西罗莫司血药浓度测定方法的建立及在肝移植患者中的应用百度文Word文档下载推荐.docx

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4.1ng/mL,t1/2为（19.2ʃ11.2h,tmax为（1.8ʃ0.3h。

结论本方法快速、简便、准确,灵敏度高,重现性好,可用

于肝移植患者的西罗莫司临床药物监测。

[关键词]西罗莫司;

高效液相色谱法;

血药浓度;

肝移植

DeterminationofsirolimusinhumanwholebloodbyHPLCandtheexploratoryinlivertransplantationZHANGNing1,LHui-yi1*,DENGSa2,FANQing1（1.DepartmentofPharmacy,

TheSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116027,China;

2.DepartmentofPharmacology,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China

[Abstract]ObjectiveToestablishanHPLCmethodtodeterminetheconcentrationofsirolimusinwhole

blood．Methods

Thewhole-bloodsampleswerepretreatedbyprecipitation-extractionmethod,andsirolimuswasde-terminedbyHPLC-UV．HypersilODSC18analysiscolumn（250mmˑ4.6mm,

5μmwasused,andthetemperaturewassetat50ħ．Themobilephasewasamixtureofacetonitrile-methanol-water（7.5ʒ62.5ʒ30withaflowrateof1.2mL/min．Thedetectionwavelengthwassetat276nm．Results

Thecalibrationcurvewaslinearwithintherange2.0

50ng/mL（r=0.9997.Themeanrelativerecoverywas99.1%,andthemeanabsoluterecoverywas82.2%（n=5．Theintra-dayandtheinter-dayrelativestandarddeviationdidnotexceed3.3%and6.3%respectively．Inthefivetransplantationreceptors,Cmaxwas（12.66ʃ4.1ng/mL,t1/2was（19.2ʃ11.2h,tmaxwas（1.8ʃ0.3h．ConclusionThismethodissimple,rapid,sensitiveandsuitablefortherapeuticdrugmonitoringofsirolimus．

Keywords:

Sirolimus;

HPLC;

Plasmadrugconcentration;

Livertransplantation

西罗莫司（Sirolimus,SRL,商品名Rapamune,雷帕霉素,是一种大环内酯类免疫抑制剂,具有抗增殖、抗肿瘤及无肾毒性等特性,近年来逐渐应用于肝移植患者,使临床获得了防治肝移植术后肾功能不全、慢性排斥反应、肿瘤复发和提高移植

物长期存活的新途径[1]

。

血药浓度监测对于保证SRL免疫抑制效果和临床安全性具有重要的意义。

本文采用高效液相色谱法测定西罗莫司血药浓度,并分析此方法在肝移植患者中的合理应用。

1实验材料

1.1仪器日本岛津HPLC色谱仪（LC-20AT二

元梯度泵,

COM-20A控制模块,SPD-M20A二极管阵列检测器,

QT-330型色谱柱恒温箱（大连三杰科技发展有限公司,

wi2568529电动离心机（东仪科技有限公司,AS701KDT型超声波清洗

器（北京鸿泰顺达科技有限公司,XY-22型浓缩氮吹仪（青岛新益通有限公司,YKH-Ⅱ型液体快速混旋器（江西医疗器械厂,

AW-120型分析天平（日本岛津。

1.2药品与试剂西罗莫司对照品（纯度为98.0%,天津新美科技有限公司,32-去甲基雷帕霉素（纯度为98.0%,天津新美科技有限公司,甲醇（色谱纯,天津康巢正兴科技发展有限公司,氢氧化钠（分析纯,上海慈太龙实业有限公司,乙腈（色谱纯,天津市康巢科技开发有限公司,硫酸锌（分析纯,上海光铧科技有限公司,1-氯正丁烷（≥99.5,广州伟伯化工有限公司。

2实验方法与结果

2.1色谱条件色谱柱:

HypersilODSC18柱（250mmˑ4.6mm,5μm,大连伊利特分析仪器有限公司;

流动相:

乙腈-甲醇-水（7.5ʒ62.5ʒ30;

流速:

1.2mL/min;

紫外检测波长:

276nm;

进样量:

20μL;

柱温:

50ħ;

内标物:

32-去甲基雷帕霉

素。

在上述色谱条件下,全血中内源性杂质不影响西罗莫司与内标的分离测定,西罗莫司与内标

的保留时间分别为16.3、26.8min,空白全血、对

照品及全血样品色谱图,如图1。

2.2标准溶液配制

2.2.1西罗莫司对照品溶液配制精密称取西

罗莫司标准品1mg,

置于10mL的容量瓶中,以甲·

82·

实用药物与临床2011年第14卷第1期PracticalPharmacyAndClinicalRemedies,2011,Vol．14,No．1

醇溶解并定容,制得浓度为100μg/mL的西罗莫司标准溶液,备用

图1西罗莫司的高效液相色谱图

注:

A.空白全血;

B.对照品;

