自己翻译的罗氏tunel检测细胞凋亡试剂盒说明手册.docx
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自己翻译的罗氏tunel检测细胞凋亡试剂盒说明手册
罗氏tunel检测细胞凋亡试剂盒说明书
注意:
Label溶液含有甲次砷酸盐和二氯化钴,严禁吸入和食入。
反应悬浮物收集于密闭、不易碎、有明确标识的容器中,按有毒废物处理。
试剂盒组成:
小瓶/盖子
标签
内容物
1蓝色
酶溶液
大肠杆菌重组牛胸腺末端脱氧核苷酸转移酶,在storagebuffer中
10×conc.
5×50ul
2紫色
标记溶液
在reactionbuffer中的核苷酸混合物
1×conc.
5×550ul
3黄色
转化-POD
抗荧光素抗体,绵羊Fab片段,连接有辣根过氧化物酶
Ready-to-use
3.5ml
需要自己配置的其他物品:
除上表所列试剂外,还需准备以下溶液。
下表列出每步所需物品概览:
步骤
设备
试剂
样品准备section3.2
黏附细胞,细胞涂片和细胞离心涂片准备section3.2.1
冰冻组织section3.2.2.2
Washingbuffer:
磷酸缓冲液PBS*
Blokingbuffer封闭缓冲液:
溶于甲醇的3%H2O2
Fixationsolution固定剂:
溶于PBS的4%多聚甲醛,ph7.4,新鲜配制
Permeabilisationsolution渗透溶液:
溶于0.1%柠檬酸钠的0.1%TritonX-100,新鲜配制(6)
固定剂
石蜡包埋组织section3.2.2.1
二甲苯和乙醇(浓度:
95%,90%,80%,70%,溶于双蒸水中)
Washingbuffer:
PBS*
蛋白酶K*,不含核酸酶,工作浓度:
[10-20ug/ml,溶于10mMTris/HCL中,ph7.4-8]
替代处理方案
※渗透溶液:
(0.1%Triton1)X-100,溶于0.1%柠檬酸钠的,新鲜配制
※胃蛋白酶*(0.25%-0.5%,溶于盐酸中,ph2)或胰蛋白酶*,0.01NHCL,不含核酸酶
※0.1M柠檬酸缓冲液,ph6,微波照射
标记步骤section3.3
阳性对照section3.3.1
微球菌核酸酶或
DNaseI,重组,级别1*
黏附细胞,细胞涂片和细胞离心涂片和组织section3.3.2
Parafilm石蜡封口膜或盖片
湿盒
Washingbuffer:
PBS*
Difficulttissue困难组织
塑料容器
微波
湿盒
Citratebuffer柠檬酸盐缓冲液,0.1M,ph6.0
Washingbuffer:
PBS*
Tris-HCL,0.1Mph7.5,含3%的BSA*和20%正常牛血清
信号转换section3.4
湿盒
Parafilm石蜡封口膜或盖片
Washingbuffer:
PBS*
DABMetalEnhancedSubstrateSet*DAB金属增强底物*或POD底物替代物
光镜镜检封固剂
产品概述:
特异性:
TUNEL反应优先标记凋亡产生的DNA链断裂,从而辨别凋亡与坏死、以及由抑制细胞生长的药物或放射线产生的primaryDNA链断裂
实验干扰:
假阴性:
在某些型式的凋亡细胞中DNA链断裂可能缺失或不完全。
空间位阻,如细胞外元件可能阻止TdT到达DNA断裂处。
两种情况均能产生假阴性。
假阳性:
在坏死晚期,可能产生大量的DNA片段
DNA链断裂也可能在具有高增殖和代谢活动的细胞中出现。
两种情况均能产生假阳性。
为确认细胞死亡的凋亡型式,应认真进行每种细胞的形态学检查
凋亡过程中产生的形态学改变尤其特征形式,因此,对于可以结果进行解释时,细胞形态评估是一项重要的参数
样本:
细胞离心涂片和细胞涂片
在chamberslides上培养的黏附细胞
