虎杖多糖提取工艺优化及抗氧化性研究Word文件下载.docx
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中药的加工方法有煎制、烘焙、切片等初步加工,加工方法原始,粗糙,不能专项提取,副作用较大,严重阻碍着中医药的发展和走向世界。
现在中国注重中药的研究和研制,中药的提取工艺得到重大提升,制成了精度高、纯度高的中药颗粒剂、片剂和针剂,对世界医药的发展起了巨大的促进,对治疗世界性的重大疑难杂症如癌症、肿瘤、心血管病、精神疾病和艾滋病等有了针对性的作用,
中药的化学成所含成份十分复杂,种类繁多,其中既有含有多种有效成份,又有无效成份,也包含有毒成份。
为了提高中药的治疗效果,需要在提取分离某一类或某一种成分时,根据其独特的性质,设计提取分离流程,最大限度地提取有效成分,去除无效及有毒成分。
因此,必须对加工、提取工艺结合现代科技进行优化。
提取方法的不同,提取等量有效成分所需原料和能源中中药有效成分的提取是中药生产过程重要的单元操作,其工艺特点、工艺流程的选择和设备配置都直接关系到被提取有效成分的数量和质量,从而进一步影响到产品的质量、经济效益等。
因此探明中药提取的机理、优化提取工艺参数等逐渐成为中药生产和研究的重点内容。
一、中药的提纯方法及改进优化
传统提取方法就是利用一些技术最大限度提取其中有效成份,使得中药制剂的内在质量和临床治疗效果提高,使中药的效果得以最大限度的发挥。
传统的离心法、板框过滤法、澄清剂法、醇沉法、树脂吸附法等工艺无法对中药提取液进行有效的澄清和提纯精制,同时还存在如过滤困难堵塞快、树脂堵孔、醇沉溶剂消耗大、高温浓缩时能耗高、生产提取废水量大、造成环保负担等问题[1]。
中药传统提取方法包括水煎煮法、浸渍法、渗漉法、改良明胶法、回流法、溶剂提取法、水蒸气蒸馏法和升华法等。
其中水煎煮法是最常用的方法[2-3]。
中药提取传统方法缺点是有效成分损失较多,尤其是水不溶性成分;
提取过程中有机溶剂有可能与有效成分作用,使其失去原有效用;
非有效成分不能被最大限度地除去,浓缩率不够高;
提取液中除有效成分外,往往杂质较多,尚有少量脂溶性成分,给精制带来不利;
高温操作会引起热敏性有效成分的大量分解。
随着现代科学技术和工艺水平的提高,中药提取分离中的高新技术有:
复合酶解法、超临界流体萃取法、膜分离技术、超微粉碎技术、中药絮凝分离技术、半仿生提取法、超声提取法、旋流提取法、加压逆流提取法、大孔树脂吸附法、超滤法、分子蒸馏法等。
它们与传统提取方法的优点在于:
提取物纯度高,操作简单,节能;
提取效率高,生产周期短,易发现天然植物中新的活性成分,极少损失易挥发组分或破坏生理活性物质,无溶剂残留,产品质量高。
二、虎杖的药用
虎杖(RhizomaPolygoniCuspidati)为蓼科蓼属多年生草本植物,虎杖的干燥根和茎叶亦入药。
主要含蒽醌类化合物、芪类化合物、水溶性多糖和鞣制等成分。
虎杖性味苦寒,归肝肺胆经,主要功效有祛风利湿,祛痰止咳,清热解毒,活血化瘀。
中医临床用于治疗湿热黄疸肺热咳嗽、疮痈、肿毒、关节痹痛、经闭经痛、水火烫伤、跌打损伤等。
虎杖的主要化学成分有游离蒽醌和蒽醌苷。
主要为大黄素,大黄素甲醚,大黄酚,蒽苷,迷人醇等芪类化合物如白藜芦醇、白藜芦醇苷或称虎杖晶、原儿茶酸、右旋儿茶精、糖苷类、氨基酸、微量元素等。
其中的重要成分——白藜芦醇具有抑制癌细胞、降低血脂、防治心血管疾病、抗氧化、延缓衰老等作用显著,被誉为继紫杉醇之后又一新的绿色抗癌药物。
1.1、虎杖药理研究
微苦,微寒.归肝、胆、肺经.功能与主治祛风利湿,散瘀定痛,止咳化痰.用于关节痹痛,湿热黄疸,经闭,癓瘕,咳嗽痰多,水火烫伤,跌扑损伤,痈肿疮毒. 用法与用量:
9~15g;
外用适量,制成煎液或油膏涂敷.