C.全血样品;

Ⅰ-SRL,Ⅱ-内标

2.2.2

内标溶液配制精密称取32-去甲基雷帕

霉素0.5mg,置于10mL容量瓶中,以甲醇溶解并定容,制成浓度为50μg/mL的内标液。

精密量取内标液1mL,置于100mL的容量瓶中,以甲醇溶

解并稀释至刻度,摇匀制得500ng/mL的内标标准溶液,备用。

2.3样品的处理精密量取全血1.0mL,置10mL具塞离心试管中,加入500ng/mL的内标溶液20μL,旋涡混合30s后,加入蛋白沉淀剂（甲醇ʒ25%ZnSO4=70ʒ302.0mL,旋涡混合30s,4500r/min离心10min,取上清液加入0.1mol/LNaOH溶液400μL,混匀15s,加入1.0mL1-氯正丁烷,水平振荡10min,4500r/min离心10min。

分离有机层,下层水相加入1.0mL

的1-氯正丁烷重复提取1次,合并有机层以N2流吹干。

残渣加入甲醇50μL旋涡混合30s。

取20μL进样,记录色谱图,以SRL峰面积（Ai与内标峰面积（As之比Y代入标准曲线,计算SRL全血浓度。

2.4标准曲线分别精密吸取不同体积的西罗莫司标准溶液,置于10mL具塞离心管中,加入精密量取的空白全血1.0mL,混匀,使其浓度分别为2.0、4.0、8.0、15.0、30.0、50.0ng/mL。

按“2.3”操作,以不同浓度西罗莫司系列溶液的Ai/As来计算Y（Y=Ai/As,以Y值为纵坐标、西罗莫司浓度C为横坐标进行线性回归。

在2.050.0ng/mL浓度范围内,血药浓度与峰面积比有良好线性关系,其回归方程为:

Y=0.1195C+0.0548（r=0.9997。

2.5回收率及精密度分别在1.0mL空白全血中加入低、中、高3种浓度的西罗莫司溶液40μL,

混匀,使其浓度分别为4.0、15.0、50.0ng/mL,按

“2.3”方法操作,将SRL峰面积与内标峰面积之比Y代入标准曲线,计算SRL全血浓度,以测得值与加入值之比计算相对回收率,分别为

101.0%、94.3%和101.9%（n=5。

另以1.0mL空白全血不加药品,按“2.3”操作,待萃取完毕后,

在有机层中加入50%甲醇配制成的相应浓度的SRL溶液1.0mL及内标标准溶液20μL,继续按“2.3”操作,以此为标准,将测定相对回收率所得浓度值与此方法所测得浓度值相比,

计算SRL绝对回收率分别为85.4%、

81.9%和79.4%（n=5。

按照测定相对回收率方法计算SRL全血浓

度,

以1d内5次测得的SRL浓度计算日内精密度,分别为3.3%、1.1%、3.1%,以1周内5次测定的SRL浓度计算日间精密度,分别为6.3%、1.4%、5.4%。

日内、日间RSD均小于10%,表明该方法精密度良好。

3

临床应用

肝移植术后患者5例,男3例,女2例,平均年龄（40.2ʃ11.5岁。

移植术后初期均采用以他克

莫司为主的抗排斥治疗方案,

其中2例患者术后1个月内肾功能减退,怀疑因药物副作用引起[2]

另外3例于术后6个月出现不能耐受的药物不良反应,如高血糖、肌肉酸痛等,换以西罗莫司为主的

抗排斥治疗方案[3]

在服用西罗莫司片达到稳态后,在一次给药间隔口服西罗莫司2mg后,于0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、16.0、24.0h测定西罗莫司全血浓度（药-时曲线如图2。

应用DAS2.0版,药物代谢动力学分析结果显示,西罗莫司Cmax为（12.66ʃ4.1ng/mL,t1/2为（19.2ʃ11.2h,tmax为（1.8ʃ0.3h。

在5例肝移植患者使用过程中,

出现总胆固醇升高2例,服用瑞舒伐他汀片（10mg,

1次/d口服1个月后总胆固醇均降至正常范围内,其他均未出现异常。

4讨论

由于测定西罗莫司血药浓度时需用全血,而全血中的血细胞及蛋白质分子,会使萃取时发生乳化现象,对色谱柱分离产生较大的影响,因此,当西罗莫司从血细胞及血浆蛋白中提取至溶剂

