western blot操作规范Word下载.docx

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[5].轻轻在顶层加入几毫升覆盖物（无水乙醇、去离子水或正丁醇），以阻止空气氧对凝胶聚合的抑制作用。

[6].凝胶充分聚合。

时间约30~60min,聚合后在覆盖层和凝胶的界面间有一清晰的折光线。

[7].倒掉覆盖层，用无离子水洗凝胶上部数次，尽可能用吸水纸吸干凝胶顶端的残存的液体。

[8].按表2配制浓缩胶，并注入分离胶上端。

插入梳子。

插入梳子子应小心避免梳子顶端留有气泡。

[9].浓缩胶充分聚合，时间30~60min。

[10].浓缩胶聚合好后，将制胶装置从基座上取下，放入电泳槽。

[11].上下槽均加入新鲜Tris-甘氨酸电泳缓冲液（至少负极槽使用新鲜电泳缓冲液）。

[12].小心拔出梳子，若孔间隔离凝胶条倾斜，用小号注射器针头扶正。

[13].用电泳缓冲液冲洗梳孔。

b上样与电泳

将蛋白样品解冻后直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。

按照一定顺序在加样孔中加入样品，根据SDS-PAGE电泳玻璃板间隙厚度不同，选择加入样品量，一般0.75mm间隙15孔的上样量<

10μl/孔，1mm间隙10孔的上样量<

20μl/孔。

上样量根据实际经验自己掌握。

1.上样前将胶板下的气泡赶走。

2.所有蛋白样品调至等浓度后上样，最外两泳道易跑歪，尽量不用，Marker加在最边上的加样孔中。

3.电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳,电压设定为50V左右，而在溴酚蓝进入分离胶时使用高电压恒压电泳，电压设定为120V左右。

电泳过程中最好设置定时时间，以免电泳过头。

4.在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。

或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。

3.转膜（槽转印）

卸下电泳装置，用绿色的塑料片轻轻撬开玻璃板，用塑料铲或者干净的刀片小心切去浓缩胶，保留分离胶，在分离胶左上切角（以区分胶的上下）

为避免污染，请佩戴手套接触凝胶、印迹膜和滤纸

1.相对于每一张凝胶，需要按尺寸裁剪出一张PVDF膜（5.5cm×

8.5cm）、两张滤纸（6.5cm×

10cm）。

将切好的PVDF膜浸入甲醇中不少于15min才可以使用。

2.在加有转移液的搪瓷盘里放入转印夹、两块纤维衬垫、滤纸（2张超厚滤纸或者6张普通滤纸）和浸泡过的PVDF膜。

3.打开转印夹将黑色的一面浸入转膜缓冲液中，从下往上依次放入纤维衬垫、滤纸、分离胶、PVDF膜、滤纸、海绵。

整个过程在转膜缓冲液中进行。

在铺每一层时都要用玻璃棒轻轻赶走气泡，尤其是胶和膜之间一定不能留有气泡。

4.将转印夹合好，放到转印槽中，要使转印夹的黑面对着转印槽的黑面，转印夹的红面对着转印槽的红面。

转印槽通电后会产热，在转印槽有较大空隙的一边放入冰盒（事先置于-80℃）用来降温。

将整个电泳槽放入一个大的容器中（大的塑料泡沫盒子最好），在这个容器中盛满冰。

接通电源，设定转膜电流为300mA，转印30min~60min（目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长）。

