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Transwell实验超详细
Transwell侵袭实验总结
第一节概念
这里想明确两个概念,一个是Transwell,另一个是肿瘤细胞侵袭模型。
1.Transwell
关于Transwell这个词该如何解释,查了很多资料也未见准确的注解,我觉得可以这么理解吧,trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思,well有小室的意思,可以从字面上理解,这是一类有通透性的杯状的装置,根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍,可以认为这是一种膜滤器(Membranefilters),也可认为是一种有通透性的支架(permeablesupports)。
更准确地说,Transwell应该是一种实验技术,这项技术的主要材料是Transwell小室(Transwellchamber,Transwellinsert),其外形为一个可放置在孔板里的小杯子,不同厂家对Transwell会有不同的命名,而不同型号也可有不同形状,不同大小,根据实验需要,可有不同选择。
但无论是何种外形,其关键部分都是一致的,那就是杯子底层的一张有通透性的膜,而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。
这层膜带有微孔,孔径大小有0.1-12.0µm,根据不同需要可用不同材料,一般常用的是聚碳酸酯膜(polycarbonatemembrane)。
下图是一个Transwell装置的纵切面
将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上室内盛装上层培养液,下室内盛装下层培养液,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
我们将细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择,当然不同细胞其体积不同,具体选择时要考虑到细胞大小。
这里主要谈几种大家常用的实验:
(1)共培养体系:
小于3.0um孔径条件下,细胞不会迁徙通过,因此,若研究不涉及细胞运动能力,不需要细胞穿过聚碳酸酯膜,则应选择3.0µm以下孔径。
常用0.4、3.0µm。
我们实验室用的是0.4µm。
将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。
(2)趋化性实验
可用5.0、8.0、12.0µm膜,上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室,计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。
①细胞B对细胞A的趋化作用:
将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。
②趋化因子对细胞的趋化作用:
将细胞种于上室,下室加入某种趋化因子,可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。
(3)肿瘤细胞迁移实验
常用8.0、12.0µm膜,上室种肿瘤细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑,计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
(4)肿瘤细胞侵袭实验
常用8.0、12.0µm膜,原理与肿瘤细胞迁移实验类似。
上室种肿瘤细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑,但与肿瘤细胞迁移实验不同的是,聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶,用以模仿体内细胞外基质,细胞欲进入下室,先要分泌基质金属蛋白酶(MMPs)将基质胶降解,方可通过聚碳酸酯膜。
计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。
2.肿瘤细胞侵袭模型
用于研究肿瘤细胞侵袭能力的肿瘤细胞侵袭模型有如下几种(引自司徒镇强《细胞培养》):
2.1体内癌细胞侵袭模型
2.1.1皮下移植侵袭模型
2.1.2肌肉内移植侵袭模型
2.1.3腹腔内移植侵袭模型
2.1.4小鼠肾包膜下移植侵袭模型
2.1.5鼠睾丸包膜下移植侵袭模型
2.1.6小鼠耳廓皮下移植侵袭模型
2.1.7鼠爪垫皮下移植侵袭模型
2.1.8视网内界膜侵袭模型
2.2体外癌细胞侵袭模型
2.2.1体外静止器官培养法
2.2.1.1半固体培养基单细胞器官培养法
2.2.1.2液体培养基单细胞器官培养法
2.2.2半体外半体内器官培养法
2.2.3单层细胞器官培养法
2.2.4瘤细胞球体器官培养法
2.2.4.1静止球体器官培养法
2.2.4.2旋转摇动球体器官培养法
2.2.5单层细胞侵袭实验模型
2.2.6Transwell侵袭小室测定法
可见,Transwell与侵袭实验之间并不能划等号,Transwell有多种应用,侵袭实验也有多种方法。
所谓Transwell侵袭实验,其实是指将Transwell这一技术应用于肿瘤细胞侵袭研究的一种实验。
由于其简单易行、重复性好,因而得到了越来越广泛的应用,但不能认为研究肿瘤侵袭只有Transwell一种方法。
第二节Transwell侵袭实验
我的课题涉及Transwell侵袭实验和Transwell迁移实验,其他方面的Transwell应用我不太清楚,因此这里主要谈谈Transwell侵袭实验。
1.实验用品:
①Transwell小室:
多种厂家可提供,论坛里常用的是Costar、Corning、BD生产的小室,我们实验室用的是Chemicon公司的ECM550系列,另有Boydenchamber、Millipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友介绍的Thincert。
