀,然后向以上各试管依次加入0.5%酪蛋白1ml,边加边摇,摇匀后静置5min,观察各管的混浊度。
(3)用-、±、+、++、+++等符号表示各管的混浊度。
根据混浊度判断酪蛋白的等电点,最混浊一管的pH值即为酪蛋白的等电点。
五、注意事项
缓冲液的pH值必须准确。
六、思考题
1.解释蛋白质两性反应中颜色及沉淀变化的原因。
2.该方法测定蛋白质等电点的原理是什么?
实验三温度、pH及酶的激活剂、
抑制剂对酶活性的影响
一、目的
1.巩固温度、pH值、激活剂、抑制剂对酶活性影响的认识。
2.学习测定酶的最适温度、最适pH值的简单方法,学习检测激活剂和抑制剂的方法。
二、原理
酶是指化学本质为蛋白质的生物催化剂。
在一定条件下,酶促化学反应进行的能力即称为酶活性(酶活力)。
影响酶活性的因素是多方面的,如温度、pH及某些化学物质等都会影响酶的催化活性。
在一定条件下,能使酶活性达到最高时的温度即酶的最适温度,而能使酶活性达到最高时的pH即酶的最适pH。
例如,唾液淀粉酶的最适温度是37℃,而其最适pH是6.8。
能增高酶活性的物质称为酶的激活剂,能降低酶活性却又不使酶变性的物质叫酶的抑制剂。
凡能使蛋白质变性的因素都可以使酶变性而丧失活性。
酶活性通常是通过测定酶促化学反应的底物或产物量的变化来进行观察的。
本实验用唾液淀粉酶为材料来观察酶活性受理化因素影响的情况。
唾液中含有唾液淀粉酶,淀粉在该酶的催化作用下会随着时间的延长而出现不同程度的水解,从而得到各种糊精乃至麦芽糖、少量葡萄糖等水解产物。
而碘液能指示淀粉的水解程度——淀粉遇碘可呈紫色、暗褐色与红色,而麦芽糖与葡萄糖遇碘则不呈现颜色反应,如图所示:
淀粉酶
淀粉酶
淀粉糊精麦芽糖+少量葡萄糖
(棕黄色,碘本身颜色)
加碘后:
(蓝色)
(紫红色、暗褐色或红色等)
三、仪器和试剂
1.仪器
试管(10mm×100mm);试管架;电热恒温水浴箱;沸水浴;冰浴;多孔白瓷板(或比色盘);滴管
2.试剂
(1)0.5%淀粉溶液:
称取可溶性淀粉0.5g加蒸馏水少许搅拌成糊状,然后用煮沸的1%氯化钠溶液稀释到100ml。
(2)碘化钾-碘溶液:
取碘化钾2g及碘1.27g溶解于200ml蒸馏水中,使用前用蒸馏水稀释5倍。
(3)1%淀粉溶液:
称取可溶性淀粉1.0g加蒸馏水100ml,煮沸溶解。
(4)1%CuSO4溶液:
称取1gCuSO4•5H2O,用蒸馏水溶解至100ml。
(5)磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液pH5.0~8.0
A.0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:
称25.62gNa2HPO4•2H2O,用蒸馏水溶解后,定容至1000ml;
B.0.1mol/L柠檬酸溶液:
称19.21g无水柠檬酸,用蒸馏水溶解后定容至1000ml。
用A、B两种溶液,按附录方法,配制pH5.0、pH6.8、pH8.0各10ml。
(6)0.5%NaCl溶液。
(7)唾液淀粉酶制备:
每人用自来水漱口3次,然后取20ml蒸馏水含于口中,半分钟后吐入烧杯中,稀释至40ml为稀释唾液,供实验用。
四、操作方法
(一)温度对酶活性的影响
1.取3支大试管,编号后按下表操作
试管号
0.5%淀粉溶液
稀释唾液[1]
温度
1
5ml
1ml
0℃水浴
2
5ml
1ml
37℃水浴
3
5ml
1ml
沸水浴
2.在白色比色盘上,置碘液2滴于各孔中,自试管放入水浴后,每隔1min,从第二管中取反应液1滴与碘液混合,观察颜色变化。
3.待第二管中反应液遇碘不发生颜色变化(即只呈碘的颜色)时,向各管中加入碘液1滴,摇匀,观察并记录各管颜色,说明温度对酶活性的影响。
(二)pH对酶活性的影响[2]
1.取试管3支,按下表操作
试管号
0.5%淀粉溶液
pH5.0缓冲液
pH6.8缓冲液
pH8.0缓冲液
稀释唾液
1
2ml
3ml
0
0
1ml
2
2ml
0
3ml
0
1ml
3
2ml
0
0
3ml
1ml
2.将3支试管放入37℃水浴中,并在白色比色盘上用碘液检查第二管,待碘液不变色时,向各管加碘液几滴,观察并记录各管颜色。
(三)酶的激活剂及抑制剂对酶活性的影响
1.取小试管3支,按下表操作
试管号
1%淀粉溶液
1%CuSO4
溶液[3]
0.5%NaCl
溶液[4]
蒸馏水
稀释唾液
1
2ml
1ml
0
0
1ml
2
2ml
0
1ml
0
1ml
3
2ml
0
0
1ml
1ml
2.将3支试管放入
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