5.关闭电源，取出膜，然后用ddH2O漂洗1~2min。

注意膜上要做好标记。

4.封闭及杂交

1.将膜放在塑料盒子，加入适量封闭液，于37℃恒温振荡器上放置1h，或4℃过夜。

必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步骤。

2.参考一抗说明书，按照适当比例用封闭液稀释一抗。

将膜转入干净密闭的塑料小盒中，加入用封闭液稀释的一抗，于37℃或室温孵育反应1h或者4℃过夜。

3.一抗孵育结束后，小心地倾倒出一抗杂交液，用PBST或者TTBS漂洗后再浸洗3次，每次10~15min。

4.参考二抗的说明书，按照适当比例用封闭液稀释二抗，加入稀释好的二抗，继续在37℃或室温孵育反应30min~60min。

5.二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次10~15min。

如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

5.ECL化学发光，显影，定影

（1）将A和B两种试剂等量（常用各500μl）在5ml离心管中等体积混合；

打开X-光片夹，铺上保鲜膜，将NC膜面朝上放于保鲜膜上，滴加此混合液1-3min后（见到荧光），用保鲜膜包好。

（2）将1×

显影液，自来水和定影液分别到入盘中；

在红灯下

✧取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；

把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；

根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min到5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；

✧曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。

显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；

✧显影结束后，先用自来水洗一下X-光片，然后再放到定影液中进行定影（这样可以延长定影液使用时间，从而节约定影液）。

定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；

6.凝胶图象分析：

将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

附录:

各种溶液和试剂的配置

SDS聚丙烯酰胺凝胶的分离范围（表1）

不同体积SDS-PAGE浓缩胶的配方（表2）

不同浓度不同体积SDS-PAGE分离胶的配方（表3）

[1].30%聚丙烯酰胺单体贮液：

14.55g丙稀酰胺+0.45gN，N-甲叉双丙稀酰胺，先用40ml双蒸水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀释至50ml，0.45μm滤膜过滤。