这些厂家提供的小室,有的已铺好基质胶,买来就可以用,很方便,但也比较贵,我们实验室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的,质量很好,但是非常贵,24孔板配套的小室,每个价格约130元,不推荐给大家。
BD也有已包被好的,价格不清楚。
Coster和Corning公司生产的小室,是论坛里比较常用的,好像是要自己铺胶,但据说每个小室成本只有40左右,应该比较适合中国国情。
下面是一些战友提供的价格,具体建议大家联系代理商咨询。
linanping1979战友提供的价格:
coster的24孔板的transwell的价格是456元RMB,8µm,用于肿瘤的侵袭实验。
iceyxy战友提供的价格:
Millipore的8µm的50个1760RMB,0.4µm的2000多,是一次性的。
梅林战友提供的BD价格:
240RMB一块(6.5um,24孔,12instert),好像是没胶的。
liguofan说国产的boyden30块一个。
jjyy提供的价格是:
corningcatNo.3422.6.5mmtranswellwith8.0umprorepolycarbonatemembraneinsert,Qty48,950人民币不到。
平均每个20元不到。
Transwell小室按照公司的要求,都是一次性使用的。
不过其实洗洗泡泡还是可以重复用的。
我用的Chemicon公司的ECM554,用完后擦去基质胶,再用胰酶和75%酒精泡,可以把膜洗得很干净,用前用紫外里外都照30min。
sword01战友提供的处理方法:
用棉签轻轻擦去胶和反面细胞,清水冲洗,超声清洗,低挡,30min,清水3×5min,蒸馏水3×5min,室温凉干,用前紫外线小室正面3h,反面6h,微波,低火10min×2。
因为我买的是铺好胶的,所以没买Matrigel,二次利用的小室只用来做不需要铺胶的迁移实验。
以前的ChemiconECM550系列,膜很结实,擦不坏,可以反复用很多次,但现在的膜已经改用一种很薄很脆的材料,一般只能重复用一次,真黑啊!
很多战友说Costar和Corning也是可以重复用的,大家可以试试。
victoh战友对Millipore公司的millicell有比较详细的讲解,链接如下:
本人没见过,有兴趣的可以自己研究一下。
另外,根据论坛战友提供的信息,osmonic公司有专用的膜出售,鼎国生物代理。
Transwell小室用过后,可把原来的膜切下,贴上osmonic公司的膜,这样又可以用了,不过我没用过,有兴趣的可以试试。
maojianwen战友的使用方法:
trasnwell小室做一次后,将原来的膜去掉,重新泡酸,泡酒精,使用前照紫外,然后用女士用指甲油(注意用无色较稀的)将osmonic公司的膜贴上,剪掉多余的边缘。
再照紫外。
②上层培养液:
上层培养液采用无血清培养基,为维持渗透压,需加入0.05%-0.2%BSA。
③细胞:
值得注意的是,有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。
建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达,特别是MMP-2的表达。
如果不清楚细胞MMPs的表达情况,就盲目进行Transwell侵袭实验,可能会造成不必要的浪费,一次Transwell侵袭实验花钱少则数百,多则数千,并不是笔小数目,还是小心为妙。
另外,为了让实验结果更明显,可先撤血清让细胞饥饿12-24h,再进行实验。
④基质胶:
常用的是人工重构基底膜材料Matrigel,主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原,生产厂家有BD、美国CollaborativeRsearch公司等。
CaoY战友的帖这么说的:
Matrigel是BD公司生产的,是一种细胞外基质,4度时是液体,在37度会逐渐凝固成胶状,不可逆。
同样的东西在sigma叫ECM。
zhangyong1036战友提供的价格:
BD公司的matrigel1500左右。
如果购买的小室是已经铺好基质胶的,那么Matrigel就不需要购买了。
⑤下层培养液:
下层常用含5%-10%FBS的培养基,具体浓度根据细胞侵袭力而定,侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。
下层也可用趋化因子,有战友将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子,但个人认为,FBS仍是最合适的。
⑥细胞培养板:
常用于Transwell侵袭实验的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等,以24孔最常用。
细胞培养板没什么特殊要求,普通的细胞培养板就可以。
但要注意,细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套。
⑦此外,膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白(fibronectin,FN,Sigma有售),这样做的目的是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上,也可用胶原(collagen)或明胶(gelatin)。
很多战友认为这不是必须的,而且我也是不涂的,细胞照样贴壁很好。
如果贴壁不好的话可以试试看。
linanping1979战友认为,如果培养时间很长(>24h),细胞还是会掉到下室里面去,所以有条件的话,最好还是在膜下层涂上FN。
另外,值得一提的是,膜下层涂上FN还有一定的趋化作用。
2.步骤
2.1Transwell小室制备
2.1.1无基质胶Transwell小室制备
①包被基底膜:
用50mg/LMatrigel1:
8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面,4℃风干。
如果需要在下室面铺FN的话,可将200ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。