·

92·

时,需加入蛋白沉淀试剂,沉淀、离心,从而消除细

胞及蛋白干扰。

而液-液萃取法是被测组分从生物

基质中分离、

纯化的常用方法,它可将被测组分自大量内源性物质中选择性地萃取分离。

本实验以1-氯正丁烷为萃取液,有选择地将西罗莫司从混合液中萃取出来,然后将上层有机层（1-氯正丁烷分离,再将萃取液挥发,最后得到浓集的被测组分。

此方法简便,色谱分离效果较好,主峰易于识别,缺点在于提取物质杂质较多、回收率低,影响了其在HPLC中的应用

图2口服西罗莫司2mg后药-时曲线

国内的研究表明,

SRL治疗窗在稳态谷浓度48ng/mL范围内[4-5],而不是国外推荐应用的1015ng/mL。

在这个范围内,既能有效预防移植肝发生急性排斥反应,又能减少其毒副作用。

HPLC法测定西罗莫司的线性范围为2.050ng/mL,覆盖SRL有效浓度范围,但临床监测中发现个别血药浓度＜2.0ng/mL,超出本实验的线性范围,给临床调整给药剂量造成一些不便。

参考文献:

[1]李冠军,董桂青,金仲品．西罗莫司的研究进展[J]

．中国医疗前沿,

2008,3（2:

34-36．[2]马秋野,孙峰,武步强,等．肝移植术后他克莫司血药浓度与

尿α1微球蛋白及微量白蛋白的相关性研究[J]．中国普外

基础与临床杂志,

2006,13（3:

334-335．[3]WatsonCJ,GimsonAE,AlexanderGJ,etal．Arandomized

controlledtrialoflateconversionfromcalcineurininhibitor（CNI-basedtosirolimus-basedimmunosuppressioninliver

transplantrecipientswithimpairedrenalfunction[J]．Liver

Transpl,

2007,13:

1694-1702．[4]张晓军,傅志仁．西罗莫司在肝移植中的临床应用[J]

．肝胆胰外科杂志,

2010,22（1:

83-85．收稿日期:

2010－09－02

1.中国医科大学第一附属医院药学部,沈阳110001;

2.济南三源药业有限公司,济南250014;

3.沈阳药科大学药学院,沈阳110016*通讯作者

联苯苄唑乳膏体外经皮透过评价试验

郜琪臻1

刘

慧2,赵亚囡3,丁平田

3*

[摘要]目的

通过离体透过性试验,评估受试联苯苄唑乳膏透过安全性的大小。

方法以小型猪全皮

皮肤为模型,

应用改良的Franz立式扩散池,分别采用生理盐水、PEG400ʒ生理盐水（1ʒ2混合液为接受液,于1、2、3、4、6、8、10h定时取样,利用HPLC测定药物浓度。

结果对照联苯苄唑乳膏样品和受试样品在生理盐水接

受液的条件下,

均不能透过离体的小型猪皮肤。

在PEG400ʒ生理盐水（1ʒ2接收液条件下,有微量透过,10h的累积透过量受试联苯苄唑乳膏为（0.286ʃ0.100μg/cm2,对照联苯苄唑乳膏为（0.269ʃ0.033μg/cm2

二者经皮透过曲线基本一致。

结论

受试联苯苄唑乳膏和对照联苯苄唑乳膏在药物透过安全性大小上具有一致性。

[关键词]联苯苄唑乳膏;

体外;

透皮吸收

Studyonpercutaneouspermeabilityofbifonazolecreams

GAOQi-zhen1,LIUHui2,ZHAO

Ya-nan3,

DINGPing-tian3*

（1.DepartmentofPharmacy,TheFirstHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China;

2.JinanSanyuanPharmaceuticalCompany,Jinan250014,China;

3.ShenyangPharmaceuticalUniversi-ty,

Shenyang110016,China[Abstract]ObjectiveToevaluatethepercutaneouspermeabilityofbifonazolecreamswithminiaturepig（the

pamafragrantpigfullthicknessskinasthemodelinmodifiedfranzdiffusioncells．MethodsPhysiologicalsalineso-lutionandthePEG400ʒphysiologicalsalinesolution（1ʒ2wasusedasreceptormedium．Thedrugconcentrationinsam-pleswithdrawnat1,

2,3,4,6,8,10hwasdeterminedbyHPLC．ResultsDruginthecommercialproductandtest

preparationcouldnotdiffuseacrosstheexcisedminiaturepigskininphysiologicalsalinesolution,whilebothofthemhasverylowpermeabilityunderthePEG400ʒphysiologicalsalinesolution（1ʒ2conditions．Thecumulativepermeationamount（Q,μg/cm2ofthetestpreparationwas（0.286ʃ0.100μg/cm2,

whilethecommercialproductwas（0.269ʃ0.033μg/cm2．ConclusionThecommercialproductandthetestpreparationhadnodifferenceinpermeabilitysafe-ty,withphysiologicalsalinesolutionandPEG400ʒphysiologicalsalinesolution（1ʒ2asreceptormedium．

Bifonazolecreams;

Invitro;

Percutaneouspermeability

联苯苄唑是一种新型的氮取代性不含卤素的咪唑类局部抗真菌药,该药物抗菌谱广、抗菌活性高、皮肤渗透力强、疗效确切、作用持久、且毒性低[1]

本药能很好地透过被感染的皮肤,作用迅速且持续时间长,维持时间超过48h。

由于真菌

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