用棕色瓶储存于4℃。

1.丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套等。

聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成分。

（参照《分子克隆》二版P924）

[2].分离胶缓冲液：

1.5MTris-HCl,pH8.8。

配制方法：

9.08gTris溶解在40ml双蒸水中，用4mol/L盐酸调节pH值8.8，再用双蒸水加至50ml。

4℃保存。

[3].浓缩胶缓冲液：

1.0MTris-HCl,pH6.8。

6.06gTris溶解在40ml双蒸水中，用4mol/L盐酸调节pH值6.8，再用双蒸水加至50ml。

[4].10%SDS（十二烷基硫酸钠）（电泳级）：

10gSDS，用双蒸水溶解并定容至100ml，室温保存。

[5].10%过硫酸铵（AP）：

0.1g过硫酸铵溶解于1ml双蒸水中。

过硫酸铵会缓慢分解，应每周新鲜配制。

[6].TEMED（N，N，N′，N′-四甲基乙二胺）：

原液使用。

应使用电泳级TEMED。

[7].5×

Tris-甘氨酸电泳缓冲液：

125mMTris，1.25M甘氨酸，0.1%（m/v）SDS，pH8.3。

配制方法：

在900ml去离子水中溶解15.1gTris碱和94g甘氨酸（电泳级）（pH8.0），然后加入50ml10%SDS（电泳级），用去离子水补至1000ml。

[8].Tris-甘氨酸电泳缓冲液：

25mMtris，250mM甘氨酸，0.1%（m/v）SDS，pH8.3。

[9].1×

SDS样品缓冲液：

50mMTris-Cl（pH6.8），100mMDTT,2％（m/v）SDS，0.1％（m/v）溴酚蓝，10%（v/v）甘油。

不含DTT的1×

SDS样品缓冲液可在室温保存。

DTT配成1M的贮存液，临用前加入。

5ml配制方法

1．称量下列试剂置于10ml塑料离心管中。

1MTris•Cl（pH6.8） 

1.25ml

SDS（电泳级） 

0.5g

溴酚蓝（BPB） 

25mg

甘油 

2.5ml

2．加去离子水溶解后定容至5ml。

3．小份（500ul/份）分装后于室温保存。

4．使用前将25ul的2-ME加到每小份中。

5．加入2-ME的LoadingBuffer可在室温下保存一个月左右。

[10].2×

SDS上样缓冲液：

100mMTris-HCl（pH6.8），200mMDTT，4%（m/v）SDS，0.2%溴酚蓝，20%甘油。

[11].5×

250mMTris-HCl（pH6.8），500mMDTT，10％（m/v）SDS，0.5％（m/v）溴酚蓝，50%（v/v）甘油。

不含DTT的5×

[12].预染蛋白质分子量标准物（marker）

[13].考马斯亮蓝凝胶染色液：

将0.25g考马斯亮蓝（CoomassieBrilliantBlue）R-250溶解在90ml甲醇：

水（1：

1，v/v）和10ml冰乙酸中，用滤纸过滤，室温保存。

[14].1mol/LDTT（20ml）

1．称取3.09gDTT，加入到50ml塑料离心管中。

2．加20ml的0.01MNaOAc（pH5.2），溶解后使用0.22μm滤器过滤除菌。

3．分装后－20℃保存。

（参照《分子克隆》二版P884）

[15].3M醋酸钠（NaOAc）（100ml）

1．称取40.8gNaOAc•3H2O置于100～200ml烧杯中，加入约40ml的去离子水后搅拌溶解。

2．加冰醋酸调节pH值至5.2。

3．定容至100ml，高压灭菌后室温保存。

0.01MNaOAc（pH5.2）参照此配方配制。

[16].10×

转膜缓冲液

甘氨酸（MW75.07）151.1g

Tris（MW121.14）30.3g

蒸馏水至1000ml

溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至20%。

通常取80ml母液，加560ml蒸馏水，最加160ml甲醇，配制成800ml即可。

（先加甲醇易产生沉淀）

[17].10×

TBS缓冲液

Tris（MW121.14）24.2g

NaCl80.0g

（浓盐酸调pH至7.6），溶解后室温保存。

[18].1×

TBST缓冲液

10×

TBS缓冲液100ml

蒸馏水900ml

Tween-201ml

因Tween-20较粘稠，应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块，即可防止产生气泡。

溶解后室温保存。

[19].封闭液/抗体稀释液（5%脱脂牛奶）

1×

TBST缓冲液95-100ml

脱脂奶粉5g

溶解后4℃保存，可于一周内使用。

[20].丽春红储存液（10×

）

丽春红2g

三氯乙酸 

30g

磺基水杨酸 

加水至100ml。

用1份上述储存液加9份去离子水即成丽春红使用液，使用后应予废弃。

[21].显影液与定影液

表1SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围

双丙烯酰胺：

丙烯酰胺为1：

29浓度（%）

线性分离范围（KD）

15

12-43

10

16-48

7.5

36-94

5.0

57-212

表2不同体积SDS-PAGE浓缩胶的配方

表3不同浓度不同体积SDS-PAGE分离胶的配方

1.分离胶的配方

溶液成分

不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）

5

10

15

20

25

30

40

50

6%

水

2.6

5.3

7.9

10.6

13.2

15.9

21.2

26.5

30%丙烯酰胺溶液

1.0

2.0

3

4

6

8

1.5mol/LTris（pH8.8）

1.3

2.5

3.8

6.3

7.5

12.5

10%SDS

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.4

0.5

10%过硫酸氨

TEMED

0.004

0.008

0.012

0.016

0.02

0.024

0.032

0.04

8%

2.3

4.6

6.9

9.3

11.5

13.9

18.5

23.2

2.7

6.7

10.7

13.3

0.003

0.006

0.009

0.015

0.018

0.03

10%

1.9

5.9

9.9

11.9

19.8

1.7

3.3

8.3

16.7

0.002

0.01

12%

1.6

4.9

6.6

8.2

16.5

2

12

16

15%

1.1

3.4

5.7

9.2

2.配制Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶（浓缩胶）所用溶液

1

0.68

1.4

2.1

4.1

5.5

6.8

0.17

0.33

0.67

0.83

1.0mol/LTris（pH6.8）

0.13

0.38

0.63

0.75

1.25

0.06

0.08

0.001

0.005