冰冻或福尔马林固定、石蜡包埋样本
分析时间:
2-3小时,除外培养、固定和渗透
检测次数:
一个试剂盒50T
试剂盒存储/稳定性:
未开封试剂盒储存于-15~-25℃可稳定至标签上标明的效期。
试剂
储存和稳定性
TUNEL反应混合物
TUNEL反应混合物应在用前临时配制,不能储存
TUNEL反应混合物用前应置于冰上
转化-POD
一旦融化转化-POD溶液后,应储存于2-8℃(最长稳定6个月)
注意:
禁止冰冻结冰
优点:
优点
特点
灵敏
在单个细胞水平检测细胞凋亡的早期间断
特异
对坏死来说,优先标记凋亡
快速
分析时间短(2-3h)
简便
试剂稳定、优化,没有稀释步骤
灵活
适合于固定细胞核组织,允许堆积、贮存和转运样本
双染可以鉴定细胞凋亡的类型和阶段
Function-tested功能检查
对于大量的批号来说,每一批号均进行了功能检测
步骤和所需材料:
1流程图:
2样品准备
2.1黏附细胞、细胞涂片和细胞离心涂片
需准备的其他试剂:
Washingbuffer:
磷酸盐缓冲液(PBS)
Blockingbuffer封闭溶液:
甲醇稀释的3%H2O2
Fixationsolution固定溶液:
PBS配制的4%多聚甲醛,ph7.4,新鲜配制
Permeabilisationsolution渗透液:
0.1%Triton1)X-100溶于0.1%柠檬酸钠溶液中,新鲜配制
步骤:
下表描述了细胞固定、内源性过氧化物酶封闭和细胞渗透过程。
注意:
固定和渗透另外两个细胞样本用于银杏和阳性对照
步骤
操作
1
用新鲜配制的固定液固定风干的细胞样本,1h,15-25℃
2
用PBS冲洗玻片
3
用封闭液孵育,10min,15-25℃
4
用PBS冲洗玻片
5
用渗透液孵育,2min,置于冰上2-8℃
6
按3.3操作
2.2组织部分
2.2.1福尔马林-包埋组织
福尔马林包埋组织的预处理:
可按4种不同的方式预处理。
如用蛋白酶K,不含核酸酶,浓度、孵育时间和温度应按组织类型优化
注意:
只用罗氏应用科学的蛋白酶K,因其经检测不含核酸酶,核酸酶可导致假阳性。
另外3中替代方法在下表中描述(step2)
需准备的其他试剂:
二甲苯和乙醇(浓度:
95%,90%,80%,70%,溶于双蒸水中)
Washingbuffer:
PBS
蛋白酶K,不含核酸酶,工作浓度:
[10-20ug/ml,溶于10mMTris/HCL中,ph7.4-8]
替代处理方案
※渗透溶液:
0.1%Triton1)X-100,溶于0.1%柠檬酸钠的,新鲜配制
※胃蛋白酶*(0.25%-0.5%,溶于盐酸中,ph2)或胰蛋白酶*,0.01NHCL,不含核酸酶
※0.1M柠檬酸缓冲液,ph6,微波照射
步骤:
下表描述了用蛋白酶K(不含核酸酶)和3中替代方法预处理福尔马林-包埋组织的方法
注意:
加入额外的组织用于阴性和阳性对照
步骤
操作
1
按照标准操作脱蜡和再水化组织(e.g.60℃加热,二甲苯浸洗,一系列梯度酒精和双蒸水再水化
2
用蛋白酶K工作液于21-37℃中孵育15-30min
替代方法
操作
1.渗透液
孵育8min
2.胃蛋白酶或胰蛋白酶
37℃孵育15-60min
3.微波射线
将玻片置于含有200ml0.1M柠檬酸盐缓冲液,ph6.0的塑料容器中
350W微波放射5min
3
用PBS冲洗两次
4
按3.3操作
2.2.2冰冻组织处理(略)
3标记草案
3.1开始之前
准备TUNEL反应混合液:
每一对管子(小瓶1:
酶溶液,小瓶2:
标记溶液)足以用于50ul反应体系的10张片子,和2个50ul标记溶液的阴性对照。
注意:
TUNEL反应混合液应于用前临时配制,不能储存。
TUNEL反应混合液用前置于冰上
步骤
操作
1
取100ul标记溶液(小瓶2)用于阴性对照
2