1)用于风湿痹痛可单位浸酒服或配鸡血藤、西河柳等药.用治黄疸、胆结石等症,可配合茵陈、连钱草等同用.治淋浊带下,可与萆薢、薏苡仁同用.用于瘀阻经闭症候,可配合茜草根、益母草等同用.跌打损伤、瘀阻疼痛可与当归、红花同用.用于肺热咳嗽、痰多喘咳可单味服用,也可配合黄芩、琵琶叶等药.对疮疡肿毒、毒蛇咬伤可内服,或鲜品捣烂外敷.此外,本品还有缓泻通便的作用.
1.对心血管系统有扩张心血管的作用2.保肝作用:
虎杖能抑制乙型肝炎抗原阳性,与其所含蒽醌类物质有关。
能明显增加肝胆汁分泌。
白藜芦醇对脂质过氧化有抑制作用,可抑制类脂过氧化物在肝脏的堆积,从而减轻肝损伤,起到保护肝脏的作用。
3.抗菌、抗病毒作用:
4.镇咳平喘作用:
5.对培养人脐静脉内皮细胞释放前列环素(PGI2)及形态学的影响:
6.抗肿瘤作用:
7.降血糖作用:
对糖尿病动物模型能降低其糖尿病的发生率和死亡率。
8.降血脂作用9.止血作用:
10.其它作用:
虎杖提取物有解热镇痛作用.虎杖煎剂对烫伤创面有收敛、防止感染和消炎作用.此外,一定浓度的大黄素可引起小肠肌张力增高,收缩振幅增大,增大剂量则可抑制小肠活动.
三、复合酶解法优化提取虎杖中多糖成分——白藜芦醇
下面就复合酶解法进行优化试验
虎杖中白藜芦醇通常以苷元和皂苷两种形式存在,目前通常采用碱提酸沉法、微波提取法、超声萃取法等提取白藜芦醇,却无法有效转化白藜芦醇苷,造成资源的极大浪费和生产成本的增加。
复合酶为:
纤维素酶和阿魏酸酯酶其中的阿魏酸酯酶可切断木质素和半纤维素的交联架构,有利于细胞内容物的溶出,纤维素酶则可有效地将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇。
两种酶的配合使用可大大提高虎杖中有效成分白藜芦醇的提取率。
1.1试验方法
1.1.1白藜芦醇酶法提取工艺
称取粉碎至60目的虎杖粉末样品5.0克,按料液比1:
20(克、毫升)加入水后,在不同酶添加量、酶解酸碱度、酶解温度下,酶解一定时间后加入定量的甲醇,保持恒温一定时间,降低压强,进行抽滤,离心后定容到100毫升,
1,12复合酶法提取工艺的优化
在单因素预先实验的基础上,考虑浓度等因素对后续提取的影响,选取酶添加量、酶解温度、酸碱度和时间4个因素,设计四因素三水平正交试验方案。
它的因素水平见表1
表1复合酶解法提取条件正交试验因素
水平
酶添加量(mg\g)
温度、摄氏度
酸碱度
时间
纤维素酶
阿魏酸酯酶
1
2.0
1.0
45
4.5
2
1.5
50
5.0
2.5
3
55
5.5
3.0
1.2.2白藜芦醇的测定方法
称取白藜芦醇标准品5.0mg,置于50毫升容器内,加甲醇溶解定容,摇匀,得到浓度为0.10毫克\毫升的标准液。
分别取1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00毫升置于100毫升容量瓶中,定容后在3063nm波长下分别测定其吸光值。
建立如图坐标系,得到白藜芦醇标准曲线的回归方程:
由四因素三水平正交试验可得到以下结论:
2.2酶解法提取白藜芦醇最佳工艺条件的确定
在单因素试验的基础上,设计出复合酶法提取白藜芦醇正交试验方案,试验结果为表2,方差分析见表3。
表2酶解法提取白藜芦醇正交试验结果分析
表3复合酶解法提取白藜芦醇正交试验结果方差分析表
从表2的结果可以知道,酶解工艺中决定白藜芦醇提取效果的主次因素是:
酶添加量大于酶解温度大于酶解时间大于酸碱度。
提取的最佳条件为:
固液比为1:
20(克\毫升)、复合酶添加量为3毫克\克(1.5毫克\克纤维素酶+1.5毫克\克阿魏酸酯酶)、酶解温度为50摄氏度,酸碱度为5.0,酶解时间为3小时。
表3说明,复合酶的组成对提取液效果影响较大,其余条件影响程度差异不明显。
通过正交试验最优条件组合的4次试验证实,白藜芦醇的提取率为(1.507—1.519)%。
2.3复合酶提取法与其他提取方法的对比分析
选取目前常见的虎杖中白藜芦醇的提取工艺与复合酶法提取工艺进行比较来看,它的提取条件和提取结果如表4.