用胶原(collagen)的话,一般配成0.5mg/ml,直接用枪吸了涂在膜上。
②水化基底膜:
吸出培养板中残余液体,每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液,37℃,30min。
另有tianjin_glioma战友提供的方法:
在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel(3.9ug/ul)60-80µl(注意体积不可太大,以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好),置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。
2.1.2有基质胶的Transwell小室制备
Chemicon公司的ECM550系列说明书要求,将小室放入培养板中,在上室加入300µl预温的无血清培养基,室温下静置15-30min,使基质胶再水化。
再吸去剩余培养液。
2.2制备细胞悬液
①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗1-2遍,用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至1-10×105,个人认为不要超过5×105。
具体实验时采用密度要自己摸索,因为不同细胞,其侵袭能力是不同的。
个人经验,细胞量过多,穿过膜的细胞会过多过快,如果最后用计数法统计结果的话将难以计数;而过少的话,可能还没到检测的时间点,所有的细胞都已穿过,因此最少也要保证在收样的时候,上室内还要有一定量的细胞存在。
个人认为,对照组和处理尽量不要分开计数,因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。
如果需要对细胞预处理而不得不分开计数,那么计数一定要多重复几次,力求准确,尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。
2.3接种细胞
①取细胞悬液100-200µl加入Transwell小室,不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求,请参考说明书。
24孔板小室一般200µl。
②24孔板下室一般加入500µl含FBS或趋化因子的培养基,不同的培养板加的量有不同要求,具体请参考说明书。
这里要特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。
③培养细胞:
常规培养12-48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。
时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。
以我的课题为例,我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力,还对细胞增殖有明显抑制。
我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72h的IC50。
用这个浓度处理细胞,24h内对细胞增殖并无明显抑制,但24h后,抑制作用就开始出现了。
所以,用这个浓度来做Transwell,处理时间也必须限定在24h内,否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡,使处理组细胞数目少于对照组,那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少,究竟是由于侵袭被抑制引起,还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。
时间过长不可以,同样,过短也不行,因为细胞内会有一定量的MMPs储存,短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。
同时从药物被吸收进去,进而发挥作用,影响MMPs表达,到最后释放到培养基中,还需要一个过程。
时间点的选择可尽量长点,也可选择多个时间点研究时间依赖效应,但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。
另外,我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态,而是圆形的,仍是悬浮时的形态,不过会聚集成团,所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张,是正常现象
在培养过程中,膜下会逐渐有少量小气泡产生,这是正常现象,可不予处理,但我遇到过培养一段时间后,膜下出现了大气泡,幸亏及时发现,否则后果将非常严重。
因此,个人建议,最好接种细胞后1-2h把培养板从培养箱里拿出来看看,确信没有大气泡产生。
2.4结果统计
检测穿过的细胞数有两种方法:
2.4.1直接计数法
2.4.1.1“贴壁”细胞计数
这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。
如下图:
通过给细胞染色,可在镜下计数细胞
①用棉签擦去基质胶和上室内的细胞
②染色:
常用的染色方法有结晶紫染色、台肦蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等。
个人推荐采用0.1%结晶紫染色,这种方法有如下优势:
(1).不需要固定细胞,直接染色即可。
(2).配制简单方便。
(3).染色后可以用33%醋酸脱色,将结晶紫完全洗脱下来,洗脱液可在酶标仪上570nm测其OD值,间接反映细胞数。
个人认为这是结晶紫染色最大的优势所在。
因为,虽然经过准确的细胞计数,往往穿过膜的细胞数仍难以准确控制,可能某一批实验穿过的细胞会特别多,以致细胞成堆,这种情况下就难以计数了,这种情况下就可以用醋酸脱色后用酶标仪检测。
使用结晶紫染色要注意,染色前要将膜风干,否则可能会染不上。
③细胞计数:
我们使用的是LeicaDC300F正置显微镜进行观察和拍照,把Transwell小室反过来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。
也有不少人用手术刀将膜切下后染色,再贴在玻片上,滴二甲苯,再盖上盖玻片,就可以长期保存,但是这样做小室就成了一次性的了,未免有点浪费。
取若干个视野计数细胞个数。
论坛里一般采用3-5个视野,也有人用10个,都是随机选取,个人认为这样选择的视野带有很大的偶然性,也会掺进人为影响,特别是计数视野较少的时候。
我选取16个视野,不是随机选择,而是有固定的位置。
我们使用的显微镜所看到的视野的直径刚好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直径的1/4。
如图,蓝色部分表示膜的大小,白色圆形表示视野的大小,绿色方形则表示拍照时所能拍下的视野的中心部分。
这样,每个小室都拍摄如下图的16个视野进行计数,这样得到结果是比较客观和准确的。
2.4.1.2“非贴壁”细胞计数
由于某些细胞自身的原因或某些膜的关系,有时细胞在穿过膜后不能附着在膜上,而是掉进下室。
如下图:
2.4.2间接计数法
间接计数法主要用于穿过细胞过多,而无法通过计数获得准确的细胞数所采用的方法,与常用的MTT实验是同样的原理。
2.4.2.1MTT法
①用棉签擦去基质胶和上室内的细胞
②24孔板中加入500µl含0.5mg/mlMTT的完全培养基,将小室置于其中,使膜浸没在培养基中,37℃4h后取出。
③24孔板中加入500µlDMSO,将小室置于其中,使膜浸没在DMSO中,振荡10min,使甲臜充分溶解。
取出小室,24孔板于酶标仪上测OD值。
2.4.2.2荧光试剂检测
这类方法一般是与Transwell小室一起出售的,其原理与MTT法类似,是用一种荧光染料染细胞,再将细胞裂解,检测荧光值。
Chemicon的ECM554即属于这类。
2.4.2.3结晶紫检测
上文已说过,这里不再赘述,原理与MTT法也是类似的。
但结晶紫染色还有个优点,就是染色和脱色的过程并不影响膜上细胞,在脱色后还可重新染色。
这是用正置显微镜拍摄的图,结晶紫染色,进行细胞计数。
第三节Transwell的其他应用的实验步骤
1.Transwell肿瘤细胞迁移实验
过程与Transwell侵袭实验基本一致,不同的只是不需要铺Matrigel。
个人认为,由于没有基质胶的阻挡,细胞穿过膜的速度较侵袭实验明显加快,所以细胞量要更大。
我做侵袭实验的细胞密度是1×105,而迁移实验的密度是1×106。
另外,下层培养液的FBS浓度也可适当下调,我做侵袭实验的浓度是5%,迁移实验的浓度是2.5%。
2.cathywxy战友的Transwell上皮细胞培养步骤
做了一段时间的原代细胞培养,把经验拿出来跟大家分享一下吧,请有关战友共同探讨:
(1)将雄性wistar大鼠麻醉,开胸,将气管取出,置于4℃含0.1%胰蛋白酶XIV(Sigma),100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素(Gibco-BRL)、无Ca2+、Mg2+,无血清的MEM。
(2)用无菌的细胞刮棒刮气管内壁,将所得溶液离心后得到游离细胞。
(3)离心后立即用新鲜的上述MEM溶液(含10%胎牛血清)清洗3次,以中和胰蛋白酶,再用含5%胎牛血清、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的LHC-8medium(Biofluids)冲洗一次。
(4)冲洗过后,将得到的细胞悬液用台盼兰测定活力,若存活率大于90%,则将细胞以106/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上(12mmSNAPWELL,Costar),以37°C5%CO2-95%空气含5%胎牛血清(Gibco-BRL)and100U/ml青霉素and100ug/ml链霉素的LHC-8medium孵育6~10天。
(5)孵育后,经测定跨上皮电阻在1000~2000Ω之间,即可用于电生理试验。
显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状,圆形核位于中央,生长时常彼此紧密连接成单层细胞片
链接:
3.metastasis战友的TranswellB16细胞的体外迁移实验
我以前用costar的Transwell做过B16细胞的体外迁移实验,具体是这么做的:
首先把Transwell倒置,在Transwell的PVPF膜(0.8um)的下表面涂一层fibronectin(10ug/ml,50ul),37度2小时,PBS洗一遍后,放入预先每孔加有600ul的培养基(含10%血清)的24孔板内,后在Transwell的内室加入细胞(100ul,用含0.1%血清的培养基稀释好自己所需密度),放入培养箱,12-18小时后,取出Transwell,用棉签擦去PVPF膜靠近内室那一面的细胞,另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟,结晶紫染色20分钟,用清水洗3遍以上,后在显微镜下观察细胞,记数。
链接:
4.mci战友的内皮细胞HMEC-1迁移实验
1%明胶处理的transwell经无血清的MCDB131培液于培养箱中平衡1小时后,上室加入100µl用serum-freeMCDB131稀释的5*104/孔的HMEC及不同浓度的药物,下室加入0.6mlserum-free的MCDB131培液及20%FCS刺激迁移,同时设置相应阴性及阳性对照,置于CO2培养箱中作用8小时,然后弃去孔中培液,用90%酒精常温固定30分钟,0.1%结晶紫常温染色10分钟,清水漂净,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,显微镜(Olympus,DP50,Japan).下观察并拍照,最后用10%乙酸100µl/孔抽提10分钟,于600nm处测定OD值。
抑制率计算公式为:
抑制率(%)=[(OD值给药组-OD值无刺激阴性对照)/(OD值不加药阳性对照-OD值无刺激阴性对照)]×100%.
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