加入总量50ul的酶溶液(小瓶1)于450ul的标记溶液中,以获得500ulTUNEL反应混合液
3
充分混匀
需准备的其他试剂:
微球菌核酸酶或
DNaseI,重组,级别1*
对照:
每次实验应包含两个阴性对照和一个阳性对照应
阴性对照
孵育固定和渗透的细胞于50ul/标记溶液中(无末端转移酶),替代用TUNEL反应混合液孵育
阳性对照
孵育固定和渗透的细胞于微球菌核酸酶或DNaseI,重组,级别1中(3000U/ml-3U/ml于50mMTris-HCL中,ph7.5,10mMMgCL2,1mg/mlBSA)10min,15-25℃,以诱导在标记前DNA链断裂
3.2黏附细胞、细胞涂片、细胞离心涂片和组织标记草案
需准备的其他设备和试剂:
Washingbuffer:
PBS
湿盒
Parafilm石蜡封口膜或盖片
步骤:
参考下表
步骤
操作
1
用PBS冲洗两次
2
使样品周围区域变干
3
加入50ulTUNEL反应混合液于样品上
注意:
阴性对照加入50ul标记溶液。
确保TUNEL反应混合液均匀分布于单层细胞上,避免蒸发丢失。
孵育时样品上应覆盖Parafilm石蜡封口膜或盖片
4
在湿盒、暗室中加盖孵育60min,37℃
5
用PBS冲洗3次
6
可在样品上加入1滴PBS,于荧光显微镜下观察。
激发光波长450-500nm,在515-565nm(绿色)范围类检测
3.3困难组织标记草案(略)
3.4信号转换
需要准备的其他设备和试剂:
Washingbuffer:
PBS
湿盒
Parafilm石蜡封口膜或盖片
DABA底物或POD替代底物
光镜镜检封固剂
步骤:
按照下表操作
步骤
操作
1
使样品周围区域变干
2
加入50ul转化-POD(小瓶3)于样品上
注意:
确保转化-POD溶液均匀分布于单层细胞上,避免蒸发丢失。
孵育时样品上应覆盖Parafilm石蜡封口膜或盖片
3
在湿盒中孵育30min,37℃
4
用PBS冲洗3次
5
加入50-100ulDAB底物或POD替代底物
6
于15-25℃孵育10min
7
用PBS冲洗3次
8
用玻璃盖片封固(e.g.用PBS/甘油),光镜下检查
替代方法:
光镜检查前可复染
4.附件:
4.1Troubleshooting
问题
步骤/试剂
可能原因
建议
非特异性标记
包埋组织
紫外辐射用于包埋组织的聚合(e.g.异丁烯酸盐导致DNA链断裂)
使用不同的包埋材料或不用的聚合试剂
固定
酸性固定剂(e.g.甲安菲他明,Carnoy’s
固定剂)
使用4%多聚甲醛
使用福尔马林或戊二醛
TUNEL反应
TdT浓度太高
用TUNEL稀释缓冲液1:
2至1:
10稀释TdT浓度
转化步骤
内源性POD活性
细胞渗透前,浸入3%H2O2甲醇稀释液10min,封闭内源性POD
抗-银光素-POD非特异性连接
用正常抗绵羊血清封闭
用含3%BSA的PBS封闭20min
减少转化溶液浓度50%
核酸酶
某些组织(e.g.平滑肌,组织准备后很快出现DNA断裂)
取得器官后立即固定组织
通过肝静脉灌注固定剂
某些酶仍有活性
用含有ddUTP和dATP的溶液封闭
背景高
固定
福尔马林固定导致含有黑色素前体的细胞黄染
使用甲醇固定,但同时应考虑甲醇固定可能降低灵敏度
TUNEL反应
对于乳腺癌,标记混合物浓度太高
用TUNEL稀释缓冲液使标记混合物浓度降低50%
转化步骤
内源性POD活性
细胞渗透前,浸入3%H2O2甲醇稀释液10min,封闭内源性POD
抗-银光素-POD非特异性连接
用正常抗绵羊血清封闭
用含3%BSA的PBS封闭20min
减少转化溶液浓度50%
样品
支原体污染
支原体检测试剂盒
高增殖细胞
双染,e.g.用Annexin-V-Flu
- 配套讲稿:
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