表4白藜芦醇提取各种工艺效果比较
由表4明确可以看出,复合酶法提取虎杖中的多糖成分——白藜芦醇的效果明显优越于传统的直接提取法。
其根本原因还在于纤维素酶有效分解了中药材虎杖的植物细胞壁的主要成分纤维素、木质素和果胶,将他们降解为小分子物质或易于溶解的物质,大大促进了细胞壁内有效物质的释放。
而虎杖植物细胞壁中的含有大量的木质素,而木质素中的芬酸类物质如阿魏酸、对香豆酸和二局阿魏酸,它们以酯这种化合有机键方式和半纤维素支链形成致密坚实的网状交联的紧密结构,在空间结构上大大限制了纤维素酶对纤维素和半纤维素的有效降解。
但是,阿魏酸酯酶却可以有效地切断木质素和半纤维素的这种坚实的交联结构,从而有利于纤维素酶与第五的充分接触和反应,故此,复合酶法比仅适用纤维素酶的效果有了很大的提高。
四、虎杖提取物的抗氧化性的研究
虎杖提取物中的白藜芦醇具有很强的抗氧化性,可软化血管,降低血脂,清除体内的DPPH自由基清除,具有抑制癌细胞,降低化疗的不良反应等具有显著效果,被誉为继紫杉醇之后又一新的绿色抗癌药物。
但虎杖不同活性部位的提取物的抗氧化性是不完全相同的,也随浓度的不同而不同,经实验证明,虎杖不同活性部位提取物对DPPH自由基的清除作用、对羟基自由基—OH的清除作用、对ABTS自由基的清除作用随提取物的浓度的增大而增强,都呈明显的线性关系。
虎杖提取物的还原能力也随着浓度的增加而显著增强,也是线性关系。
国外对抗氧性的大小的评价方法进行了筛选,但由于不同抗氧化剂的抗氧化性的作用机理差异性不明显,因此有些方法检测起来,具有很大的局限性。
现在,我们在应用多种抗氧化性活性测定方法的基础上,采取隶属函数法对虎杖的不同部位的活性提取物进行抗氧化性进行全面的评价和鉴定。
针对三种自由基的清除拿了和还原能力用IC50的数值来计算隶属函数值。
计算结果见下表
表5五个活性部位提取物和VC抗氧化活性隶属函数值
由上表可以明确看出来,VC的抗氧化活性即还原性要明显高于其他的部位;
虎杖不同活性部位提取物除水提取物外都具有较强的抗氧化活性,,尤其是隶属于隶属函数平均值最大的是正丁醇萃取部位,所以抗氧化性最强,还原性最强,乙酸乙酯部位抗氧化活性与正丁醇部位不相上下。
氯仿部位稍微小于正丁醇部位和乙酸乙酯部位,石油醚部位隶属平均值是0.5897,说明有较强的抗氧化活性,;
水萃取部位隶属函数值虽然等于0,但并不代表五抗氧化活性,仅仅说明它的抗氧化活性在这五种活性部位中抗氧化活性相对最弱。
结论
虎杖多糖提取工艺中物质提取的工艺确定:
和其他工艺相比,提取纯度高,节约能源和资源,适合于工业化生产,虎杖不同活性部位提取物都具有很强的抗氧化活性,抗氧化活性大小依次为:
正丁醇提取物大于乙酸乙酯提取物大于氯仿提取物大于石油醚提取物大于水提取物。
参考文献:
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- 虎杖 多糖 提取 工艺 优化 氧化 研究